鐘宛宣, 楊蕓蘭, 李祥付, 徐杰,4

1. 中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所, 熱帶海洋環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510301;

2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)海洋學(xué)院, 北京 100049;

3. 廈門大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院, 近海海洋環(huán)境科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建 廈門 361102;

4. 中國(guó)科學(xué)院南海生態(tài)環(huán)境工程創(chuàng)新研究院, 廣東 廣州 510301

弧菌(Vibrio)是一類嗜鹽、兼性異養(yǎng)的革蘭氏陰性海洋細(xì)菌, 其廣布于河口和沿海生態(tài)系統(tǒng)中(張曉華 等, 2018)。在亞洲, 弧菌引起的弧菌病(Vibriosis)是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中導(dǎo)致蝦、魚和貝類大量死亡的最常見疾病之一(Egidius, 1987; Ina-Salwany et al, 2019;Mohamad et al, 2019)。常見的致病性弧菌有鰻弧菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌和溶藻弧菌等(Mohamad et al, 2019)。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是一種條件致病性弧菌, 可危害魚類、節(jié)肢類、頭足類、棘皮類等多種水產(chǎn)動(dòng)物(黃瑞芳, 2005; 劉淇等, 2007; Lv et al, 2019; Xie et al, 2020), 且對(duì)人有致病性(Schmidt et al, 1979; Liu et al, 2015)。我國(guó)海水養(yǎng)殖產(chǎn)品需求量大, 養(yǎng)殖集約化程度高, 因此病害問(wèn)題對(duì)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)影響嚴(yán)重, 僅2019年就已造成261259.43萬(wàn)元的經(jīng)濟(jì)損失, 僅次于臺(tái)風(fēng)、洪澇、干旱等氣象因素(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局 等,2019)。投放抗生素是最常用、最高效的細(xì)菌性病害治療手段, 但由于藥物殘留和耐藥性問(wèn)題, 近年來(lái)生物防治成為備受關(guān)注的替代性方法(Pérez-Sánchez et al, 2018; Mohamad et al, 2019)。噬菌體療法利用噬菌體對(duì)細(xì)菌的裂解作用殺滅致病細(xì)菌, 可達(dá)到治療和預(yù)防水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性病害的目的(張昕 等, 2004)。噬菌體的自限性強(qiáng)、專一性程度高, 對(duì)細(xì)菌有良好殺滅作用, 同時(shí)對(duì)環(huán)境友好, 在農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖和臨床醫(yī)療中, 噬菌體是控制耐藥菌株的抗生素替代品之一(Nakai et al, 2002; Sharma et al, 2017)。

已有很多研究分離獲得了弧菌噬菌體, 并對(duì)其進(jìn)行了測(cè)序分析, 根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV; https://talk.ictvonline.org/taxonomy/)2019版分類目錄, 大多數(shù)已分離的弧菌噬菌體屬于有尾噬菌體目(Caudovirales)。部分已分離的弧菌噬菌體在治療水產(chǎn)動(dòng)物弧菌病的實(shí)驗(yàn)中取得了進(jìn)展, 如Zhang等(2015)利用噬菌體PVA1和PVA2混合制劑治療溶藻弧菌病, Chen等(2019)用5株裂解性弧菌噬菌體組成的噬菌體雞尾酒(phage cocktail)治療Litopenaeus vanname的弧菌感染, Stalin等(2017)用多株噬菌體組成的噬菌體雞尾酒控制Penaeus monodon幼體的哈維氏弧菌感染, 均能使致病細(xì)菌的載量顯著降低,提高水產(chǎn)動(dòng)物成體及幼體的存活率。這些研究表明,噬菌體治療是非常有效的治療水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的措施。Tevenvirinae類噬菌體是研究最深入的噬菌體類群之一, 可侵染埃希氏菌(Escherichia)、沙門氏菌(Salmonella)等宿主, 侵染弧菌的Tevenvirinae類噬菌體也早在1976年就被分離獲得(Zachary, 1976)。目前已分離的Tevenvirinae類弧菌噬菌體主要為Schizotequatrovirus屬, 包括噬菌體ValKK3、VH7D、φSt2、φGrn1、KVP40、φpp2和nt-1, 該類噬菌體在噬菌體治療研究中已有一定的研究基礎(chǔ)。例如,Kalatzis等(2016)向Artemia孵化池中投放的φSt2、φGrn1和餌料的混合物能夠顯著減少溶藻弧菌的數(shù)量, 降低幼體感染風(fēng)險(xiǎn), 但不徹底殺死細(xì)菌, 保留了幼體對(duì)溶藻弧菌產(chǎn)生免疫的可能, 因而有較好的應(yīng)用效果。

本文分離獲得噬菌體的主要目的是預(yù)防和治療養(yǎng)殖水產(chǎn)細(xì)菌性病害, 從水產(chǎn)動(dòng)物生存環(huán)境中分離獲得噬菌體再運(yùn)用于原位環(huán)境, 能夠在一定程度上減少人為帶來(lái)的環(huán)境影響。近海海域和海水養(yǎng)殖場(chǎng)是水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖的主要場(chǎng)所, 而水產(chǎn)市場(chǎng)是水產(chǎn)動(dòng)物的主要去處。福建省具有十分優(yōu)越的自然海洋環(huán)境和豐富的海洋資源, 是水產(chǎn)養(yǎng)殖的理想地區(qū)。因此, 本研究從福建省的近海海域、海水養(yǎng)殖場(chǎng)和水產(chǎn)市場(chǎng)采集水樣進(jìn)行噬菌體的分離實(shí)驗(yàn), 并對(duì)噬菌體的形態(tài)、宿主范圍、氯仿敏感性、潛伏期和裂解量等生理生態(tài)特性進(jìn)行鑒定, 通過(guò)基因組分析對(duì)噬菌體進(jìn)行分類, 篩查毒力基因和抗藥性基因, 評(píng)價(jià)噬菌體的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 噬菌體的分離與純化

本實(shí)驗(yàn)使用的宿主細(xì)菌Vibrio alginolyticusATCC 17749T購(gòu)買自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC), 菌株全基因組序列的GenBank保存編號(hào)為CP006718和CP006719(Liu et al, 2015)。V. alginolyticusATCC 17749T分離自腐敗海產(chǎn)品中, 可使人食物中毒, 對(duì)人和水產(chǎn)動(dòng)物都有致病性(Liu et al, 2015)。本實(shí)驗(yàn)中, 弧菌以2216E液體培養(yǎng)基和2216E固體平板(1.5%瓊脂)培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)源, 在30℃下進(jìn)行培養(yǎng)。

本實(shí)驗(yàn)采用雙層平板法從海水樣品中分離噬菌體(Lu et al, 2017)。噬菌體分離所用的水樣采集于我國(guó)近岸海域、海水養(yǎng)殖場(chǎng)和水產(chǎn)市場(chǎng)排污口, 經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌。分離實(shí)驗(yàn)前, 采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期的V. alginolyticusATCC 17749T宿主菌培養(yǎng)液與海水樣品混合培養(yǎng)1d, 以擴(kuò)大培養(yǎng)樣品中可能存在的噬菌體。所得培養(yǎng)液經(jīng)過(guò)濾除菌后, 用SM緩沖液(1L蒸餾水, 5.844g NaCl, 2.4647g MgSO4·7H2O,6.057g Tris, 0.1g Gelatin, pH=7.50, 110℃高壓滅菌30min)進(jìn)行梯度稀釋, 與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期的宿主菌培養(yǎng)液混合制備雙層平板。雙層平板在30℃下進(jìn)行培養(yǎng), 定時(shí)觀察是否有噬菌斑出現(xiàn)。待雙層平板上出現(xiàn)透明的噬菌斑后, 收集形態(tài)清晰的單個(gè)噬菌斑,放入SM緩沖液中于4℃保存。為了獲得純噬菌體,分離獲得的噬菌體需要經(jīng)過(guò)至少3次雙層平板實(shí)驗(yàn)重復(fù)分離純化。

1.2 噬菌體的擴(kuò)大培養(yǎng)與富集

將純化后的噬菌體接入到宿主菌液中擴(kuò)大培養(yǎng)至1L體系, 然后加入DNase I和RNase A處理, 采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌, 得到約1L噬菌體液。在噬菌體液中加入終濃度為10%(wt/vol)的PEG 8000,于4℃下避光靜置1～3d以聚集沉降噬菌體顆粒, 通過(guò)12000×g離心1h后收集沉淀物并重懸于約6mL的SM緩沖液中(Lu et al, 2017)。重懸后的噬菌體(豐度不小于1010PFU·mL-1)采用CsCl密度梯度超速離心法進(jìn)行離心純化(張正福 等, 1981; Lu et al, 2017),首先將樣品加入預(yù)先配置的CsCl密度梯度溶液上進(jìn)行超速離心(200000×g, 4℃, 24h), 然后取出藍(lán)色或白色的濃縮噬菌體條帶, 用30kDa超濾管透析,以去除CsCl, 最終得到高濃度的純噬菌體液。富集后的噬菌體置于4℃條件下避光保存, 用于后續(xù)噬菌體形態(tài)觀察和核酸提取等實(shí)驗(yàn)。

1.3 宿主范圍測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)選用了21株弧菌屬(Vibrio)細(xì)菌進(jìn)行宿主范圍測(cè)定, 其中9株為致病菌, 12株為海洋浮游細(xì)菌, 包括Vibrio alginolyticus、Vibrio campbellii、Vibrio parahemolyticus、Vibrio harveyi、Vibrio caribbeanicus、Vibrio fortis、Vibrio chagasii、Vibrio inhibens、Vibrio owensii、Vibrio cholerae、Vibrio variabilis等。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期的待測(cè)弧菌制成雙層平板, 然后將 10μL 無(wú)菌的高濃度(108PFU·mL-1)噬菌體液滴于凝固的雙層平板上, 于30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng), 定時(shí)觀察是否有噬菌斑出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行樣, 同時(shí)以V. alginolyticusATCC 17749T作為陽(yáng)性對(duì)照, 用SM緩沖液代替噬菌體液作為陰性對(duì)照。

1.4 氯仿敏感性實(shí)驗(yàn)

參考Yang等(2017)采用的方法, 分別取0μL、20μL、200μL氯仿與1mL純化后的噬菌體樣液(豐度為108PFU·mL-1)混合, 振蕩30s后于25℃靜置30min。離心(5000×g, 5min, 4℃)分相后取出10μL上清液, 滴于事先準(zhǔn)備好的宿主菌雙層平板上, 于30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng), 并觀察是否有噬菌斑出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行樣, 同時(shí)用SM緩沖液作為陰性對(duì)照。

1.5 形態(tài)觀察

參考Yang等(2017)的方法, 取20μL濃縮后的噬菌體滴至200目覆有碳膜的銅網(wǎng)上, 黑暗吸附10～30min后, 用1%的磷鎢酸負(fù)染色約20min, 干燥30min以上, 使用JEM 2100型透射電鏡, 在120kV電壓下對(duì)樣品進(jìn)行觀察, 圖像使用GATAN INC CCD圖像傳輸系統(tǒng)進(jìn)行采集。

1.6 一步生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)

一步生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)可以研究噬菌體的侵染和復(fù)制能力(Middelboe et al, 2010), 本文參考李自強(qiáng)(2018)的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為了提高噬菌體的可見性,本實(shí)驗(yàn)使用RO培養(yǎng)基(1L采集自廈門五緣灣的近岸海水, 加入1g酵母提取物、1g蛋白胨和1g乙酸鈉, pH=7.4～7.8; 固體培養(yǎng)基加入1.5%技術(shù)瓊脂粉,半固體培養(yǎng)基加入0.5%瓊脂粉; 110℃高壓滅菌30min)。實(shí)驗(yàn)前, 將純噬菌體豐度調(diào)整到2×106PFU·mL-1, 宿主用RO液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600=0.2。將1000μL宿主菌液與100μL噬菌體樣品混合, 黑暗靜置5min使噬菌體浸染細(xì)菌。將樣品離心(5000×g, 4℃, 4min)并用干凈的RO培養(yǎng)基洗滌沉淀兩次, 以去除游離的噬菌體, 耗時(shí)20min。樣品洗滌后立即加入100mL的RO培養(yǎng)基中搖勻, 置于搖床培養(yǎng)(160rpm, 30℃)。實(shí)驗(yàn)中每10min取樣一次, 用雙層平板法測(cè)定噬菌體豐度, 同時(shí)設(shè)置3個(gè)平行樣。

1.7 DNA提取與測(cè)序

本研究用酚-氯仿抽提法提取噬菌體純株的DNA(Yang et al, 2017), 具體步驟如下: 向富集后的高濃度噬菌體懸液中分別添加蛋白酶K溶液、SDS溶液和EDTA溶液, 于55℃恒溫水浴中消化3h; 先后用等體積的苯酚-氯仿-異戊醇(25:24:l)核酸提取液、等體積的氯仿-異戊醇混合液(24:1)去除樣品中的蛋白等雜質(zhì); 加入等體積異丙醇液體混勻, -20℃靜置至少1h后再次離心(12000×g, 4℃, 5min), 收集所得噬菌體核酸沉淀, 用事先預(yù)冷的70%乙醇溶液沖洗沉淀兩次并風(fēng)干; 將該核酸沉淀溶解于100μL的TE緩沖液中(10mmol·L-1Tris-HCl, 1mmol·L-1EDTA, pH=8.0), 置于-20℃保存。

噬菌體全基因組測(cè)序由(中國(guó))上海翰宇生物科技有限公司完成。測(cè)序文庫(kù)由NEBNext?UltraTMDNA文庫(kù)制備試劑盒構(gòu)建, 使用Illumina HiSeq 4000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。采用Trimmomatic v0.32和Velvet v1.2.03軟件分析原始數(shù)據(jù)和組裝基因組(Zerbino et al, 2008; Bolger et al, 2014)。

1.8 基因組和系統(tǒng)發(fā)育分析

噬菌體基因組由GeneMarkS (http://exon.gatech.edu/GeneMark/index.html)在線軟件和ORF Finder在線軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)進(jìn)行開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)預(yù)測(cè)。根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov)非冗余(Non-Redundant, NR)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的 protein-protein BLAST(Blastp)搜索算法, 以E-value≤10-5為閾值, 對(duì)每個(gè)翻譯后的ORF進(jìn)行搜索比對(duì), 根據(jù)得到的同源基因編碼的蛋白功能對(duì)ORF進(jìn)行注釋和功能預(yù)測(cè)。采用tRNAscan-SE v.2.0在線軟件(http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/)識(shí)別基因組中的tRNA編碼序列(Lowe et al, 2016)。此外, 本文利用致病菌毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)(Virulence Factor Database, VFDB; http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm)和綜合抗生素耐藥性數(shù)據(jù)庫(kù)(Comprehensive Antibiotic Resistance Database, CARD; https://card.mcmaster.ca/analyze/rgi)檢測(cè)噬菌體的毒力基因和抗藥性基因(Chen et al, 2005; Alcock et al, 2020)。由于DNA聚合酶是重要的功能蛋白, 在噬菌體基因序列中具有較高保守度, 因此本文不僅利用噬菌體全基因組構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹, 同時(shí)也采用DNA聚合酶研究噬菌體基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。采用MEGA 6.0軟件, 用最大似然法構(gòu)建全基因組和DNA聚合酶基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹, bootstrap檢驗(yàn)1000次。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果, 參考ICTV的2019版分類目錄對(duì)噬菌體進(jìn)行分類。比較基因分析采用Blast 2.7.1+和Easyfig 2.2.3進(jìn)行。

本文分離獲得的噬菌體vB_ValM_R10Z和vB_ValM_R11Z的基因組信息已提交至NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù), 序列號(hào)分別為MT612988和MT612989。

1.9 噬菌體環(huán)境分布分析

為了了解弧菌噬菌體在水體環(huán)境中的分布情況,本文將噬菌體的氨基酸序列在太平洋宏基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(Pacific Ocean Viromes, POV)和全球海洋調(diào)查數(shù)據(jù)庫(kù)(Global Ocean Sampling, GOS)中進(jìn)行同源序列搜索。采用tBlastn比對(duì)方法, 設(shè)置比對(duì)閾值為E-value≤10-5, 保留比對(duì)得分≥40且氨基酸長(zhǎng)度≥30aa的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體分離與鑒定

在本文的噬菌體分離實(shí)驗(yàn)中, 我們成功分離得到兩株巨型噬菌體, 分別為vB_ValM_R10Z(以下簡(jiǎn)稱為R10Z)和vB_ValM_R11Z(以下簡(jiǎn)稱為R11Z)。兩株噬菌體的分離地點(diǎn)為福建省漳州市東山島, 其中R10Z分離自2018年10月采集的對(duì)蝦養(yǎng)殖水樣,R11Z分離自2019年5月采集的水產(chǎn)市場(chǎng)水樣。經(jīng)過(guò)雙層平板培養(yǎng)12～24h后, 兩株噬菌體均可在雙層平板上形成清晰透明空斑, 兩者產(chǎn)生的噬菌斑形態(tài)相似, 直徑約0.6mm, 空斑外有1mm寬的淡白色圓環(huán)(圖1a、1b)。R10Z形成的單個(gè)噬菌斑中具侵染活性的噬菌體約104個(gè), R11Z約106個(gè), 表明噬菌體R11Z比R10Z具有更高的侵染活性。

圖1 噬菌體vB_ValM_R10Z和vB_ValM_R11Z的噬菌斑形態(tài)圖與電鏡形態(tài)圖a. vB_ValM_R10Z的噬菌斑形態(tài)圖; b. vB_ValM_R11Z的噬菌斑形態(tài)圖; c. vB_ValM_R10Z的電鏡形態(tài)圖; d. vB_ValM_R11Z的電鏡形態(tài)圖Fig.1 Phage plaques on double-layer plate and morphology in transmission electron microscopy of phages vB_ValM_R10Z and vB_ValM_R11Za. Phage plaques of vB_ValM_R10Z; b. phage plaques of vB_ValM_R11Z; c. transmission electron microscopy images of vB_ValM_R10Z; d. transmission electron microscopy images of vB_ValM_R11Z

透射電鏡照片顯示, 噬菌體R10Z和R11Z在形態(tài)及大小上相似, 具有縱向拉長(zhǎng)的二十面體頭部,延縱軸中心對(duì)稱, 擁有可伸縮的尾部結(jié)構(gòu), 可見若干尾絲, 屬于肌尾噬菌體(圖1c、1d)。兩株噬菌體頭部長(zhǎng)度約為147±1nm, 頭部寬度約為79±2nm, 尾長(zhǎng)約為117±3nm。氯仿敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩株噬菌體均對(duì)氯仿不敏感, 說(shuō)明其外層衣殼和衣殼周圍不含脂質(zhì), 符合有尾噬菌體目的特征(馮書章 等,2007), 并且電鏡圖像中未見脂膜結(jié)構(gòu)也驗(yàn)證了這一結(jié)果。此外, 在噬菌體顆粒頭部的頂端, 可以看到模糊的短絲狀結(jié)構(gòu), 這一結(jié)構(gòu)在噬菌體φSt2和φGrn1中也有發(fā)現(xiàn)(Kalatzis et al, 2016)。

2.2 宿主范圍

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 噬菌體R10Z和R11Z具有一致的宿主范圍(表1)。除了實(shí)驗(yàn)宿主V. alginolyticusATCC 17749T外, 兩株噬菌體均能感染海洋浮游細(xì)菌V. owensiiJL3186, 但不能感染另一株溶藻弧菌V.alginolyticusJL2674和其他實(shí)驗(yàn)菌株。兩株噬菌體可侵染至少一種弧菌, 但不能侵染同種弧菌的所有株系, 這種現(xiàn)象在弧菌噬菌體中較常見。此外,R10Z、R11Z和φpp2都能夠侵染V. alginolyticusATCC 17749T, 但只有φpp2能夠侵染V. parahaemolyticusATCC 17802T(Lin et al, 2012)。

表1 噬菌體vB_ValM_R10Z和vB_ValM_R11Z的裂解譜Tab. 1 The host ranges of vB_ValM_R10Z and vB_ValM_R11Z

2.3 一步生長(zhǎng)曲線

對(duì)兩株噬菌體分別進(jìn)行了一步生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖2所示。兩株噬菌體都有顯著的潛伏期、爆發(fā)期和平臺(tái)期, 爆發(fā)期噬菌體豐度呈S型增長(zhǎng),增長(zhǎng)速度快。噬菌體R10Z的潛伏期為20min, 裂解量為45PFU·cell-1, 于第50min進(jìn)入平臺(tái)期; 噬菌體R11Z的潛伏期為20min, 裂解量為114PFU·cell-1,于第40min進(jìn)入平臺(tái)期。兩株噬菌體潛伏期大致相同, 都在40～50min時(shí)達(dá)到平臺(tái)期, 但R11Z的裂解量顯著大于R10Z, 說(shuō)明R11Z的復(fù)制能力優(yōu)于R10Z。若兩種噬菌體侵染復(fù)制一輪均用時(shí)1h, 裂解量始終差2.5倍(114/45≈2.5), 以及無(wú)其他生長(zhǎng)限制條件時(shí), 噬菌體復(fù)制5～6輪后, 兩者的豐度差異即可達(dá)到兩個(gè)數(shù)量級(jí)(2.5?6≈97.7), 這就是R11Z產(chǎn)生的單個(gè)噬菌斑中含有的噬菌體數(shù)量遠(yuǎn)大于R10Z的原因。

圖2 噬菌體vB_ValM_R10Z和vB_ValM_R11Z的一步生長(zhǎng)曲線圖兩株噬菌體分別進(jìn)行生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn), 同時(shí)測(cè)試3個(gè)平行樣品并取平均值, 誤差線表示3個(gè)平行樣品的標(biāo)準(zhǔn)差Fig.2 One-step growth curves of phages vB_ValM_R10Z and vB_ValM_R11ZTwo phages were tested separately. Three parallel samples were tested at the same time, and the mean value was taken. The error bar represents the standard deviation of the parallel samples

2.4 基因組和系統(tǒng)發(fā)育分析

弧菌噬菌體R10Z和R11Z都具有線性的雙鏈DNA, 總長(zhǎng)度分別為247167bp和246831bp, G+C含量分別是41.30%和41.33%。通過(guò)GeneMarkS預(yù)測(cè)R10Z和R11Z的基因組, 分別得到386個(gè)和385個(gè)開放閱讀框(ORF), 預(yù)測(cè)得到的全部ORF均能在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中找到同源基因(圖3)。噬菌體R10Z和R11Z分別有111個(gè)ORF(28.8%)和110個(gè)ORF(28.6%)的功能得到識(shí)別, 其中110個(gè)注釋為具有功能的基因?qū)賰烧咚灿?。在共有?10個(gè)已知功能基因中, 約50%是與DNA復(fù)制、代謝和轉(zhuǎn)錄功能相關(guān)的基因, 如 DNA helicase、DNA methyltransferase、DNA polymerase、RNA ligase、thymidylate synthase、ribonucleoside-diphosphate reductase等基因; 有30%的基因與結(jié)構(gòu)和組裝相關(guān),包括large/small terminase protein、capsid protein、neck protein、baseplate structural protein、tail tube protein、tail fiber等基因; 有2個(gè)與裂解相關(guān)的基因,分別是protein rIIA和protein rIIB; 同時(shí), 噬菌體R10Z和R11Z基因組中存在一些與宿主代謝相關(guān)的輔助代謝基因, 如噬菌體攜帶的phoH基因能夠在磷限制環(huán)境下增強(qiáng)宿主對(duì)于磷酸鹽的吸收,que(包括QueC、QueD、QueE、QueF和folE)基因可能通過(guò)修飾噬菌體DNA以避免受到宿主限制性內(nèi)切酶的影響, 或通過(guò)修飾tRNA調(diào)整宿主蛋白的合成以提高翻譯效率(Sullivan et al, 2010; Crummett et al,2016; Hutinet et al, 2019)。噬菌體R10Z具有4個(gè)特有的ORF, 其中3個(gè)ORF被注釋為未知功能的假設(shè)蛋白(vB_ValM_R10Z_325、vB_ValM_R10Z_337和vB_ValM_R10Z_384), 另一個(gè)被注釋為 Seg-like homing endonuclease(vB_ValM_R10Z_92)。Seg-like homing endonuclease(Seg-HE)隸屬于GIY-YIG域,與φSt2(GenBank: KT919973)的同源基因相似度超過(guò)98%, 與其他同源基因相似度則低于50%。噬菌體R11Z有3個(gè)特有的ORF, 其中2個(gè)ORF(vB_ValM_R11Z_79和vB_ValM_R11Z_84)被注釋為假設(shè)蛋白, 另一個(gè)ORF(vB_ValM_R11Z_381)被預(yù)測(cè)為GIY-YIG保守域的未知功能蛋白, 其同源基因在噬菌體中均被注釋為假設(shè)蛋白(相似度高達(dá)94%), 而在宿主中則被注釋為 GIY-YIG nuclease family protein(相似度低于40%)。通過(guò)tRNAscan-SE識(shí)別出噬菌體R10Z和R11Z基因組中都具有31個(gè)編碼tRNA的基因, 分別分布在基因組的164151～172242bp和163682～171440bp序列范圍內(nèi), 對(duì)應(yīng)了全部的20種氨基酸(表2)?；【〉谋l(fā)和弧菌的致病能力都與毒力基因有關(guān), 此外存在抗藥性基因會(huì)給其他弧菌病害治療手段帶來(lái)困難, 因此噬菌體編碼的毒力基因和抗藥性基因可能會(huì)增加宿主的致病性和耐藥能力(Kalatzis et al, 2018; Mohamad et al,2019)。利用VFDB和CARD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì), 噬菌體R10Z和R11Z基因組中既未發(fā)現(xiàn)毒力因子, 也未發(fā)現(xiàn)耐藥性基因, 這有利于噬菌體的應(yīng)用。

表2 噬菌體vB_ValM_R10Z和vB_ValM_R11Z的tRNA基因Tab. 2 tRNA genes of phages vB_ValM_R10Z and vB_ValM_R11Z

續(xù)表

圖3 Schizotequatrovirus(屬)噬菌體的比較基因組分析本圖采用Easyfig 2.2.3繪制; 紅色箭頭表示ORF, 深灰色連線表示相似度較高, 淺灰色連線表示相似度較低, 白色表示不相似Fig.3 Genomic comparison of genus Schizotequatrovirus Drawn with EasyFig 2.2.3; ORFs are indicated by arrows; the dark gray vertical blocks represent close similarity whereas the light gray areas show low similarity and white areas do not show any similarity

根據(jù)全基因組構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示, 噬菌體R10Z和R11Z具有十分相近的親源關(guān)系, 并與噬菌體ValKK3聚為一類(圖4a)。噬菌體的全基因組核酸序列比對(duì)結(jié)果顯示, R10Z和R11Z的基因組相似度高達(dá)99.45%, 兩者與噬菌體ValKK3的相似度分別為98.29%和98.44%。基于DNA polymerase的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示, 噬菌體R10Z和R11Z與ValKK3、VH7D、φSt2、φGrn1、KVP40、φpp2、nt-1聚在同一分支(圖4b)。根據(jù)ICTV發(fā)布的2019版分類目錄, 該分支噬菌體屬于Myoviridae(科),Tevenvirinae(亞科),Schizotequatrovirus(屬), 該屬噬菌體的詳細(xì)信息見表3。噬菌體R10Z和R11Z與同屬噬菌體ValKK3、VH7D、φSt2和φGrn1的相似度達(dá)到96%～98%, 與KVP40、φpp2和nt-1的相似度相對(duì)較低, 約為86%(圖3)。

2.5 環(huán)境分布

將噬菌體R10Z和R11Z的ORF在POV和GOS數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)搜索, 結(jié)果顯示R10Z和R11Z的同源基因在海洋環(huán)境中分布非常廣泛(圖5)。噬菌體R10Z在GOS近岸、河口和外海環(huán)境中分別找到同源基因114個(gè)(29.53%)、99個(gè)(25.64%)和95個(gè)(24.61%), 相似度范圍分別為 20.35%～75.93%、20.95%～65.30%和20.35%～73.33%; 在POV近岸、河口和外海環(huán)境中同源基因的比例分別約為30.05% (相似度為22.00%～83.33%)、21.24% (相似度為 23.58%～77.51%)和 25.38% (相 似 度 為22.84%～82.82%)。基于噬菌體R11Z和噬菌體R10Z在基因組水平上具有高度的相似性, 兩者在POV和GOS不同環(huán)境中具有一致的分布規(guī)律。

圖5 噬菌體vB_ValM_R10Z和vB_ValM_R11Z的ORF在POV和GOS數(shù)據(jù)庫(kù)中的分布Fig.5 Prevalences of vB_ValM_R10Z ORFs and vB_ValM_R11Z ORFs in the environmental viral metagenomic databases of POV and GOS

3 討論與結(jié)論

為獲取可用于海水養(yǎng)殖中防治弧菌病害的生物殺菌劑, 本研究分別從福建省東山縣的對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)與水產(chǎn)市場(chǎng)廢水環(huán)境中分離獲得了噬菌體vB_ValM_R10Z和vB_ValM_R11Z。其中, 噬菌體R10Z分離自2018年10月采集的養(yǎng)殖場(chǎng)水樣, R11Z分離自2019年5月采集的水產(chǎn)市場(chǎng)污水, 兩者的分離地點(diǎn)較近。系統(tǒng)發(fā)育分析表明, R10Z和R11Z具有相近的親緣關(guān)系, 屬于Tevenvirinae(亞科),Schizotequatrovirus(屬)。通常認(rèn)為基因組超過(guò)200kbp的噬菌體即為巨型噬菌體(jumbo phage), 本研究分離的兩株噬菌體基因組大小近250kbp, 已報(bào)道的Schizotequatrovirus噬菌體的基因組大小均在250kbp左右(表3), 符合巨型噬菌體特征, 因而均屬于巨型噬菌體(Yuan et al, 2017)。

R10Z和R11Z都擁有31個(gè)編碼tRNA的基因,對(duì)應(yīng)了全部的氨基酸類型, 同屬的其他噬菌體也至少有28個(gè)tRNA基因(表3), 說(shuō)明tRNA數(shù)量多是Schizotequatrovirus噬菌體的共同特征, 有利于提高噬菌體特異性基因的翻譯效率(Kiljunen et al,2005)。在兩株噬菌體已知功能的共有基因中, 高達(dá)50%的基因與DNA復(fù)制、代謝和轉(zhuǎn)錄功能相關(guān), 其編碼的蛋白質(zhì)可以替代宿主部分蛋白的功能, 有利于提高噬菌體的復(fù)制效率(O'Donnell et al, 2013)。此外, 噬菌體通常會(huì)保留對(duì)自己生存有益的基因, 雖然兩株噬菌體中出現(xiàn)的輔助代謝基因不直接參與復(fù)制過(guò)程, 但其對(duì)宿主代謝系統(tǒng)的改造顯然是有利的,能夠幫助宿主獲取更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供其使用(Skliros et al, 2016; Al-Shayeb et al, 2020)。這些特性使得R10Z和R11Z等Schizotequatrovirus類群巨型噬菌體能更少地依賴宿主的代謝體系和擁有更強(qiáng)的復(fù)制能力, 從而有利于噬菌體的裂解性感染(Wilson,1973; Yuan et al, 2017)。

表3 Schizotequatrovirus噬菌體的對(duì)比Tab. 3 Comparison of Schizotequatrovirusphages

續(xù)表

盡管兩株噬菌體具有高度相似的形態(tài)和基因組,但兩者的復(fù)制能力有明顯的差異, 一步生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示兩者的裂解量相差2.5倍。類似的現(xiàn)象在其他研究中也有報(bào)道(Liu et al, 2014; Kalatzis et al,2016)。例如, Kalatzis等(2016)分離的兩株噬菌體φSt2和φGrn1基因相似度為98.57%, 裂解量則相差兩倍; Liu等(2014)分離的兩株短尾噬菌體基因相似度為99.99%, 裂解量卻相差7倍, 其中噬菌體φ318的裂解量為72PFU·cell-1, 而φAs51的裂解量?jī)H為10PFU·cell-1, 這是由關(guān)鍵堿基的突變?cè)斐闪藘烧邚?fù)制能力的差異。本文推測(cè), 噬菌體R10Z和R11Z的HE基因差異是導(dǎo)致兩者復(fù)制能力明顯不同的原因。噬菌體R10Z和R11Z的基因組具有高度相似性, 僅有少數(shù)基因(分別具有4個(gè)和3個(gè))為各自特有。噬菌體R10Z的特有基因Seg-HE隸屬于GIY-YIG保守域, 與噬菌體R11Z中的特有基因GIY-YIG 域的覆蓋度僅為 26%, 相似度只有22.22%。Seg-HE分布在許多Tevenvirinae噬菌體及其部分宿主的基因組中, HE在原核生物中有修復(fù)受損DNA的作用, 噬菌體基因組中HE能夠裂解并利用宿主DNA以用于自身DNA的復(fù)制(Mak et al,2010)。也有研究指出, HE基因能夠在宿主和噬菌體之間轉(zhuǎn)移, 可將其復(fù)制到缺乏HE基因的同源位點(diǎn)(Zeng et al, 2009; Skliros et al, 2016)。本文進(jìn)一步推測(cè), HE的水平基因轉(zhuǎn)移作用可能是噬菌體R10Z和R11Z中GIY-YIG域存在差異的原因。HE可能會(huì)使抗藥性基因在宿主中轉(zhuǎn)移擴(kuò)散, 然而已報(bào)道的Schizotequatrovirus類噬菌體基因組中均未發(fā)現(xiàn)毒力基因和抗藥性基因(表3)。因此, 噬菌體基因組中雖然存在HE等轉(zhuǎn)座因子, 但對(duì)此類噬菌體在水產(chǎn)病害防治中的應(yīng)用尚不構(gòu)成威脅。

在噬菌體R10Z和R11Z的電鏡照片中, 可見噬菌體顆粒頭部頂端有成簇的短絲狀結(jié)構(gòu),Schizotequatrovirus類噬菌體φSt2和φGrn1中也有出現(xiàn)(Kalatzis et al, 2016), 但這一結(jié)構(gòu)在已有的Tevenvirinae類噬菌體中未見深入研究。對(duì)侵染Caulobacter crescentus的長(zhǎng)尾噬菌體φCb13和φCbK頭部絲狀結(jié)構(gòu)的研究則較為完善, 研究認(rèn)為噬菌體在侵染過(guò)程的前期, 為了吸附具有較強(qiáng)運(yùn)動(dòng)能力的宿主菌, 利用該絲狀結(jié)構(gòu)在宿主表面起固定作用(Guerrero-Ferreira et al, 2011)。但兩類噬菌體差異較大, φCb13和 φCbK 的頭部絲狀物較長(zhǎng),Schizotequatrovirus類噬菌體的絲狀結(jié)構(gòu)短而密集,其功能不一定相同。

本研究分離獲得的Schizotequatrovirus類巨型噬菌體R10Z和R11Z的形態(tài)和基因相似度高, 均能跨種侵染細(xì)菌, 自我增殖能力強(qiáng), 裂解宿主的時(shí)間短,是強(qiáng)有力的生物殺菌物質(zhì)。兩株噬菌體的基因組中均未檢出毒力基因, 故噬菌體感染造成病害弧菌致病性增強(qiáng)的可能性較低; 此外也未檢出抗藥性基因, 因而投放噬菌體制劑不會(huì)造成養(yǎng)殖環(huán)境和周圍水體生態(tài)環(huán)境的抗藥性基因污染, 不會(huì)增大病害治理難度。噬菌體R10Z和R11Z的生理性狀優(yōu)良, 無(wú)毒害, 具有作為水產(chǎn)弧菌病生物防治藥物的研發(fā)潛力。