李強 任慧萌 朱濤 李偉延 白柳

1. 濟南市人民醫(yī)院手足外科，山東 濟南 250000

2. 濟南市人民醫(yī)院麻醉科，山東 濟南 250000

3. 盤錦職業(yè)技術(shù)學院醫(yī)療護理分院，遼寧 盤錦 124000

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是指絕經(jīng)期后女性卵巢功能衰退，雌激素水平下降，骨代謝失衡，導致骨量減少，骨強度降低，骨結(jié)構(gòu)退變，骨脆性增加為特征的全身性骨骼疾病[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)細胞因子影響PMOP的發(fā)生和發(fā)展，細胞因子可通過影響骨細胞的分化、增殖、凋亡，從而影響骨重建過程[3]。葛根素(puerarin，Pue)屬于植物雌激素，可以產(chǎn)生類雌激素樣活性，促進成骨細胞增殖，抑制破骨細胞分化，改善骨代謝，增加骨量骨密度，減少骨吸收，促進骨形成[4]。本研究通過觀察葛根素對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠細胞因子和骨代謝指標的影響，探討其對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松細胞因子及骨礦化、骨吸收和骨形成的調(diào)節(jié)作用，為中草藥防治骨質(zhì)疏松的臨床應用提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

SPF級雌性Wistar大鼠46只，13周齡，未孕，體重230～260 g(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SYXK(京)2019-0005)。飼養(yǎng)于盤錦職業(yè)技術(shù)學院動物實驗室。苯甲酸雌二醇(100 μg/支，國藥準字：H20053392，浙江仙琚制藥股份有限公司)，葛根素注射液(2 mL：100 mg/支，國藥準字：H20044953，廣東新峰藥業(yè)股份有限公司)。血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、白介素-6(IL-6)和白介素-1(IL-1)、血清鈣(Ca)、磷(P)和堿性磷酸酶(ALP)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所，Ⅰ型膠原C端交聯(lián)肽(CTX)、血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)、Ⅰ型原膠原N端前肽(PINP)、骨鈣素(BGP)、I型膠原羧基末端肽(ICIP)試劑盒購于瑞士羅氏公司，Lunari DXA型雙能X射線骨密度檢測儀購于美國GE公司。

1.2 方法

1.2.1構(gòu)建骨質(zhì)疏松大鼠動物模型：參照文獻“雙側(cè)卵巢摘除手術(shù)”構(gòu)建骨質(zhì)疏松大鼠動物模型[5]，嚴格無菌操作于大鼠背部正中線做長約3 cm縱向切口，鈍性分離，逐層進入腹腔，找到粉紅色菜花狀卵巢，結(jié)扎輸卵管，切除卵巢并止血，相同操作切除對側(cè)卵巢，徹底止血后間斷縫合，青霉素5萬U/d預防感染治療3 d，1周后拆線。假手術(shù)組不切除卵巢，僅在卵巢周圍切除等量脂肪組織，其他操作步驟相同。術(shù)后所有大鼠均在同等條件下單籠飼養(yǎng)。

1.2.2分組及藥物處理：造模評價標準：造模8周后骨密度(BMD)峰值減少≥2.5 SD(標準差)。SD大鼠造模成功40只，造模成功率為83%。按隨機數(shù)字法分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(OVX組)、雌二醇組(OVX+E2組)、葛根素組(OVX+PUE組)。造模成功后第2天給予不同藥物干預，參考《藥理實驗方法學》：人與動物體表面積等效劑量比值，換算成大鼠的給藥劑量[6]。Sham組和OVX組：皮下注射0.9% Nacl 5 mL/kg，1次/d；OVX+PUE組：皮下注射葛根素35 mg/kg，1次/d；OVX+E2組：皮下注射雌二醇150 μg/kg，1次/2 d，連續(xù)給藥8周。

1.2.3標本取材：試驗結(jié)束后10%水合氯醛腹腔注射麻醉，股動脈取血，4 ℃，3 000 r/min，離心5 min，分離血清，-20 ℃保存待測。解剖雙側(cè)股骨，0.9% Nacl沖洗，無菌生理鹽水濕紗布包裹，20 ℃保存。另留部分股骨4%多聚甲醛固定24 h，15%乙二胺四乙酸(EDTA-2Na)脫鈣14 d。

1.2.4檢測血清細胞因子指標：取出上清液，所有操作嚴格參照ELISA試劑盒說明書進行，檢測各組大鼠血清細胞因子TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-1水平。

1.2.5檢測血清骨代謝指標：取出上清液，采用ELISA法檢測各組大鼠血清骨代謝相關(guān)生化指標，所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行，分別檢測血清骨礦化指標：Ca、P；骨形成生化指標：ALP、BGP、PICP；骨吸收生化指標：TRAP-5b、ICIP、CTX。

1.2.6檢測骨組織骨密度：取出待測大鼠右股骨，在LUNAR雙能X線吸收掃描儀掃測，采用小物體Discovery Wi掃描模式，用儀器選定興趣區(qū)，以2.0 mm×2.0 mm為中心區(qū)域，應用軟件分析計算BMD值。

1.2.7蘇木精-伊紅染色法(HE染色法)觀察骨組織形態(tài)學：參照HE染色法步驟操作，脫蠟去水、蘇木素染色，1%鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡觀察染色效果。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清細胞因子指標比較

OVX組較Sham組血清TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-1均顯著增高(P<0.05)，OVX+E2組和OVX+PUE組較OVX組血清TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-1均顯著降低(P<0.05)，以O(shè)VX+PUE組最低。見表1。

表1 各組大鼠血清細胞因子指標比較Table 1 Comparison of serum cytokine indexes among each group of rats

2.2 各組大鼠血清骨礦化生化指標

OVX組較Sham組血清Ca、P均顯著降低(P<0.05)，OVX+E2組和OVX+PUE組較OVX組血清Ca、P均顯著升高(P<0.05)，以O(shè)VX+PUE組最高。見表2。

表2 各組大鼠血清骨礦化生化指標比較Table 2 Comparison of serum biochemical indicators of serum among each group of rats

2.3 各組大鼠血清骨形成生化指標

OVX組較Sham組血清ALP、BGP、PICP均顯著增高(P<0.05)，OVX+E2組和OVX+PUE組較OVX組血清ALP、BGP、PICP均顯著降低(P<0.05)，以O(shè)VX+PUE組最降低。見表3。

表3 各組大鼠血清骨形成生化指標比較Table 3 Comparison of biochemical indicators of serum bone formation among each group of rats

2.4 血清骨吸收生化指標

OVX組較Sham組大鼠血清TRAP-5b、ICIP、CTX均顯著增高(P<0.05)，OVX+E2組和OVX+PUE組較OVX組血清TRAP-5b、ICIP、CTX均顯著降低(P<0.05)，以O(shè)VX+PUE組最低。見表4。

表4 各組大鼠血清骨吸收生化指標比較Table 4 Comparison of serum biochemical markers of bone resorption among each group of rats

2.5 各組大鼠骨組織BMD

Sham組、OVX組、OVX+E2組、OVX+PUE組骨組織BMD(g/cm2)分別為：0.235±0.052、0.162±0.037、0.193±0.040、0.221±0.055。OVX組較Sham組股骨BMD顯著降低(P<0.05)，OVX+E2組和OVX+PUE組較OVX組股骨BMD均顯著升高(P<0.05)，以O(shè)VX+PUE組最高。

2.6 各組大鼠骨形態(tài)學改變

Sham組骨皮質(zhì)正常，骨板層次清晰整齊，結(jié)構(gòu)完整，骨松質(zhì)骨小梁數(shù)較多，粗大，排列規(guī)則有序，骨細胞較多，結(jié)構(gòu)清晰完整。OVX組骨皮質(zhì)明顯變薄，骨板層結(jié)構(gòu)差，骨小梁明顯稀少變細，排列紊亂，間距增寬，髓腔明顯擴大，骨細胞明顯減少，脂肪空泡增多。OVX+E2組和OVX+PUE組骨皮質(zhì)明顯變厚，骨板層結(jié)構(gòu)尚完整，骨小梁數(shù)量增多增粗，排列較規(guī)則，連接成網(wǎng)，髓腔明顯縮小，骨細胞增多。見圖1。

圖1 HE染色觀察股骨組織病理學變化(×200)A：Sham組；B：OVX組；C：OVX+E2組；D：OVX+PUE組Fig.1 HE staining to observe the pathological changes of the femur (×200). A: Sham group; B: OVX group; C: OVX+E2 group; D: OVX+PUE group

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)細胞因子廣泛參與PMPO的發(fā)病機制[7]。雌激素和成骨細胞及破骨細胞相互作用，可抑制多種骨形成細胞因子(如IL-1、IL-6、TNF-α)等的分泌，維持骨形成[8]。絕經(jīng)后雌激素水平降低，可通過介導一系列細胞因子分泌增加，參與骨代謝和骨重建，打破骨形成與骨吸收的動態(tài)平衡，骨吸收增加，導致骨質(zhì)疏松[9-10]。同樣，骨代謝相關(guān)細胞因子(如TNF-α、TGF、IL-1、IL-6、IL-11)等通過自分泌和(或)旁分泌方式影響成骨細胞和破骨細胞的分化、增殖、成熟及凋亡，從而調(diào)節(jié)骨質(zhì)重建過程[11-12]。各種細胞因子之間相互作用，組成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，形成骨組織發(fā)育所特需的骨微環(huán)境，它們作用于成骨細胞和破骨細胞，介導骨細胞的分化及成熟，參與正常的骨組織的代謝[13]。研究表明雌激素介導骨細胞和成纖維細胞等對細胞因子的表達，激活OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)、增加TGF-β、IGF-1等的分泌，減少IL-1、IL-6、TNF-α等抑制性細胞因子的表達等[14]。

目前雌激素替代療法(HRT)是PMOP的首選治療方案[15]。HRT能夠防止絕經(jīng)后骨量、骨礦物丟失，預防骨折發(fā)生，緩解絕經(jīng)后癥狀，但HRT有引起心梗、肺栓塞、陰道出血，增加乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌的危險性，毒副作用令人擔憂[16]。中醫(yī)藥歷史悠久，資源豐富、毒副作用相對較小，逐漸在防治PMOP研究中嶄露頭角。Pue作為分離得到的單體異黃酮類植物提取物，具有雌激素類似的化學結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)Pue能與內(nèi)源性雌激素受體結(jié)合，對骨產(chǎn)生雌激素樣作用，不僅能促進成骨細胞的增殖、分化及礦化功能，直接抑制破骨細胞性骨吸收和分化，改善骨代謝；而且增加骨密度和骨礦含量，改善骨生物力學性能[17-18]。本研究結(jié)果表明OVX+PUE組血清細胞因子(TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-1)、骨代謝指標(Ca、P、ALP、BGP、PICP、TRAP-5b、ICIP、CTX)較OVX組均顯著降低(P<0.05)，OVX+PUE組股骨BMD較OVX組均顯著升高(P<0.05)，OVX+PUE組骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)尚完整，骨小梁數(shù)量增多增粗，排列規(guī)則，髓腔稍小。說明Pue通過降低PMOP細胞因子的分泌，促進成骨細胞合成，抑制破骨細胞生成，抑制骨轉(zhuǎn)換，降低骨吸收，促進骨形成，調(diào)節(jié)骨代謝，提高骨密度，改善骨質(zhì)疏松骨組織結(jié)構(gòu)。同樣眾多研究表明Pue可能通過抑制細胞因子分泌而影響骨吸收和骨形成，發(fā)揮防治PMOP的作用[19-20]。李俊華等[21]研究表明Pue降低PMOP患者血清IL-4、IL-6、IL-10水平。梁倩等[22]研究表明葛根素改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠血清ALP、OPG、RANKL等骨代謝指標。

總之，絕經(jīng)后雌激素缺乏與PMOP的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，細胞因子通過多種途徑參與骨代謝過程，對PMOP的發(fā)病起到了重要作用。Pue通過調(diào)控絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠炎性細胞因子分泌，調(diào)節(jié)骨代謝，促進骨生成，改變骨結(jié)構(gòu)，發(fā)揮骨保護作用，但其防治PMOP的確切分子機制有待進一步探討。全面而深入研究葛根素對防治骨質(zhì)疏松的作用機制，從多角度、全方位為葛根素辨證防治骨質(zhì)疏松提供更全面的科學依據(jù)，中草藥為防治骨質(zhì)疏松的貢獻會越來越大。