任艷霞 李軍* 李思源 李佳佳 趙會(huì)榮 王雙

1.石河子大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，新疆 石河子 832000

2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000

3.南陽(yáng)市第二人民醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，河南 南陽(yáng) 473000

4.上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院，上海 200082

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是一種慢性全身性代謝性疾病。T2DM患者并發(fā)骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)的發(fā)病率約可達(dá)30%～60%[1]。OP是一種以骨微結(jié)構(gòu)受損、骨密度(bone mineral density, BMD)減低、骨折風(fēng)險(xiǎn)增加為特征的疾病[2-3]。老年絕經(jīng)后婦女由于體內(nèi)雌激素水平下降，OP發(fā)生率更是達(dá)到了相同年齡段男性的3倍[4]。60%～80%的骨密度變異性是由遺傳因素決定的[4]。血清硬化蛋白(sclerostin，SOST蛋白)由SOST基因編碼產(chǎn)生，目前已證實(shí)SOST可抑制成骨細(xì)胞礦化，促進(jìn)前成骨細(xì)胞增殖分化，負(fù)性調(diào)控骨形成，影響骨密度[6],參與骨代謝。目前已有SOST基因rs851056位點(diǎn)基因多態(tài)性與絕經(jīng)后女性骨代謝關(guān)系的研究[7]，然而有關(guān)絕經(jīng)后T2DM女性中，SOST蛋白表達(dá)及基因rs851056、rs1230399位點(diǎn)多態(tài)性與骨代謝關(guān)系的研究鮮有報(bào)道。本研究旨在檢測(cè)新疆地區(qū)絕經(jīng)后T2DM女性SOST蛋白表達(dá)，探討SOST蛋白基因rs851065、rs1230399位點(diǎn)多態(tài)性骨代謝的關(guān)系，篩選OP篩查、早期診斷和治療的潛在候選基因位點(diǎn)，為OP患者的臨床個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 一般資料

選取2018年10月至 2019年10月石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的絕經(jīng)后T2DM患者，根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，共選取136例研究對(duì)象。根據(jù)OGTT分為兩組，分別為糖耐量正常組(NGT組)及2型糖尿病組(T2DM組)，再結(jié)合BMD結(jié)果將以上兩組分為四組：A組(NGT合并骨量正常)；B組(T2DM合并骨量正常)；C組(NGT合并骨量異常)；D組(T2DM合并骨量異常)。下文以A(-/-)、B(+/-)、C(-/+)、D(+/+)來(lái)代表各組(-為NGT或骨量正常；+為T2DM或OP)。納入標(biāo)準(zhǔn)：清醒狀態(tài)、意識(shí)正常的絕經(jīng)后女性。T2DM及OP的診斷標(biāo)準(zhǔn)分別參照1999年和1994年WHO制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7-8]，即滿足：①FPG≥7.0 mmol/L或具有糖尿病癥狀加隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L或OGTT 2 h血糖≥11.1 mmol/L；②T值≤-2.5 SD 為OP，-2.5 SD

1.2 方法

1.2.1臨床資料的收集：收集患者年齡、絕經(jīng)年限，身高、體重、腰圍及臀圍基本資料。同時(shí)計(jì)算腰臀比(WHR)、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)。運(yùn)用全自動(dòng)生化儀測(cè)定受試者糖、脂、骨代謝指標(biāo)：空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、血鈣(Ca)、血磷(P)、堿性磷酸酶(ALP)。

1.2.2測(cè)定骨密度：通過雙能X線(DEXA)骨密度儀測(cè)定受試者腰椎(L1～4)和股骨頸骨密度水平。

1.2.3提取基因組DNA：清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取受試者靜脈血2 mL,抗凝后用使用DNA提取試劑盒提取DNA。

1.2.4基因組測(cè)序：行PCR擴(kuò)增反應(yīng)后，采用Mass ARRAY質(zhì)譜儀測(cè)定SOST基因rs851065、rs1230399位點(diǎn)基因多態(tài)性。

1.2.5SOST蛋白測(cè)定：通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)測(cè)定受試者血清中SOST蛋白的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 組間基線指標(biāo)的比較

C(-/+)、D(+/+)組分別與對(duì)照組A(-/-)相比，年齡、絕經(jīng)年限比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，后續(xù)各生化指標(biāo)分析采用協(xié)方差分析排除以上影響因素，見表1。

表 1 組間基線指標(biāo)的比較Table 1 Comparison of baseline indicators among groups

2.2 組間各生化指標(biāo)的比較

協(xié)方差分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組A(-/-)組相比，B(+/-)、D(+/+)兩組FPG、HbA1c均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；C(-/+)、D(+/+)兩組TG、股骨頸BMD、L1～4BMD均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表 2 協(xié)方差分析后組間各生化指標(biāo)的比較Table 2 Comparison of biochemical indicators among groups by covariance

2.3 SOST基因位點(diǎn)基因型及等位基因分布頻率

經(jīng)檢驗(yàn)，兩位點(diǎn)的基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。在SOST基因rs1230399位點(diǎn)差異未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在SOST基因 rs851056位點(diǎn)中，B(+/-)組、D(+/+)組與A(-/-)組相比，SOST基因 rs851056位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

表3 SOST基因rs851056位點(diǎn)基因型及等位基因分布頻率[n(%)]Table 3 Four groups of SOST gene rs851056 locus genotype and allele distribution frequency[n(%)]

2.4 各組SOST基因rs851056位點(diǎn)不同基因型間生化指標(biāo)及BMD的比較

C(-/+)組中，GG型HDL、Ca、ALP均低于GC/CC型，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D(+/+)組中，GG型BMD(L1～4)高于GC/CC型，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 各組SOST基因rs851056位點(diǎn)基因型間生化指標(biāo)及BMD的比較Table 4 Comparison of biochemical indexes and BMD among genotypes of SOST gene rs851056 in each

2.5 SOST蛋白表達(dá)比較

2.5.1SOST蛋白各組間的結(jié)果比較:與對(duì)照組A(-/-)相比，C(-/+)、D(+/+)組SOST蛋白表達(dá)水平升高，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表5。

表5 四組SOST蛋白表達(dá)水平Table 5 The expression level of SOST protein in the four groups

2.5.2SOST蛋白水平與BMD的相關(guān)性分析：對(duì)全部受試者進(jìn)行相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)SOST蛋白水平與BMD(L1～4)有弱相關(guān)性，呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見表6。

表6 SOST蛋白水平與BMD相關(guān)性分析Table 6 Correlation analysis of SOST protein and BMD

2.6 BMD與各指標(biāo)的多元線性回歸分析

在D(+/+)組，分別以L1～4BMD及股骨頸BMD作為應(yīng)變量，以BMI(X1)、FPG(X2)、HbA1c(X3)、基因型(X4)、WHR(X5)、年齡(X6)、絕經(jīng)年限(X7)、LDL(X8)、HDL(X9)、TG(X10)、ALP(X11)、BMD與SOST基因多態(tài)性的多元逐步回歸分析結(jié)果顯示，BMI、TG的降低以及rs851056位點(diǎn)的突變是引起L1～4BMD降低的危險(xiǎn)因素；BMI的降低、ALP的增加以及絕經(jīng)年限的增加是引起股骨頸BMD降低的危險(xiǎn)因素，見表7。

表7 多元逐步回歸分析BMD的影響因素Table 7 Multiple linear regression analysis of BMD influencing factors

P(X12)、Ca(X13)、SOST蛋白(X14)為自變量，進(jìn)行多元線性回歸分析。

3 討論

OP的高發(fā)病率、高骨折率嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[10]，絕經(jīng)后女性體內(nèi)雌激素減少，更是OP的高發(fā)人群[11-12]。目前有關(guān)T2DM對(duì)BMD影響的研究結(jié)論不一致，有研究[13-14]表明，T2DM患者骨脆性明顯增加，骨質(zhì)疏松的發(fā)病率也顯著增加[15-16]。但也有研究[17-18]表明，T2DM患者有較高或正常的骨密度。T2DM患者并發(fā)OP受環(huán)境、遺傳等多因素影響。Wnt經(jīng)典信號(hào)通路是參與調(diào)節(jié)骨代謝的重要通路[19]。SOST蛋白可拮抗經(jīng)典Wnt通路，影響骨代謝，降低骨密度[20-21]。關(guān)于SOST基因多態(tài)性及突變分別與2型糖尿病或骨質(zhì)疏松的研究在國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道，但是關(guān)于SOST蛋白表達(dá)及其基因多態(tài)性及突變與絕經(jīng)后2型糖尿病女性合并骨質(zhì)疏松的研究卻鮮有報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，SOST基因rs851056、rs1230399兩位點(diǎn)基因型及等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律。Carmen[9]等研究發(fā)現(xiàn)，SOST基因多態(tài)性與BMD顯著相關(guān)，攜帶G等位基因患者BMD明顯降低，OP發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加。澳大利亞的一項(xiàng)研究[22]發(fā)現(xiàn)，SOST基因多態(tài)性與多個(gè)部位BMD相關(guān)。本研究中，T2DM合并骨量異常組SOST基因rs851056位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率比較有差異，提示rs851056位點(diǎn)基因多態(tài)性參與了骨代謝。此外，本研究還提示該位點(diǎn)基因突變引起了BMD的下降，多元逐步回歸結(jié)果也顯示，rs851056位點(diǎn)的突變是L1～4BMD降低的危險(xiǎn)因素，提示rs851056位點(diǎn)的突變參與了BMD的降低。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)在NGT合并骨量異常組中，CG/CC基因型患者Ca、ALP骨代謝指標(biāo)均高于GG基因型患者，提示rs851056位點(diǎn)基因突變參與了骨代謝指標(biāo)的變化，以上提示該位點(diǎn)多態(tài)性及其突變可能參與了絕經(jīng)后T2DM女性O(shè)P的發(fā)生發(fā)展。本研究中，以rs851056位點(diǎn)為切點(diǎn)對(duì)比一般指標(biāo)、骨代謝指標(biāo)及骨密度指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后骨量異常女性中，rs851056位點(diǎn)等位基因的變異引起NGT合并OP(-/+)患者的Ca、APL下降，結(jié)合基線對(duì)比OP患者L1～4BMD下降，說明rs851056位點(diǎn)基因多態(tài)性對(duì)骨代謝產(chǎn)生了一定的負(fù)向影響。但該突變同時(shí)也引起T2DM合并OP(+/+)患者的L1～4BMD升高，此矛盾的結(jié)果原因可能為：①目前不能明確2型糖尿病對(duì)骨量影響是正性保護(hù)因子還是危險(xiǎn)因素，就本研究結(jié)果而言，考慮其可能為保護(hù)因子，其與rs851056位點(diǎn)基因帶來(lái)的危險(xiǎn)因子相拮抗，在本研究中表現(xiàn)為骨密度升高，具體理論仍需后人繼續(xù)研究；②本研究病例數(shù)少，不排除抽樣偏倚等各種混雜偏倚的產(chǎn)生導(dǎo)致結(jié)果有誤差，需要更大樣本量的前瞻性隊(duì)列研究。

SOST蛋白可抑制骨分化和骨形成，國(guó)內(nèi)外有關(guān)SOST蛋白與BMD關(guān)系的研究結(jié)果不一致。Antonia等[12]研究發(fā)現(xiàn)SOST蛋白與T2DM患者腰椎BMD呈正相關(guān)，但Mirza等[23]對(duì)美國(guó)20例絕經(jīng)后婦女調(diào)查發(fā)現(xiàn)，SOST蛋白與股骨頸和腰椎BMD呈負(fù)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，T2DM合并骨量異?；颊逽OST蛋白表達(dá)水平增高，行相關(guān)分析后發(fā)現(xiàn)血清SOST蛋白水平與L1～4BMD呈負(fù)相關(guān)，提示高SOST蛋白是OP的危險(xiǎn)因素。

綜上所述，新疆絕經(jīng)后T2DM女性中，SOST基因rs851056位點(diǎn)基因多態(tài)性及基因頻率分布可能與骨、糖代謝異常有關(guān)；該位點(diǎn)的基因突變可能與BMD的下降及脂代謝有關(guān)；SOST蛋白表達(dá)水平與骨密度有關(guān)，是BMD降低的危險(xiǎn)因素。因此，對(duì)于T2DM絕經(jīng)后女性，可以此為靶點(diǎn)，為該人群OP的個(gè)體化治療提供新的理論依據(jù)。