劉炳新, 韋霞, 肖細姬, 張琪, 張翠仙

1. 廣州中醫(yī)藥大學中藥學院, 廣東 廣州 510006;

2. 康美藥業(yè)股份有限公司, 廣東 廣州 510627

苯甲醛類化合物(圖1)廣泛分布于自然界(Li et al, 2008; 黃玉玲 等, 2012), 結構的1位為醛基取代,2位常為直鏈庚烷取代, 5位常為異戊烯基取代, 3位和6位存在羥基。當2位側鏈為直鏈時, 常與苯環(huán)形成1～3個共軛與非共軛雙鍵(圖1a), 或者與3位羥基形成呋喃(圖1b)或吡喃環(huán)(圖1c、1d)。此類物質主要來源于曲霉屬, 且具有較高的生物活性(Umeda et al, 1974; Nazar et al, 1984; Miyake et al,2010; Smetanina et al, 2007; Gao et al, 2012; Kim et al, 2014), 如抗氧化、細胞毒活性和抑菌活性, 是國內外學者們的重要研究課題。本文作者所在課題組一直在尋找海洋生物中結構新穎的次生代謝產物, 在OSMAC(One strain many compounds)和GNPS(Global Natural Product Social Molecular Networking)的共同指導下, 繼續(xù)對南海軟珊瑚共附生真菌Aspergillussp. EGF15-0-3 PDA (Potato Dextrose Agar (Medium))培養(yǎng)基次生代謝產物具有克服腫瘤活性的苯甲醛部位(濃度為 200ug·ml-1時克服腫瘤耐藥活性為56.89%)進行研究(李秀婷 等, 2016; Feng et al, 2020;Wei et al, 2020), 并分離得到9個苯甲醛類化合物(圖2)。通過核磁共振和質譜等現(xiàn)代波譜研究, 確定了這9個苯甲醛類化合物的結構為: flavoglaucin(1)、tetrahydroauroglaucin(2)、 isoaspergin (3)、isotetrahydroauroglaucin (4)、dihydroauroglaucin (5)、isodihydroauroglaucin (6)、2-(1',5'-heptadienyl)-3,6-dihydroxy-5-(3''-methyl-2''-butenyl) benzaldehyde(7)、auro-glaucin (8)和 2-(2',3-epoxy-1'-heptenyl)-6-hydroxy-5-(3''methyl-2''-butenyl) benzal-dehyde(9)。體外克服耐藥腫瘤H1975/GR細胞株的活性研究表明, 在濃度為50μg·mL-1時, 化合物3具有較弱的細胞毒活性, 抑制率62.66%; 而化合物9具有較強細胞毒活性, 抑制率為93.71%。

圖1 海洋微生物中苯甲醛類衍生物常見結構類型圖c中的R為H或OHFig.1 Common structural types of benzadehyde derivatives in marine microorganisms

圖2 來源于軟珊瑚共附生真菌Aspergillus sp.EGF15-0-3的苯甲醛類化合物化合物2～8后的Δ代表雙鍵Fig.2 The benzadehyde compounds derived from soft coral-associated symbiotic fungus Aspergillus sp. EGF15-0-3

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器: GZX-9070MBE恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司); HYG-A全溫搖瓶柜(常州市三盛儀器制造有限公司); 超凈工作臺(單人)(蘇州凈化設備廠); DZ-900振蕩器(太倉市強樂實驗設備廠); LXB75L型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器(合肥華泰醫(yī)療設備有限公司); YLD-2000烘箱(上海索譜儀器有限公司); 鞏義市予華儀器有限責任公司生產的SHZ-DIII循環(huán)水真空泵、XHDLSB-5/25低溫冷卻循環(huán)泵、XHRE-2000A旋轉蒸發(fā)儀和KQ-500DB超聲波清洗機; QuikSep高效液相色譜儀(北京慧德易科技有限責任公司); AVANCE AV400超導核磁共振儀(瑞士Bruker公司); AB SCIEX三重四級桿飛行時間串聯(lián)質譜(美國ABSciex公司); POLARTRONIC HH W5旋光儀(德國SCHMIDT+ HAENSCH公司)。

試劑: 土豆(市場購買); 葡萄糖(AR, 天津市大茂化學試劑廠); 速溶海水晶(江西鹽通科技有限公司); 甲醇、乙酸乙酯、石油醚、氯仿、正丁醇、乙酸、濃硫酸、二甲基亞砜(AR, 廣州東巨精細化工有限公司); 色譜甲醇、乙腈和乙醇(上海邁瑞爾化學技術有限公司); 開放性ODS柱層析(12nm, S-50μm,日本分光株式會社); Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(General Electrics醫(yī)療集團); 柱層析硅膠(200～300目, 青島海洋化工廠); GF254薄層層析(青島海洋化工廠)。

PDA培養(yǎng)基: 葡萄糖2.0%, 土豆200g·L-1(土豆汁用陳海水作溶劑配制), 鹽度35‰, pH自然。

1.2 微生物材料

菌種: 菌株EGF15-0-3由采集于中國南海三亞海域的軟珊瑚分離而來, 根據其形態(tài)特征和分子協(xié)議, 對rRNA基因ITS區(qū)域的DNA序列進行擴增和測序, 種屬鑒定為曲霉屬真菌Aspergillussp., 菌種樣本保存在廣州中醫(yī)藥大學中藥學院海洋微生物實驗室(編號EGF15-0-3)。

細胞株: 吉非替尼耐藥株(H1975/GR, 由暨南大學藥學院張冬梅教授提供)。

1.3 菌株EGF 15-0-3規(guī)模發(fā)酵

種子液活化: 將菌種管從冰箱取出解凍后用接種環(huán)蘸取適量的菌液, 接種到含有PDA固體培養(yǎng)基的平板上(共5塊平板), 置恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)2～3d。待平板長出單菌落后, 用接種環(huán)挑取單菌落轉移至裝有200mL PDA培養(yǎng)基的1L培養(yǎng)瓶中, 置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中28℃、165r·min-1培養(yǎng)2～3d, 獲得EGF15-0-3的種子培養(yǎng)液。

發(fā)酵: 吸取該種子液3.0mL, 分別加入裝有400mL PDA培養(yǎng)基的1L培養(yǎng)瓶中, 在28℃下靜置培養(yǎng)60d, 與空白培養(yǎng)基對比并觀察是否有明顯的菌株生長, 生長完畢停止發(fā)酵。共培養(yǎng)菌株EGF15-0-3 100L。

1.4 菌株EGF 15-0-3次生代謝產物的提取分離

提取: 培養(yǎng)基的菌株成長完畢后, 用少量甲醇滅活后停止發(fā)酵, 經紗布過濾, 得到菌絲體和發(fā)酵液兩部分。發(fā)酵液在85℃水浴條件下濃縮至10L, 依次用等體積的EtOAc和n-BuOH進行分配萃取, 各萃取3次, 分別合并EtOAc和n-BuOH后減壓濃縮,得到發(fā)酵液的EtOAc相浸膏(17.5g)及n-BuOH相浸膏(67.5g)。菌絲體用甲醇浸泡提取3次(每次3d), 所得提取液經合并及減壓濃縮后再用水涅溶, 依次用等量的EtOAc和n-BuOH進行分配萃取, 分別萃取3次, 萃取液減壓濃縮后得到菌絲體的EtOAc相浸膏(36.5g)和n-BuOH相浸膏(50.8g)。

分離: 根據TLC和LC-MS情況, 將PDA菌絲體的EtOAc相浸膏(36.5g)經硅膠柱層析, 以石油醚-乙酸乙酯體系0～100%洗脫后再用氯仿-甲醇體系0～100%梯度洗脫, TLC薄層跟蹤并合并流分得到12個不同極性的流分(標記為Fr.1～Fr.12)。通過NMR和LC-MS共同分析后, 選擇目標組流分進行下一步分離, 其中Fr.2(14.5g)經硅膠柱層析和石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫, 分離后重結晶得到化合物8(250mg)。Fr.2-2(1.5g)甲醇溶解, 經半制備 HPLC純化(Kromasil色譜柱, 5μm, 250mm×10mm)和純甲醇洗脫(6mL·min-1), 分離出8個峰, 通過與化合物8的UV對照后確定3個目標峰, 分別為peak 4(201.3mg,τR=26.82min)、peak 5(534.6mg,τR=28.38min)、peak 8(153.9mg,τR=39.08min)。peak 4進行二次半制備 HPLC 純化(ACE色譜柱,250mm×10mm C18-PFP ), 經甲醇水體系(V甲醇:V水=8:2, 3mL·min-1)洗脫后獲得化合物 3(32.2mg,τR=49.43min); peak 5進行二次半制備HPLC純化(YMC色譜柱, 250mm×10mm ), 經甲醇水體系(V甲醇:V水=8:2, 3mL·min-1)洗脫后獲得化合物4(68.2mg,τR=47.26min)和5(45.1mg,τR=50.19min); peak 8進行二次半制備 HPLC純化(YMC色譜柱,250mm×10mm ), 經甲醇水體系(V甲醇:V水=8.8:1.2,3mL·min-1)洗 脫 后 獲 得 化 合 物 9(3.8mg,τR=52.95min)。Fr.2-3(500mg)甲醇溶解, 經半制備HPLC純化(Kromasil色譜柱, 5μm, 250mm×10 mm)和甲醇水體系(V甲醇:V水=85:15, 8mL·min-1)洗脫后,依次獲得化合物1(10mg,τR=13.28min)、2(20mg,τR=20.03min)、6(10mg,τR=21.39min)和 7(7mg,τR=17.15min)。

1.5 物理常數(shù)和波譜數(shù)據

化合物1: 黃色針晶(甲醇), 分子式為C19H28O3,UV 254nm下有暗斑, 香草醛-濃H2SO4顯棕藍色,HRESIMSm/z: 303.1280[M-H]-;1H NMR(CDCl3,500MHz)δHppm: 11.9 (1H, s, 6-OH), 10.25 (1H, s,H-14), 6.89 (1H, s, H-4), 5.28 (1H, t, H-16), 4.4 (1H, s,3-OH), 3.28 (2H, d, H-15), 2.88 (2H, brt, H-7),1.76(3H, s, H-19), 1.7 (3H, s, H-18), 1.58 (2H, m,H-8), 1.39 (2H, m, H-9), 1.29 (2H, m, H-10), 1.29 (2H,m, H-11), 1.29 (2H, m, H-12), 0.88(3H, m, H-13) 和13C NMR (CDCl3,125MHz)δCppm: 14.04 (q, C-13),17.76 (q, C-18), 22.61 (t, C-12), 23.94 (t, C-7),25.77 (q, C-19), 27.01(t, C-15), 29.11(t, C-10), 29.59(t, C-9), 31.77 (t, C-11), 31.99 (t, C-8), 133.79 (s,C-17), 117.34 (s, C-1), 121.21 (d, C-16), 125.69 (d,C-4), 128.59 (s, C-2), 128.59 (s, C-5), 144.59 (s, C-3),155.82 (s, C-6), 195.52 (d, C-14).

化合物 2: 黃色塊晶(甲醇), 分子式為C19H26O3, UV 254nm下有暗斑, 香草醛-濃H2SO4顯棕藍色, HR-ESI-MSm/z: 301.1808[M-H]-;1H NMR(Pyr-d5,400MHz)δHppm: 11.18 (1H, s, 6-OH),10.41(1H, s, H-14), 7.36 (1H, s, H-4), 7.01(1H, td,H-7), 6.0 (1H, td, H-8), 5.43 (1H, t, H-16), 4.91 (1H, s,3-OH), 3.5 (2H, d, H-15), 2.24(2H, m, H-9), 1.65(3H,s, H-19), 1.62 (3H, s, H-18), 1.41 (2H, m, H-10), 1.26(2H, m, H-11), 1.26 (2H, m, H-12), 0.84(3H, m, H-13)和13C NMR(Pyr-d5,100MHz)δCppm: 14.56 (q, C-13),18.04 (q, C-18), 23.11 (t, C-12), 26.09 (q, C-19),28.04(t, C-15), 29.55(t, C-10), 32.08 (t, C-11), 34.4(t,C-9), 118.97(s, C-1), 122.6 (d, C-7), 122.71 (d, C-16),126.1(s, C-2), 127.53 (d, C-4), 129.31(s, C-5), 133.78(s, C-17), 141.52(d, C-8), 148.84(s, C-3), 154.92 (s,C-6), 198.09 (d, C-14) .

化合物3: 黃色針晶(甲醇), 分子式為C19H26O3,HR-ESI-MSm/z: 301.1808 [M-H]-(Cal. 301.1804);1H NMR (CDCl3, 400 MHz)δHppm: 11.92 (1H, s,6-OH), 10.21 (1H, s, H-14), 6.91 (1H, s, H-4), 5.45 (H,m, H-9), 5.42 (H, m, H-10), 5.28 (1H, brt, H-16), 4.5(1H, s, 3-OH), 3.3 (2H, d, H-15), 2.96 (2H, t, H-7),2.28 (2H, m, H-8), 1.95 (2H, m, H-11), 1.76(3H, s,H-18), 1.69(3H, s, H-19), 1.34 (2H, m, H-12), 0.86(3H, d, H-13) 和13C NMR (CDCl3, 100MHz)δCppm:13.8 (q, C-13), 17.9 (q, C-18), 22.6 (t, C-12), 24.4 (t,C-7), 26 (q, C-19), 27.2(t, C-15), 34.3 (t, C-11), 34.7 (t,C-8), 117.4 (s, C-1), 121.3 (d, C-16), 126 (d, C-4),127.7 (s, C-5),128.4 (d, C-9), 129 (s, C-2), 132.8 (d,C-10), 134 (s, C-17),145.2 (s, C-3), 156.0 (s, C-6),195.7 (d, C-14).

化合物4: 黃色針晶(甲醇), 分子式為C19H26O3,HRESIMSm/z: 301.1808 [M-H]-(Cal. 301.1804);1H NMR (CDCl3, 400MHz)δHppm: 11.91 (1H, s, 6-OH),10.23 (1H, s, H-14), 6.89 (1H, s, H-4), 5.4 (1H, m,H-12), 5.38 (H, m, H-11), 5.27 (1H, t, H-16), 3.49 (1H,s, 3-OH), 3.27 (2H, d, H-15), 2.88 (2H, t, H-7), 2.02(2H, q, H-10), 1.75 (3H, s, H-18), 1.69 (3H, s, H-19),1.63 (3H, m, H-13), 1.57 (2H, m, H-9), 1.45 (2H, m,H-8) 和13C NMR (CDCl3,100MHz)δCppm: 17.9 (q,C-13), 18.1 (q, C-18), 23.8 (t, C-7), 25.9 (q, C-19),27.2(t, C-15), 29.4 (t, C-9), 31.4 (t, C-8), 32.4(t, C-10),117.4 (s, C-1), 121.3 (d, C-16), 125.4(d, C-4), 125.8 (s,C-5), 128.6 (d, C-11), 128.7(s, C-2), 131.1 (d, C-12),134 (s, C-17), 145.2 (s, C-3), 155.8 (s, C-6), 195.5 (d,C-14).

化合物5: 黃色針晶(甲醇), 分子式為C19H24O3,HR-ESI-MSm/z: 299.1650 [M-H]-(Cal. 299.1647);1H NMR (CDCl3, 400MHz)δHppm: 11.77 (1H, s,6-OH), 10.08 (1H, s, H-14), 6.99 (1H, s, H-4), 6.54(1H, d, H-7), 6.43 (1H, m, H-9), 6.27 (1H, m, H-8),5.88 (1H, m, H-10), 5.29 (1H, brt, H-16), 3.49 (1H, s,3-OH), 3.32 (2H, d, H-15), 2.13 (2H, q, H-11),1.75(3H, s, H-18), 1.69(3H, s, H-19), 1.45 (2H, m,H-12), 0.94 (3H, t, H-13) 和13C NMR (CDCl3,100MHz)δCppm: 13.9 (q, C-13), 17.9 (q, C-18), 22.4(t, C-11), 25.9 (q, C-19), 27.4 (t, C-15), 35 (t, C-12),117.2 (s, C-1), 119.6 (d, C-16), 121.1 (d, C-7), 124.3(s,C-5), 125.3(d, C-4), 129.7 (d, C-9), 130.5 (s, C-2),134.1 (s, C-17), 139 (d, C-8), 140 (d, C-10), 145.32 (s,C-3), 155.4 (s, C-6), 195.4 (d, C-14.

化合物6: 黃色針晶(甲醇), 分子式為C19H24O3,UV 254nm下有暗斑, 香草醛-濃H2SO4顯棕藍色,HRESIMSm/z: 299.1650[M-H]-;1H NMR(CDCl3,500MHz)δHppm: 11.92 (1H, s, 6-OH), 10.23 (1H, s,H-14), 6.9 (1H, s, H-4), 6.08 (1H, m, H-11), 5.98(1H,m, H-9), 5.63 (1H, m, H-12), 5.55 (1H, m, H-10), 5.28(1H, m, H-16), 4.52 (1H, s, 3-OH), 3.3 (2H, d, H-15),2.98(2H, t, H-7), 2.35 (2H, dd, H-8), 1.76(3H, s, H-19),1.73 (3H, t, H-13), 1.7 (3H, s, H-18) 和13C NMR(CDCl3, 125MHz)δCppm: 15.6 (q, C-19), 17.8 (q,C-18), 18 (q, C-13), 24.2 (t, C-7), 27.2(t, C-15), 34.1(t, C-8), 117.1 (s, C-1), 121 (d, C-16), 125.4 (d, C-4),127.1 (s, C-2), 128.3 (d, C-9), 128.7 (s, C-5), 129.2 (d,C-10), 131 (d, C-12), 131.8 (d, C-11), 134 (s, C-17),145.5 (s, C-3), 155.4 (s, C-6), 195.7 (d, C-14).

化合物7: 黃色針晶(甲醇), 分子式為C19H24O3,UV 254nm下有暗斑, 香草醛-濃H2SO4顯棕藍色,HR-ESI-MSm/z: 299.1650[M-H]-;1H NMR (CDCl3,500MHz)δHppm: 11.77 (1H,s, 6-OH), 10.06 (1H, s,H-14), 7.0 (1H, s, H-4), 6.5 (1H, m, H-7), 6.5 (1H, m,H-8), 5.95 (1H, m, H-11), 5.95 (1H, m, H-12), 5.28 (H,m, H-16), 4.65 (1H, s, 3-OH), 3.47 (2H, m, H-15), 3.4(2H, m, H-10), 3.21 (2H, m, H-9), 1.76 (3H,s, H-19),1.7 (3H, s, H-18), 1.63 (3H, m, H-13) .

化合物8: 橙黃色針晶, 分子式為C19H22O3,HRESIMSm/z: 297.1499[M-H]-(cal. 299.1491);1H NMR (CDCl3, 400 MHz)δHppm: 11.79 (1H, s, 6-OH),10.08 (1H, s, H-14), 6.99 (1H, s, H-4), 6.65 (1H, d,H-7), 6.48 (1H, m, H-9), 6.33 (1H, m, H-8), 6.31 (1H,m, H-11), 6.15 (1H, m, H-10), 5.84 (1H, m, H-12),5.29 (1H, brt, H-16), 4.93(1H, s, 3-OH), 3.33 (2H, d,H-15), 1.82 (3H, d, H-13), 1.76 (3H, s, H-18), 1.7(3H,s, H-19) 和13C NMR (CDCl3,100MHz)δCppm: 17.9(q, C-18), 18.6 (q, C-13), 26 (q, C-19), 27.4(t, C-15),117.1 (s, C-1), 120.8 (d, C-16), 121 (d, C-7), 124.2(s,C-5), 134.2 (s, C-17), 125.3 (d, C-4), 129.1 (d, C-8),130.7(s, C-2), 131.4(d, C-9), 132.9(d, C-11), 136.4(d,C-12), 139.7(d, C-10), 145.2(s, C-3), 155.5 (s, C-6),196.2 (d, C-14).

化合物 9: 黃色油狀, 分子式為 C19H24O3,HRESIMSm/z: 299.1651[M-H]-(cal. 299.1641);1H NMR (CDCl3, 400MHz)δHppm: 11.67 (1H, s, 6-OH),10.24 (1H, s, H-14), 7.45 (1H, s, H-4), 6.65 (1H, s,H-7), 5.34 (1H, brt, H-16), 3.4 (2H, d, H-15), 2.78 (2H,t, H-9), 1.77 (3H, s, H-18), 1.74 (2H, m, H-10), 1.72(3H, s, H-19), 1.38 (2H, m, H-11), 1.36 (2H, m, H-12),0.91 (3H, t, H-13)和13C NMR (CDCl3,100MHz)δCppm: 14.1 (q, C-13), 17.9(q, C-18), 22.5 (t, C-12), 26(q, C-19), 27.5(t, C-10), 27.6(t, C-15), 28.8 (t, C-9),31.5 (t, C-11), 98.7(d, C-7), 110.9 (s, C-1), 119.6 (d,C-4), 121.6 (d, C-16), 125.5 (s, C-5), 128.7(s, C-2),134(s, C-17), 148.6 (s, C-3), 157.6 (s, C-8), 162.8 (s,C-6), 193.3 (d, C-14).

1.6 藥理活性試驗

MTT法: 其原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT(噻唑蘭, 溴化噻唑藍四氮唑)還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中, 而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚, 用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值, 可間接反映活細胞數(shù)量。采用96孔板法, 粗提物和單體化合物的篩藥濃度分別為200μg·mL-1和50μmol·L-1(LaKshmi et al, 2009)。耐藥腫瘤細胞株為吉非替尼耐藥肺癌腫瘤細胞株(H1975/GR)。

2 結果與討論

化合物1為黃色針晶(甲醇), 紫外燈254nm下有暗斑, 香草醛-濃H2SO4顯棕藍色。由ESI-MS給出的準分子離子峰m/z為303[M-H]-, 提示其相對分子質量為304, 結合1H和13C NMR確定其分子式為C19H28O3, 表明不飽和度為6。結合其NMR圖譜信息, 結構中含有6個C、3個CH、7個CH2和3個CH3。1H NMR譜中δH10.25(1H, s, H-14)和13C NMR譜中δC195.52(d, C-14)的信號提示結構中含有醛基;1H NMR中只顯示了一個芳香質子信號δH6.89(1H,s),δH11.9(1H, s)和4.4(1H, s)為酚羥基質子信號, 結合13C NMR信息說明結構中存在五取代苯環(huán), 為苯甲醛類化合物。1H NMR譜存在一組典型的異戊烯基片段質子信號:δH3.28(2H, d, 7.2Hz, H-15)、5.28(1H, t, 7.2Hz, H-16)、1.7(3H, s, H-18)和1.76(3H,s, H-19); 一系列質子信號:δH2.88(2H, br t, 7.2 Hz,H-7)、1.58(2H, m, H-8)、1.39(2H, m, H-9)、1.29(2H,m, H-10)、1.29(2H, m, H-11)、1.29(2H, m, H-12)和0.88(3H, m, H-13)。結合13C NMR信號δC23.94(t,C-7)、31.99(t, C-8)、29.59(t, C-9)、 29.11(t, C-10)、31.77(t, C-11)、22.61(t, C-12) 及14.04(q, C-13), 可知結構中應存在一飽和的直鏈7碳烷烴片段。進一步將數(shù)據與黃玉玲等(2012)的flavoglaucin對比, 可確定該化合物1為灰綠曲霉黃色素(flavoglaucin)。

化合物2、3和4均為黃色晶體(甲醇), 紫外燈254nm下有暗斑, 香草醛-濃H2SO4顯棕藍色, 提示為苯甲醛類化合物。三者的HR-ESI-MS分析給出的準分子離子峰m/z均為 301.1808[M-H]-(cal.301.1804), 分子式均為C19H26O3, 不飽和度為7, 互為同分異構體。同時發(fā)現(xiàn)2、3、4的分子量比1少2, 不飽和度與1比較增加1, 可推斷2、3、4只是比1多了1個雙鍵。對比化合物1～4的NMR信息, 四者高度類似, 其中2的1H NMR譜中含有異戊烯基的特征吸收信號δH5.43(1H, m, H-16)、3.50(2H, d,J=7.2Hz, H-15)、1.65(3H, s, H-19)和 1.62(3H, s,H-18);13C NMR譜中給出相應的信號為: 2 個甲基信號δC18.04(C-18)、26.09 (C-19), 1個亞甲基δC28.04(C-15), 1個sp2雜化的次甲基δC122.71(C-16)和1個sp2雜化的季碳δC133.78(C-17)。分子中庚二烯基結構片段信號δH7.01(1H, td,J=16.0Hz, H-7)和6.0(1H, td,J=2.4,16.0Hz, H-8)表明該化合物的7、8位之間為反式雙鍵; 信號δH2.24(2H, m, H-9)、1.41(2H, m, H-10)和1.26(4H, m, H-11, 12)表明該化合物的9、10位和11、12位之間都為單鍵; 信號δH0.84(3H, m, H-13)、1.26(4H, m, H-11, 12)表明化合物的12、13位為單鍵。綜合以上信息, 將化合物2與文獻曲霉素(aspergin)(Inoue et al, 1997)對比, 確定2為曲霉素(aspergin)或四氫金(色)灰綠曲霉素(tetrahydroauroglaucin)。化合物3、4與2對比, 唯一不同的是在直鏈的7碳烯烴片段中雙鍵取代的位置存在差異。將化合物3的 NMR數(shù)據與isoaspergin(黃玉玲 等, 2012)對比, 兩者基本一致, 故確定3為isoaspergin。將化合物 4 的 NMR 數(shù)據與isotetrahydroauroglaucin對比(Hamasaki et al, 1980),兩者基本一致, 故確定4為isotetrahydroauroglaucin。

化合物5、6和7均為黃色針晶(甲醇), 三者紫外燈254nm下均有暗斑, 香草醛-濃H2SO4顯棕藍色,提示為苯甲醛類化合物。三者的HR-ESI-MS分析給出的準分子離子峰m/z均為299.1650[M-H]-(cal.299.1647), 分子式均為C19H24O3, 不飽和度為8, 提示化合物5、6、7為同分異構體。其次, 3個化合物的NMR圖譜信息與化合物2、3、4高度相似, 唯一不同的是在直鏈的7碳烯烴片段中雙鍵取代的數(shù)量存在差異。化合物5的1H NMR中,δH6.54(1H, d,16.0 Hz, H-7)、6.27(1H, m, H-8)、6.43(1H, m, H-9)、5.88(1H, m, H-10)、2.13(2H, q, 8.0 Hz, H-11)、1.45(2H, m, H-12)和0.94(3H, t,J=8.0 Hz, H-13), 以及13C NMR信號中的δC121.1(d, C-7)、139.0(d,C-8)、129.7(d, C-9)、140.0(d, C-10)、22.4(t, C-11)、35.0(t, C-12)和13.9(q, C-13), 表明化合物5的7、8位和9、10位分別為雙鍵取代, 將該化合物的NMR數(shù)據與dihydroauroglaucin(Hamasaki et al, 1981)對比,兩者基本一致, 故確定化合物5為dihydroauroglaucin?；衔?、7與5對比, 唯一不同的是在直鏈的7碳烯烴片段中雙鍵取代的位置存在差異。將化合物6的數(shù)據與異二氫金(色)灰綠曲霉素(黃玉玲 等, 2012)進行比較, 兩者接近一致, 故確定化合物6為異二氫金(色)灰綠曲霉素(isodihydroauroglaucin)。將化合物 7的數(shù)據與 2-(1',5'-heptadienyl)-3,6-dihydroxy-5-(3''-methyl-2''-butenyl) benzaldehyde (Li et al, 2008)對比, 兩者接近一致, 故將化合物7的結構定為2-(1',5'-hepta-dienyl)-3, 6-dihydroxy-5-(3''-methyl-2''-butenyl) benzaldehyde。

化合物8為橙黃色針晶(甲醇), HR-ESI-MS分析給出的準分子離子峰m/z為297.1499[M-H]-(cal.299.1491), 分子式為C19H22O3, 不飽和度為9。其NMR圖譜信號與化合物5高度相似, 唯一不同的是在直鏈的7碳烯烴片段中雙鍵取代的位置存在差異?；衔?的1H NMR中, 系列質子信號為δH6.65(1H, d,J=16.0 Hz, H-7)、6.33(1H, m, H-8)、6.48(1H, m, H-9)、6.15(1H, m, H-10)、6.31(1H, m,H-11)、5.84(1H, m, H-12)和1.82(3H, d, 8.0 Hz, H-13),結合13C NMR信號中的δC121.0(d, C-7)、129.1(d,C-8)、131.4(d, C-9)、139.7(d, C-10)、132.9(d, C-11)、136.4(d, C-12)以及18.6(q, C-13), 可判斷直鏈的7碳烯烴片段為共軛三雙鍵取代。將化合物8的NMR數(shù)據與auroglaucin(Miyake et al, 2009)對比, 兩者基本一致, 故確定化合物8為auroglaucin。

化合物9為黃色油狀, HR-ESI-MS分析給出的準分子離子峰m/z為299.1651[M-H]-(cal. 299.1641),分子式為C19H24O3, 不飽和度為8。對其NMR圖譜進行分析, 發(fā)現(xiàn)該化合物也屬于苯甲醛類化合物,結構中存在一個五取代苯體系和一個異戊二烯基片段。1H NMR圖譜僅顯示烯烴質子信號δH6.65(1H, s,H-7), 除此之外無任何不飽和度信息, 說明其結構中還存在一個環(huán)。13C NMR圖譜中的烯烴信號δH98.7(d, C-7)和157.6(s, C-8), 說明其一端為連氧烯碳。根據13C NMR圖譜中給出的19個碳信號(7個C, 4個CH, 5個CH2和3個CH3), 結合1H NMR的一系列質子信號[δH2.78(2H, t, 8.0 Hz, H-9)、1.74(2H,m, H-10)、1.38(2H, m, H-11)、1.36(2H, m, H-12)和0.91(3H, t, 4.0 Hz, H-13)], 且只存在一個酚羥基質子信號[δH11.67(1H, s, 6-OH)], 可推測結構中直鏈片段的8位與苯環(huán)的3位形成了吡喃環(huán)。將化合物9的 NMR數(shù)據與 2-(2',3-epoxy-1'-heptenyl)-6-hydroxy-5-(3′′-methyl-2′′-butenyl) benzaldehyde(Li et al, 2008)對比, 兩者基本一致, 故確定化合物9為2-(2′,3-epoxy-1′-heptenyl)-6-hydroxy-5-(3′′-methyl-2′′-butenyl) benzaldehyde。

本文體外克服腫瘤耐藥活性研究的結果表明,苯甲醛部位在濃度為200ug·mL-1時, 其對吉非替尼耐藥肺癌細胞株HT1975/GR的抑制率為58.19%。而單體化合物在濃度為50μg·mL-1時, 僅化合物3和9表現(xiàn)出對吉非替尼耐藥肺癌細胞株HT1975/GR有抑制作用, 抑制率分別為62.66%和93.71%。這可能是由于化合物9的結構2位側鏈與3羥基形成的吡喃環(huán)大大地提高了其克服吉非替尼耐藥肺癌細胞株HT1975/GR的活性, 故具有一定新穎性。文獻調研表明(Inoue et al, 1997), 化合物2對產氣桿菌Enterobacter aerogenes、大腸桿菌Escherichia coli、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis具有弱的抗菌活性,且具有弱的抗腫瘤活性。此外, 化合物1、2、3、5、6、8清除DPPH自由基的IC50值分別為17.8、10.5、18.0、9.6、19.6、7.6μmol·L-1, 陽性對照VC(維生素C)的IC50值為21.0μmol·L-1(黃玉玲 等, 2012), 提示它們具有抗氧化活性, 并且如果側鏈與苯環(huán)形成共軛體系, 可能會明顯提高化合物清除自由基的活性。