李正雄 王雅棣

肺癌是呼吸系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是導(dǎo)致全球腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占所有肺癌的85%，據(jù)報道NSCLC 患者5年生存率低于15%[2-3]。近年來，NSCLC 的診斷和治療取得了較大的進展，鉑類化療藥物已被用作中晚期患者術(shù)后的標準輔助治療方案。順鉑（cisplatin，DDP）是一種含鉑化合物，是臨床用于NSCLC 化療的一線藥物[4]。目前，由于NSCLC細胞對DDP 的化療敏感性降低導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受到較大限制并嚴重影響患者預(yù)后。因此，尋找新的途徑使NSCLC 耐藥細胞重新獲得對DDP 的化療敏感性對于改善患者的臨床療效及預(yù)后具有重要意義。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）長度超過200 個核苷酸，無蛋白質(zhì)編碼能力，但能夠在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)基因表達[5]。迄今為止，研究者們一直在努力闡明lncRNA 在各種疾病發(fā)生中的作用和機制[6]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 可以通過降低細胞生長和增加細胞凋亡而改善耐藥腫瘤細胞對DDP 的化療敏感性[7-8]。本研究前期研究發(fā)現(xiàn)，鐵蛋白重鏈1 假基因3（ferritin heavy chain 1 pseudogene 3，F(xiàn)TH1P3）在NSCLC 癌組織和細胞中高表達，并具有促進NSCLC細胞遷移和侵襲及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）的能力[9]。本研究旨在明確FTH1P3 對人肺癌DDP 耐藥細胞株（A549/DDP）DDP 化療敏感性的影響，并探究其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

A549 與A549/DDP 細胞購自美國ATCC 全球生物資源中心。FTH1P3 特異性短干擾RNA（si-FT H1P3）、陰性對照短干擾RNA（si-NC）、miR-218 抑制物、陰性對照（NC）抑制物、miR-218 模擬物、陰性對照模擬物寡核苷酸序列均購自蘇州吉瑪基因公司。野生型（wt）-FTH1P3 重組報告載體與突變型（mut）-FTH1P3 重組報告載體均購自深圳孜科科學(xué)儀器有限公司。RPMI1640 培養(yǎng)基與胎牛血清（FBS）均購自美國Gibco 公司。Opti-MEM 培養(yǎng)基及Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司。0.25%胰蛋白酶、雙抗、3-（4, 5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）與DDP 均購自美國Sigma 公司。TRIzol、PrimeScript? RT-PCR 與SYBR Premix Ex Taq 試劑均購自北京Takara 公司。膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-FITC 與碘化丙啶（PI）試劑均購自美國BioLegend 公司。半胱天冬蛋白酶3（Casp3）活性試劑與熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)均購自美國Promega 公司。RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）試劑購自美國Millipore 公司。抗人argonaute 2（Ago2）抗體與IgG 抗體均購自美國Abcam 公司。FTH1P3、多藥耐藥關(guān)聯(lián)蛋白1（multidrug resistance-associated protein 1，MRP1）、ATP 結(jié)合家族亞家族B 成員1（ATP binding cassette subfamily B member 1，ABCB1）、miR-218、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）與U6 基因特異性引物均購自美國Invitrogen 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 所有細胞采用RPMI1640培養(yǎng)基并添加10% FBS 與1%雙抗，放置在37℃含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為維持A549/DDP 細胞對DDP 的耐藥性，在細胞培養(yǎng)時添加2 μM 的DDP。為干擾FTH1P3 與miR-218 的內(nèi)源性表達，分別合成si-FTH1P3 與miR-218 抑制物，并以si-NC與NC 抑制物為陰性對照，序列信息見表1。將A549/DDP 按5×106/孔接種至6 孔板中。24 h 后，根據(jù)Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書，加入500 μL的 Opti-MEM 培養(yǎng)基將100 nM 的寡核苷酸序列瞬時轉(zhuǎn)染至細胞。6 h 后，棄去培養(yǎng)基，并重新添加新鮮RPMI1640 培養(yǎng)基。48 h 后，用0.25%胰蛋白酶消化分離細胞，收集細胞用于下一步實驗。

表1 序列信息

1.2.2 熒光定量PCR 試驗 采用TRIzol 試劑從細胞中提取總RNA。采用PrimeScript? RT-PCR 試劑將1 μg 總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在ABI 7 500 RT-PCR系統(tǒng)中采用SYBR Premix Ex Taq 試劑分析FTH1P3、MRP1、ABCB1 與miR-218 表達。引物序列信息見表2，GAPDH 作為FTH1P3、MRP1 與ABCB1 的內(nèi)參對照，U6 作為miR-218 的內(nèi)參對照。反應(yīng)條件：95℃2 min；95℃ 15 s，60℃ 45 s，40 個循環(huán)；72℃ 5 min；4℃30 min。實驗獨立重復(fù)3 次，通過2-ΔΔCt法定量分析FTH1P3、MRP1、ABCB1 與miR-218 表達。

表2 引物序列信息

1.2.3 MTT 法 采用MTT 法分析DDP 對細胞的生長抑制作用。將轉(zhuǎn)染后的A549/DDP 細胞以4×103/孔接種在96 孔板中。12 h 后，采用不同濃度的DDP（0、2、4、8、16、32 和64 μM）處理細胞1 、2 和3 d。將10 μL 的MTT（5 mg/mL）加入每個孔中，并在37℃下孵育4 h。然后加入100 μL 二甲基亞砜使晶體溶解，使用酶標儀在450 nm 下檢測各孔光密度（OD）值。實驗獨立重復(fù)3 次，半抑制濃度（IC50）代表抑制一半A549/DDP 細胞生存的DDP 濃度。

1.2.4 流式細胞術(shù) 采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。將轉(zhuǎn)染后的A549/DDP 按5×106/孔接種至6 孔板中，在37℃培養(yǎng)48 h，收集細胞。將細胞用PBS 稀釋至約1×106/mL，采用75%乙醇在4℃固定過夜。在暗室中37℃用5 μL 膜聯(lián)蛋白V-FITC 試劑染色20 min，隨后加入3 μL 的 PI 試劑染色15 min。最后，在FACScan 流式細胞儀中上樣檢測，實驗獨立重復(fù)3 次，并用CellQuest Pro 軟件分析細胞凋亡率。

1.2.5 Caspase-3 活性試驗 采用Caspase-3 活性試驗檢測細胞凋亡。收集1×106個轉(zhuǎn)染后的A549/DDP細胞，按照Caspase-3 活性試劑說明書加入裂解液裂解細胞并獲得蛋白，在37℃加入反應(yīng)緩沖液孵育30 min，加入底物孵育15 min。采用酶標儀在405 nm下檢測各孔OD 值，并計算Caspase-3 活性（實驗組OD/對照組OD×100%）。

1.2.6 Hoechst 33 258 染色試驗 采用Hoechst 33 258染色試驗觀察細胞凋亡。將轉(zhuǎn)染后的A549/DDP 細胞按7×104/孔接接種至24 孔板的細胞爬片中，在37℃培養(yǎng)48 h，取出爬片。加入1 μL 的Hoechst 33 258在37℃下染色3 min，封片并在熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞。

1.2.7 熒光素酶報告基因試驗 使用StarBase v2.0（http://starbase.sysu.edu.cn/）數(shù)據(jù)庫預(yù)測FTH1P3 轉(zhuǎn)錄本序列與miR-218 序列之間的結(jié)合位點。將A549/DDP 按3× 105/孔接種至12 孔板中，24 h 后，加入Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑瞬時共轉(zhuǎn)染500 ng wt-FTH1P3 或mut-FTH1P3 重組報告載體（表達螢火蟲熒光素酶），50 ng pRL-TK（表達海腎熒光素酶）和25 μM miR-218 抑制物與NC 抑制物或25 μM miR-218 模擬物與NC 模擬物。48 h 后，采用熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測螢火蟲與海腎熒光素酶值。以海腎熒光素酶值為參照，并計算相對熒光素酶活性（螢火蟲熒光素酶值/海腎熒光素酶值×100%）。

1.2.8 RIP 試驗 收集約106個A549/DDP 細胞，按照RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑說明書使用含有蛋白酶抑制劑和RNA 酶抑制劑的RIP 裂解液裂解細胞。將得到的細胞提取物與抗人Ago2 抗體或IgG 抗體與RIP 緩沖液一起孵育1 h，隨后經(jīng)磁珠處理。用蛋白酶K 消化蛋白質(zhì)，提取免疫沉淀的RNA 進行熒光定量PCR 并檢測FTH1P3 表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗結(jié)果表示采用±s，兩組均數(shù)之間的比較采用t檢驗，多組均數(shù)之間比較采用單因素方差分析和Tukey 檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A549/DDP 細胞中FTH1P3 表達上調(diào)而miR-218 表達下調(diào)

與A549 細胞相比，A549/DDP 細胞經(jīng)DDP 處理1、2 及3 d 后，IC50分別升高至（3.71±0.42）倍、（3.92±0.35）倍與（4.56±0.60）倍（均P＜0.01，圖1A）；A549/DDP 細胞中耐藥基因MRP1 和ABCB1 mRNA表達水平顯著增加（均P＜0.05，圖1B）；A549/DDP 細胞中FTH1P3 表達水平顯著上調(diào)（P＜0.01，圖1C），而miR-218 表達水平顯著下調(diào)（P＜0.05，圖1D）。

2.2 干擾FTH1P3 增加A549/DDP 細胞對DDP 的化療敏感性

與si-NC 相比，si-FTH1P3 轉(zhuǎn)染顯著抑制A549/DDP 細胞中FTH1P3 表達（P＜0.001，圖2A）；si-FTH 1P3 轉(zhuǎn)染A549/DDP 細胞經(jīng)DDP 處理1、2 及3 d 后，IC50分別降低至（0.73±0.15）倍、（0.55±0.19）倍及（0.48±0.06）倍（均P＜0.05，圖2B）；si-FTH1P3 轉(zhuǎn)染A549/DDP 細胞中MRP1 和ABCB1 基因mRNA 表達顯著降低（均P＜0.05，圖2C）。

2.3 干擾FTH1P3 降低A549/DDP 細胞生長能力并促進細胞凋亡

與si-NC 相比，si-FTH1P3 轉(zhuǎn)染A549/DDP 細胞1、2 及3 d 后，細胞生長能力顯著降低（P＜0.05，圖3A）。與si-NC 相比，si-FTH1P3 轉(zhuǎn)染A549/DDP細胞凋亡率（P＜0.001，圖3B）、單個視野下細胞凋亡數(shù)（P＜0.01，圖3C）及Caspase-3 活性（P＜0.05，圖3D）均顯著升高。

2.4 FTH1P3 直接結(jié)合miR-218 并抑制其表達

生物信息學(xué)分析顯示，F(xiàn)TH1P3 轉(zhuǎn)錄本中AAG CACA 序列可直接與miR-218 中UUCGUGU 序列結(jié)合（圖4A）。與NC 抑制物相比，miR-218 抑制物轉(zhuǎn)染顯著抑制A549/DDP 細胞中miR-218 表達（P＜0.05），與NC 模擬物相比，miR-218 模擬物轉(zhuǎn)染顯著促進A549/DDP 細胞中miR-218 表達（P＜0.001），見圖4B。與NC 抑制物相比，miR-218 抑制物轉(zhuǎn)染顯著增加wt-FTH1P3 重組報告載體的相對熒光素酶活性（P＜0.05），但對mut-FTH1P3 重組報告載體的相對熒光素酶活性無明顯影響P＞0.05）；與NC 模擬物相比，miR-218模擬物轉(zhuǎn)染顯著降低wt-FTH1P3 重組報告載體的相對熒光素酶活性（P＜0.05），但對mut-FTH1P3 重組報告載體的相對熒光素酶活性無明顯影響（P＞0.05），見圖4C。與抗IgG 抗體相比，抗Ago2 抗體顯著增加A549/DDP 細胞中FTH1P3 富集（P＜0.001，圖4D）。與si-NC 相比，si-FTH1P3 顯著促進A549/DDP 細胞中miR-218 表達（P＜0.05，圖4E）。

2.5 干擾miR-218 逆轉(zhuǎn)經(jīng)si-FTH1P3 處理的A549/DDP 細胞對DDP 的化療敏感性

與NC 抑制物相比，miR-218 抑制物轉(zhuǎn)染顯著降低經(jīng)si-FTH1P3 處理的A549/DDP 細胞中miR-218表達（P＜0.05，圖5A）；miR-218 抑制物轉(zhuǎn)染經(jīng)si-FTH1P3 處理的A549/DDP 細胞經(jīng)DDP 處理1 、2 及3 d 后IC50分別升高至（1.14±0.12）倍、（1.23±0.14）倍及（1.36±0.10）倍（均P＜0.05，圖5B）；miR-218 抑制物轉(zhuǎn)經(jīng)染si-FTH1P3 處理的A549/DDP 細胞中MRP1和ABCB1 基因mRNA 表達水平顯著升高（均P＜0.05，圖5C）；miR-218 抑制物轉(zhuǎn)染經(jīng)si-FTH1P3 處理的A549/DDP 細胞1、2 及3 d 后細胞生長能力顯著升高（P＜0.05，圖5D）。與NC 抑制物相比，miR-218 抑制物轉(zhuǎn)染經(jīng)si-FTH1P3 處理的A549/DDP 細胞凋亡率（圖5E）、單個視野下細胞凋亡數(shù)（圖5F）及Caspase-3活性（圖5G）均顯著降低（均P＜0.05）。

圖2 干擾FTH1P3 對A549/DDP 細胞DDP 化療敏感性的影響

圖3 干擾FTH1P3 降低A549/DDP 細胞生長能力并促進細胞凋亡

圖4 FTH1P3 對miR-218 的調(diào)控作用分析

圖5 干擾miR-218 逆轉(zhuǎn)經(jīng)si-FTH1P3 處理的A549/DDP 細胞對DDP 的化療敏感性

3 討論

目前，NSCLC 細胞對DDP 的耐藥問題日益嚴重，已成為患者臨床化療中面臨的主要障礙之一[10]。因此，如何使耐藥NSCLC 細胞重新獲得對DDP 的化療敏感性是迫切需要解決的問題。研究發(fā)現(xiàn)，部分lncRNA參與調(diào)節(jié)惡性腫瘤細胞的化療耐藥性[11]。如Long 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，長停滯特異性基因產(chǎn)物5（growth-arrestspecific 5，GAS5）通過E2F4-PARP1-MAPK 信號軸降低上皮性卵巢癌對DDP 的化療耐藥性。Ge 等[13]證實干擾FOXD2 反義鏈RNA 1（FOXD2 adjacent opp osite strand RNA 1，F(xiàn)OXD2-AS1）通過miR185-5p/SIX1軸降低NSCLC 細胞對DDP 的化療耐藥性。Yang等[14]揭示尿路上皮癌相關(guān)蛋白1（urothelial carcinoma antigen 1，UCA1）通過下調(diào)miR-513a-5p 提高視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞存活率并增強多重化療耐藥性。此外，Cheng 等[15]報道干擾HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA，HOTAIR）通過上調(diào)miR-34a 抑制PI3K/Akt 和Wnt/β-catenin 信號通路而降低胃癌細胞對DDP 的化療耐藥性。由此可見，研究lncRNA 在NSCLC 化療耐藥中的作用機制是十分必要的。

FTH1P3 是FHC 基因家族的成員之一，長度為954 個核苷酸，位于人染色體2p23.3 區(qū)域。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，F(xiàn)TH1P3 表達上調(diào)與細胞增殖和凋亡相關(guān)[16]。在子宮頸癌中，F(xiàn)TH1P3 促進HeLa 和SiHa 細胞的增殖、侵襲和遷移[17]。在口腔鱗狀細胞癌中，過表達FTH1P3 顯著促進腫瘤細胞的體外生長，而沉默F(xiàn)TH1P3 抑制細胞生長[18]。在食管鱗狀細胞癌中，干擾FTH1P3 抑制細胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力[19]。另有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TH1P3 與乳腺癌細胞對紫杉醇的耐藥性有關(guān)[20]。本課題組前期研究報道，干擾FTH1P3 抑制NSCLC 細胞的遷移和侵襲，并降低EMT，表現(xiàn)為降低N-cadherin、Vimentin 和Snail 蛋白表達，但增加E-cadherin 蛋白表達[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TH1P3 在A549/DDP 細胞表達上調(diào)。由此推測，F(xiàn)TH1P3 表達上調(diào)可能與A549/DDP 細胞的化療耐藥性有關(guān)。通過檢測干擾FTH1P3 對A549/DDP 細胞DDP 化療敏感性的影響，發(fā)現(xiàn)干擾FTH1P3 增加A549/DDP 細胞對DDP 的化療敏感性，表現(xiàn)為IC50降低，MRP1 和ABCB1 mRNA 表達降低；同時A549/DDP細胞生長能力降低、細胞凋亡增加及Caspase-3 活性升高。上述結(jié)果表明，F(xiàn)TH1P3 在A549/DDP 細胞中表達上調(diào)，F(xiàn)TH1P3 降低A549/DDP細胞對DDP 的化療敏感性。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-218 在多種腫瘤組織中表達下調(diào)，并發(fā)揮抑癌作用[21]。另有研究表明，miR-218 增加腫瘤細胞對DDP 的化療敏感性，包括食道癌、前列腺癌、乳腺癌和胃癌等[22-25]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-218 在A549/DDP 細胞表達下調(diào)，與Xie 等[26]研究結(jié)果一致。此外，干擾FTH1P3 增加A549/DDP 細胞中miR-218 表達。lncRNA 通過充當miRNA 的分子海綿而發(fā)揮調(diào)控miRNA 的作用機制[27]。如RP11-838N2.4通過充當分子海綿抑制miR-10a 增加膠質(zhì)母細胞瘤細胞對替莫唑胺的化療敏感性[28]，沉默LINC00707 通過充當分子海綿抑制miR-145 增強NSCLC 耐藥細胞對DDP 的化療敏感性[29]，由此推測FTH1P3 可能通過分子海綿方式調(diào)控miR-218 表達。熒光素酶報告基因和RIP試驗證實，F(xiàn)TH1P3 轉(zhuǎn)錄本中AAGCACA 序列可直接與miR-218 中UUCGUGU 序列結(jié)合。目前已有研究報道，沉默miR-218 增加A549/DDP 細胞對DDP 的耐藥性[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，干擾miR-218 逆轉(zhuǎn)經(jīng)si-FTH1P3 處理的A549/DDP 細胞對DDP 的化療敏感性，表現(xiàn)為IC50升高，MRP1 和ABCB1 基因mRNA表達上調(diào)，細胞生長能力升高、凋亡細胞減少及Caspase-3 活性降低。上述結(jié)果與以往報道結(jié)果一致，表明干擾miR-218 降低A549/DDP 細胞對DDP 的化療敏感性，并進一步證實FTH1P3 通過充當分子海綿下調(diào)miR-218 表達從而降低A549/DDP 細胞對DDP的化療敏感性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)FTH1P3 在A549/DDP 細胞中表達上調(diào)，F(xiàn)TH1P3 靶向miR-218 降低A549/DDP 細胞對DDP 的化療敏感性。此外，本研究存在一定的局限性。首先，僅在A549/DDP 細胞中檢測干擾FTH1P3 對A549/DDP 細胞DDP 化療敏感性的影響，未在其他NSCLC 耐藥細胞株中進行驗證。其次，F(xiàn)TH1P3 不僅局限于調(diào)控miR-218，還存在調(diào)控其他的miRNA。再者，盡管miR-218 是FTH1P3 的分子海綿，但尚未鑒定其下游靶基因。最后，尚未能在動物模型中證實本次研究結(jié)果。因此，本課題組下一步計劃將從上述各個方面繼續(xù)探究FTH1P3 對A549/DDP細胞DDP 化療敏感性的調(diào)控機制。