曹俊 鄭美蓉 劉建云 吳萍 鄔亞華

九江學院基礎醫(yī)學院，江西 九江 332000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是老年常見病，其發(fā)病機制尚未完全明確，可能與人體骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs)成骨與成脂分化失衡有關[1]。視黃酸(retinoic acid，RA)是維生素A在體內(nèi)的活性代謝產(chǎn)物，是天然的信號分子，廣泛參與細胞分化及代謝的調(diào)控。視黃酸可激活視黃酸受體(retinoic acid receptors，RARs)和視黃酸X受體(retinoid X receptors，RXRs)，兩類受體均屬核受體家族，形成RARs/RXRs或RXRs/RXRs兩種二聚體，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[2]。研究發(fā)現(xiàn)，過量攝入維生素A將增加發(fā)生骨質(zhì)疏松的風險，提示維生素A及視黃酸可能與成骨分化調(diào)控有關[3]?，F(xiàn)有文獻報道結(jié)果往往是矛盾的，部分研究發(fā)現(xiàn)RA可誘導成骨，而另一些研究卻得到相反結(jié)論，這可能與其采用的研究體系(如細胞)不同有關[4-5]。鑒于此，直接以hBMSCs為研究對象，探討視黃酸對其成骨分化的作用機制，對理解骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制顯得尤為必要。在此背景下，筆者研究了兩類視黃酸受體(RARs和RXRs)激動劑對hBMSCs成骨分化的影響。結(jié)果顯示，RARs激動劑ATRA等可促進成骨關鍵轉(zhuǎn)錄因子RUNX2和OSX，以及骨鈣素的表達，但下調(diào)ALPL的表達并抑制后續(xù)鈣化過程，這一作用可能與上調(diào)TGFβ/SMADs信號通路有關。RXRs激動劑SR11237對成骨分化及鈣化的影響較弱，但誘導成骨分化過程中細胞發(fā)生成脂分化，提示其可能在成脂與成骨分化的平衡中扮演關鍵角色。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

人骨髓間充質(zhì)干細胞(賽業(yè)生物科技有限公司，中國)，胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(Gibco 公司，美國)，α-MEM 培養(yǎng)基(Hyclone 公司，美國)，青鏈霉素、胰島素(北京索萊寶科技有限公司，中國)，二甲基亞砜(DMSO)、地塞米松、L-抗壞血酸、β-甘油磷酸、ATRA、9CRA、TTNPB和SR11237(Sigma公司，美國)，TRIZOL(Invitrogen公司，美國)，GoScript Reverse Transcription System(Promega 公司，美國)，SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(Takara 公司，中國)，茜素紅S 染色液、飽和油紅O染色液(北京索萊寶科技有限公司，中國)，氯化十六烷基吡啶一水(Sigma公司，美國)，β-actin抗體、辣根酶標記抗小鼠IgG(H+L)(北京中杉金橋，中國)，Smad1 (D59D7) XP?Rabbit mAb、Smad3 (C67H9) Rabbit mAb、RUNX2 (D1L7F) Rabbit mAb和 Anti-rabbit IgG HRP-linked Antibody(CST公司，美國)，Anti-Retinoic Acid Receptor beta antibody和Anti-Collagen I antibody(Abcam 公司，英國)，Human BMP-2 Mab(R&D公司，美國)，OPN Antibody和SPARC Antibody(SantaCruz公司，美國)。

1.2 儀器

ABI7900HT型實時PCR系統(tǒng)(ABI 公司，美國)，NanoDrop2000 超微量分光光度計(Thermo公司，美國)，ChemiDoc MP凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)，IX73倒置熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)，CO2 培養(yǎng)箱(NBS公司，美國)。

1.3 細胞培養(yǎng)及成骨誘導

人骨髓間充質(zhì)干細胞在37 ℃、5% CO2環(huán)境下采用α-MEM培養(yǎng)基(含10%FBS和1%青鏈霉素)培養(yǎng)，每3 d換液一次，在密度約80%融合時按1∶2傳代。取生長狀態(tài)良好的5～8代的細胞進行成骨誘導。先將細胞接種于6孔板內(nèi)，當細胞密度約50%融合后，更換為成骨誘導培養(yǎng)基(α-MEM 培養(yǎng)基，10%FBS，1%青鏈霉素，0.1 μmol/L地塞米松、50 μg/mL抗壞血酸，10 mmol/Lβ-磷酸甘油)進行誘導培養(yǎng)。實驗設5組，分別加入DMSO(終濃度為0.1%)，RARs激動劑ATRA、9CRA和TTNPB(終濃度均為10 μmol/L)，以及RXRs激動劑SR11237(終濃度為10 μmol/L)，誘導14 d后進行茜素紅及油紅O染色。

1.4 茜素紅和油紅O染色

6孔板細胞去上清后用PBS清洗2次，采用4%的甲醛(PBS配)室溫固定10 min，再PBS清洗2次，加入0.1%茜素紅S染液或油紅O工作液，室溫下染色30 min，清洗并鏡下觀察攝片。茜素紅染色后每孔加入10%氯化十六烷基吡啶一水400 μL,室溫放置1 h，570 nm波長下檢測OD值進行定量。

1.5 qRT-PCR

采用Trizol提取細胞總RNA，NanoDrop2000鑒定RNA的完整性和純度，利用GoScript Reverse Transcription System進行逆轉(zhuǎn)錄，以cDNA為模板，采用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ在ABI 7900實時PCR系統(tǒng)上進行擴增檢測，以ACTB為內(nèi)參，計算2-△△CT進行相對定量，所有檢測均重復3次，PCR引物見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Sequences of primers for qRT-PCR

1.6 免疫印跡檢測(Western blotting)

細胞采用胰蛋白酶消化，PBS清洗后加入蛋白裂解液(含1 mmol/L PMSF)在冰上裂解1 h，提取細胞總蛋白，常規(guī)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，然后加入相應的一抗(稀釋比1∶1 000，根據(jù)具體情況調(diào)整)4 ℃孵育過夜，TBST清洗后加入二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，最后加入ECL試劑進行顯色并拍照。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗，顯著性差異設置為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 RARs激動劑抑制hBMSCs成骨鈣化

為了明確RARs和RXRs受體信號對成骨鈣化的作用，在成骨誘導過程中分別加入RARs激動劑ATRA、9CRA和TTNPB和RXRs激動劑SR11237，終濃度均為10 μmol/L，誘導14 d后進行茜素紅染色。染色結(jié)果顯示(圖1)，各RARs激動劑處理組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量均明顯減少，而RXRs激動劑SR11237處理組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量無顯著變化，提示RARs信號可抑制鈣化，而RXRs信號對鈣化無明顯影響。

圖1 RARs激動劑抑制hBMSCs成骨鈣化Fig.1 RARs agonists inhibited osteogenic calcification of hBMSCs

2.2 RARs激動劑上調(diào)RUNX2和OSX表達但抑制ALPL和I型膠原的表達

為進一步弄清RARs激動劑對成骨鈣化影響的分子機制，本研究采用qRT-PCR和免疫印跡檢測了成骨誘導7 d后，細胞內(nèi)成骨基因、視黃酸RARs受體以及TGFβ/SMAD信號通路基因的表達變化。結(jié)果顯示(圖2)，在RARs各組，成骨分化關鍵成骨轉(zhuǎn)錄因子OSX(SP7)和RUNX2的表達上調(diào)，同時成骨標志基因骨鈣素(osteocalcin，OCN，BGLAP)和骨橋蛋白(osteopontin，OPN，SPP1)也明顯上調(diào)，但堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALPL)、I型膠原和骨粘連蛋白(osteonectin，ON，SPARC)表達下調(diào)。在RXRs激動劑SR11237組，RUNX2表達輕度下調(diào)，ALPL和Ⅰ型膠原表達亦輕度下調(diào)，但幅度弱于RARs各組。

RARs激動劑ATRA、9CRA和TTNPB均明顯上調(diào)RARB、RARG、TGFB2、SMAD3的表達，同時成骨分化誘導因子BMP2的表達上升。RXRs激動劑SR11237處理組BMP2基因表達下調(diào)(圖2C、2D)。

圖2 RARs和RXRs激動劑對hBMSCs成骨分化相關基因表達的影響Fig.2 The effects of RARs and RXRs agonists on the expression of genes related to osteogenic differentiation

2.3 SR11237促進成骨誘導過程中的hBMSCs成脂分化

在hBMSCs成骨誘導過程中，發(fā)現(xiàn)10 μmol/L SR11237處理組部分細胞出現(xiàn)了成脂分化。茜素紅與油紅O雙重染色結(jié)果顯示，誘導14 d SR11237處理組不但有明顯的鈣結(jié)節(jié)，還有大量紅色脂滴，其余各組均無這一現(xiàn)象。qRT-PCR結(jié)果提示，在成骨誘導過程中，ATRA、9CRA和TTNPB顯著上調(diào)成脂關鍵轉(zhuǎn)錄因子CEBPB、CEBPA、PPARG的表達，輕度上調(diào)FABP4的表達，相比較，SR11237處理組對CEBPB、CEBPA、PPARG表達的促進作用較弱，但FABP4表達量顯著高于其他各組。見圖3。

圖3 SR11237促進成骨誘導環(huán)境下hBMSCs分化為脂肪細胞A：10 μmol/L SR11237處理組細胞依次進行茜素紅及油紅O染色(同一視野)，顯示部分細胞分化為脂肪細胞；B：qRT-PCR檢測可見成脂標志基因FABP4在SR11237組明顯上升。ACTB為內(nèi)參，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，與對照組比較，*P<0.05。Fig.3 SR11237 promoted differentiation of hBMSCs into adipocytes under osteogenic inductionA: Alizarin red and oil red O staining (same field) were performed in the cells treated with 10 μmol/L of SR11237; B: QRT PCR showed that FABP4 was significantly increased in SR11237 group. ACTB was the internal parameter. All data were expressed as means±SD. Compared with the control group, *P<0.05.

3 討論

視黃酸與成骨分化密切相關[6]，本研究首先探討了視黃酸受體RARs和RXRs信號對hBMSCs成骨鈣化的影響。結(jié)果顯示RARs抑制鈣化，而RXRs對鈣化無明顯影響。為此，本研究進一步檢測了兩類受體對成骨相關基因表達的影響，與預期相反，RARs信號雖然抑制成骨鈣化，但上調(diào)成骨轉(zhuǎn)錄因子OSX和RUNX2的表達，同時顯著上調(diào)成骨標志基因OCN和OPN的表達，導致鈣化抑制的原因是因為其抑制了參與鈣化過程的關鍵酶ALPL的表達，Ⅰ型膠原基因(COL1A1，COL1A2)的表達也下調(diào)，由于ALPL和Ⅰ型膠原是轉(zhuǎn)錄因子RUNX2的靶基因[7]，而RUNX2的表達量是增加的，據(jù)此猜測RUNX2轉(zhuǎn)錄功能受到抑制。

對TGFβ/SMADs信號通路的檢測結(jié)果表明，RARs激動劑上調(diào)該通路基因(包括SMAD2/3及TGFB1-3)的表達。已知TGFβ/SMADs通路是成骨分化的抑制信號，SMAD3可與RUNX2結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄活性[8]。這提示RARs激動劑減少Ⅰ型膠原和堿性磷酸酶的合成，抑制鈣化，可能與激活TGFβ/SMAD3等有關。

本研究還發(fā)現(xiàn)RARs激動劑上調(diào)BMP/SMADs通路基因(包括SMAD1/5及BMP2)的表達。BMP2/SMAD1是主要的成骨誘導信號，介導MSCs向成骨細胞分化的細胞決定過程，BMP2可上調(diào)同源盒蛋白DLX3和DLX5促進RUNX2的表達和轉(zhuǎn)錄活性，亦促進OSX的表達[9-10]。因此，本研究認為，RARs激動劑可能是通過BMP2/SMAD1信號通路使RUNX2和OSX的表達上升，表現(xiàn)為成骨誘導，同時上調(diào)TGFβ/SMAD3信號通路，抑制RUNX2的轉(zhuǎn)錄活性，使成骨分化后的鈣化過程被抑制。

RXRs激動劑SR11237輕度下調(diào)BMP2和RUNX2表達，對ALPL和Ⅰ型膠原等合成的抑制作用明顯弱于RARs激動劑，同時對OSX、ON、OCN等表達和鈣結(jié)節(jié)的形成無明顯影響，提示RXRs可能不是調(diào)控成骨分化的主要信號。雖然有研究顯示RXRs激動劑貝沙羅汀(bexarotene)在較高濃度(100 nmol/L)可明顯抑制鈣化，但貝沙羅汀在高濃度時也可以激活RARs，因此其對鈣化的抑制可能仍然是通過RARs而非RXRs進行的[11]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在成骨誘導環(huán)境下，RXRs激動劑SR11237可上調(diào)成脂轉(zhuǎn)錄因子CEBPB、CEBPA、PPARG的表達，并顯著增加成脂表形基因FABP4表達及脂滴形成，誘導細胞分化為脂肪細胞。相比較，RARs激動劑處理組雖然成脂轉(zhuǎn)錄因子CEBPA等的表達水平更高，但其下游FABP4的水平明顯低于RXRs組，亦未觀察到脂滴形成現(xiàn)象，顯示這些成脂轉(zhuǎn)錄因子的活性同樣被抑制，可能亦涉及TGFβ/SMADs 通路[12]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)RARs激動劑可誘導成骨分化但抑制鈣化，RXRs激動劑對成骨分化及鈣化無明顯作用，同時促進成骨誘導環(huán)境中hBMSCs分化為脂肪細胞，提示RARs和RXRs兩類信號在細胞成骨分化過程中明顯不同的角色。