杜超

（內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010022）

在植物基因組中，轉(zhuǎn)錄因子基因占據(jù)了很大比例，例如，在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中有2100多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因，在水稻(Oryza sativa)中有2 300多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因[1]。這些轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)分子結(jié)構(gòu)特征的不同，被分成不同的基因家族，如WRKY、Basic region-leucine zipper (bZIP)、APETALA2/ethylene response factors(AP2/ERF)、GRAS、Myeloblastosis(MYB)、Basic helix-loop-helix(bHLH)、NAM/ATAF/CUC(NAC)等轉(zhuǎn)錄因子家族。這些轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控植物特定基因的表達(dá)，在植物生長發(fā)育和適應(yīng)環(huán)境過程中起到重要作用，其中WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是最大的轉(zhuǎn)錄因子超家族之一[2-6]。

1994年，在甘薯(Ipomoea batatas)中發(fā)現(xiàn)了第1個(gè)WRKY 轉(zhuǎn)錄因子，并被命名為Sweet Potato Factor1(SPF1)，隨后在其他植物中同樣發(fā)現(xiàn)了大量的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，到目前為止，在擬南芥和水稻中已經(jīng)分別發(fā)現(xiàn)了72和102個(gè)WRKY蛋白[7-10]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能非常復(fù)雜，能夠調(diào)控植物的多種生理過程，包括植物生長、發(fā)育、衰老、次生代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、環(huán)境脅迫響應(yīng)等，在植物適應(yīng)環(huán)境、種群分布以及促進(jìn)農(nóng)牧業(yè)發(fā)展等方面發(fā)揮了重要作用[11-13]。因此，深入研究WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的功能及調(diào)控機(jī)理，有助于理解植物適應(yīng)環(huán)境的生理過程，為改善生態(tài)環(huán)境和發(fā)展農(nóng)牧業(yè)奠定理論基礎(chǔ)。

1 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征與分類

WRKY轉(zhuǎn)錄因子屬于WRKY-GCM1鋅指蛋白超家族，由轉(zhuǎn)座酶突變基因進(jìn)化而成[14-15]。WRKY蛋白家族因具有高度保守的WRKY 結(jié)構(gòu)域而得名，該結(jié)構(gòu)域由大約60個(gè)氨基酸殘基組成，在N端具有一段氨基酸序列結(jié)構(gòu)WRKYGQK，而在C端存在一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)[16]。在少數(shù)植物中，WRKY結(jié)構(gòu)域也被替換為WRRY、WSKY、WKRY、WVKY 或WKKY等氨基酸序列[17]。WRKY 結(jié)構(gòu)域的鋅指結(jié)構(gòu)有兩種類型，分別為Cx4-5Cx22-23HxH (C2H2型)或者Cx7Cx23HxC(C2HC 型) (圖1)[18]。2005年，Yamasaki 等[19]首次報(bào)道了WRKY 結(jié)構(gòu)域的溶液結(jié)構(gòu)，證明了WRKY結(jié)構(gòu)域主要由4條β 折疊組成，并伴有由半胱氨酸或組氨酸(Cys/His)殘基組成的鋅指結(jié)構(gòu)。除WRKY 結(jié)構(gòu)域以外，部分WRKY 轉(zhuǎn)錄因子也具有核定位序列(NLS)、亮氨酸拉鏈、脯氨酸富集結(jié)構(gòu)等結(jié)構(gòu)特征。

根據(jù)WRKY 結(jié)構(gòu)域的個(gè)數(shù)以及鋅指結(jié)構(gòu)的特征，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子被分為3類(圖1)。Ⅰ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子含有2個(gè)WRKY 結(jié)構(gòu)域和C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，例如SPF1、FtWRKY10、CkWRKY33、MdWRKY100、PcWRKY1、AtZAP1和CsSE71等[7,20-23]。Ⅰ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子不僅存在于高等植物中，也存在于其他真核生物中，包括藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(Giardia lamblia)、盤基網(wǎng)柄菌(Dictyostelium discoideum)和萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，說明WRKY 蛋白可能起源于一些古老的真核生物[24]。Ⅱ類WRKY 轉(zhuǎn)錄因子含有1個(gè)WRKY 結(jié)構(gòu)域和C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，例 如CsWRKY7、SbWRKY50、MdWRKY30和CiWRKY12等[25-28]。還有一些WRKY 轉(zhuǎn)錄因子被稱為Ⅲ類WRKY 轉(zhuǎn)錄因子，包括TaWRKY42-B、JcWRKY2、PlWRKY70和 NtWRKY5等，Ⅲ類WRKY 轉(zhuǎn)錄因子含有1個(gè)WRKY 結(jié)構(gòu)域和C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)[16,29-31]。目前只在高等植物中發(fā)現(xiàn)了Ⅲ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子，均與植物抵抗生物脅迫有關(guān)，表明這類轉(zhuǎn)錄因子可能是植物在生物脅迫條件下進(jìn)化產(chǎn)生的[32-33]。另外，對水稻中的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因家族進(jìn)行進(jìn)化分析，結(jié)果顯示水稻中的Ⅲ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因數(shù)量急劇增加，表明Ⅲ類WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在生物進(jìn)化方面比Ⅰ和Ⅱ類WRKY 轉(zhuǎn)錄因子更加活躍，并且可能在單子葉植物中發(fā)揮了重要功能[34]。

圖1 WRKY 結(jié)構(gòu)域序列特征及WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的分類Figure 1 Sequence characterization of the WRKY domain and classification of WRKY transcription factors

2 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的作用機(jī)制

WRKY轉(zhuǎn)錄因子能夠識別并結(jié)合DNA 序列中的W-box 順式作用元件，從而調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)。WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過C-末端的鋅指結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合在W-box 序列上，該結(jié)合過程需要鋅離子參與，而WRKY 結(jié)構(gòu)域的N-末端則提高了WRKY 蛋白與W-box 序列的結(jié)合能力和特異性[7,35-37]。W-box順式作用元件的DNA 序列為TTGACT/C，大量研究證明W-box 序列是WRKY 蛋白能夠識別并結(jié)合的最小DNA 序列[16]。例如，凝膠遷移分析表明TcWRKY1可以結(jié)合在DBAT基因啟動(dòng)子的W-box區(qū)域[38]。酵母單雜交試驗(yàn)證明ThWRKY2、ThWRKY4和ThWRKY7蛋白能夠結(jié)合在W-box 序列上，激活下游基因的表達(dá)[39]。染色質(zhì)免疫共沉淀顯示AtWRKY46能夠結(jié)合在ABI4、IAGLU、UGT84B2、GH3.1、LEA、LEA18、TRX5和Peroxidase54等目的基因的啟動(dòng)子區(qū)域的W-box 上，并調(diào)控這些靶基因的表達(dá)[40-41]。

當(dāng)W-box 順式作用元件中的堿基發(fā)生突變時(shí)，WRKY 蛋白與目的DNA 片段的結(jié)合會受到不同程度的影響。例如，當(dāng)W-box 序列“TTGACC”突變?yōu)椤癟TGATC”或者“TCGACC”，ThWRKY4轉(zhuǎn)錄因子與這兩個(gè)突變序列的結(jié)合力急劇下降，而當(dāng)W-box序列“TTGACC”突變?yōu)椤癟TGGCC”時(shí)，ThWRKY4轉(zhuǎn)錄因子與這個(gè)突變序列的結(jié)合力仍然很高，這表明了在W-box 順式作用元件中，“T”和“C”堿基在WRKY 轉(zhuǎn)錄因子與W-box 的結(jié)合中起到了關(guān)鍵作用，然而“A”堿基的作用較弱[39]。另外，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，WRKY6、WRKY11、WRKY26、WRKY38和WRKY43蛋白與單獨(dú)的W-box 序列結(jié)合能力非常低，但是當(dāng)W-box 序列的兩端帶有3～4 bp其他堿基時(shí)，WRKY6、WRKY11、WRKY26、WRKY38和WRKY43蛋白與W-box 序列的結(jié)合能力顯著提高[42]，表明與W-box 區(qū)域相鄰的DNA 序列也對WRKY 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能力有影響。

3 WRKY轉(zhuǎn)錄因子對植物響應(yīng)非生物脅迫的調(diào)控功能

植物在生長過程中會在不同發(fā)育時(shí)期受到多種非生物脅迫的影響，例如，干旱、鹽害、高溫、低溫、營養(yǎng)元素缺乏、光照不足等，這些非生物脅迫會限制植物的生長和發(fā)育，甚至影響植物在不同類型環(huán)境中的分布。WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因在植物響應(yīng)非生物脅迫過程中起重要作用，可以被不同非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。對13個(gè)OsWRKY轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行Northern 雜交分析發(fā)現(xiàn)，10個(gè)OsWRKY基因能夠不同程度地響應(yīng)鹽害、干旱、高溫和低溫脅迫[43]。在甘蔗(Saccharum officinarum)中，ScWRKY5基因能夠被鹽脅迫和干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[44]。在小麥(Triticum aestivum)中，8個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因在鹽害、干旱、高溫和低溫脅迫下被誘導(dǎo)表達(dá)[45]。值得注意的是，非生物脅迫對WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用通常是非?？焖俚?，這種表達(dá)模式確保了WRKY 轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的細(xì)胞信號能夠快速傳遞，激活下游非生物脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致植物對非生脅迫做出響應(yīng)。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以通過調(diào)控脅迫相關(guān)基因的表達(dá)以及修改特定脅迫相關(guān)基因的時(shí)空表達(dá)模式來參與植物響應(yīng)非生物脅迫過程，一個(gè)WRKY 轉(zhuǎn)錄因子通?？梢酝瑫r(shí)調(diào)控多種非生物脅迫響應(yīng)過程，如OsWRK45和OsWRK72基因通過激活下游脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽脅迫和干旱脅迫的耐受性[46-47]。在擬南芥中過表達(dá)TaWRKY19基因提高了DREB2A、RD29A、RD29B和Cor6.6的表達(dá)量，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對鹽、干旱和冷脅迫的耐受性[48]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以通過多種途徑來調(diào)控植物響應(yīng)非生物脅迫，而脫落酸(abscisic acid，ABA)信號通路、抗氧化系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)是其中最重要的途徑，在WRKY轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物響應(yīng)鹽、干旱、高溫和紫外脅迫等過程中均發(fā)揮重要的作用。

3.1 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫條件下對ABA 信號通路的調(diào)控作用

ABA 是一種與脅迫相關(guān)的植物激素，在植物響應(yīng)非生物脅迫過程中起到了重要作用，與WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控功能密切相關(guān)，例如，2個(gè)等位基因OsWRKY45-1和OsWRKY45-2在鹽脅迫響應(yīng)和ABA信號通路中發(fā)揮了不同的功能，在水稻中過表達(dá)OsWRKY45-1基因降低了轉(zhuǎn)基因植株對ABA 的敏感性，但是對轉(zhuǎn)基因植株的鹽脅迫耐受性沒有明顯影響，而過表達(dá)OsWRKY45-2則增加了轉(zhuǎn)基因植株的ABA 敏感性，同時(shí)降低了鹽脅迫耐受性[49]。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族能夠通過調(diào)控ABA 信號通路中多個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)水平參與植物響應(yīng)非生物脅迫過程，包括ABA 合成基因、ABA 受體基因以及其他ABA 信號通路相關(guān)基因。例如，對鹽脅迫處理前后的ZmWRKY114轉(zhuǎn)基因水稻和野生型水稻進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，NCED3基因、NCED5基因、PYL3基因和PYL9基因的表達(dá)水平在ZmWRKY114轉(zhuǎn)基因水稻中具有更高的上調(diào)幅度，NCED3、NCED5基因是ABA 合成基因，PYL3、PYL9基因是ABA 受體基因，結(jié)合ZmWRKY114轉(zhuǎn)基因水稻具有較低的ABA 含量、ABA 敏感性以及鹽脅迫耐受性，推斷ZmWRKY114 轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控ABA 合成基因和受體基因的表達(dá)提高了植物體內(nèi)的ABA 水平，從而在植物響應(yīng)鹽脅迫過程中起到了負(fù)調(diào)控作用[50]。小麥的TaWRKY1蛋白也可以通過調(diào)控ABA 受體基因NtPYL8的表達(dá)來控制植物氣孔開度，從而增強(qiáng)了TaWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草(Nicotiana tabacum)的干旱耐受性[51]。ABA 響應(yīng)元件基因ABRE和ABA 響應(yīng)元件結(jié)合因子基因ABF3是ABA信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的關(guān)鍵基因，在擬南芥中過表達(dá)TaWRKY46基因，提高了ABRE基因和ABF3基因的表達(dá)水平，增強(qiáng)了TaWRKY46轉(zhuǎn)基因擬南芥對滲透脅迫的耐受性，表明TaWRKY46轉(zhuǎn)錄因子可以通過調(diào)控ABA信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)來增強(qiáng)植物的滲透脅迫耐受性[52]。在棉花(Gossypiumspp.)中分別沉默GhWRKY21基因和ABA 信號通路負(fù)調(diào)控因子基因GhHAB均有效提高了棉花的干旱脅迫耐受性，深入研究發(fā)現(xiàn)GhWRKY21蛋白可以結(jié)合在GhHAB基因的啟動(dòng)子，因此推測GhWRKY21轉(zhuǎn)錄因子通過上調(diào)GhHAB基因的表達(dá)在植物響應(yīng)干旱脅迫過程中發(fā)揮了負(fù)調(diào)控作用，表明ABA 信號通路在WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族調(diào)控植物響應(yīng)干旱脅迫過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[53]。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族對植物響應(yīng)非生物脅迫過程中ABA 信號通路的調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜，其不僅可以直接調(diào)控ABA 信號通路相關(guān)基因的表達(dá)，還可以依賴于茉莉酸(jasmonic acid，JA)信號通路與ABA 信號通路之間的協(xié)同作用調(diào)控ABA 信號通路。例如在擬南芥中過表達(dá)GbWRKY1基因，顯著降低了轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽脅迫和干旱脅迫的耐受性以及對ABA 處理的敏感性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GbWRKY1轉(zhuǎn)錄因子是ABA 信號通路中的一個(gè)負(fù)調(diào)控因子，它不僅可以調(diào)控ABA 響應(yīng)相關(guān)基因RAB18和RD29A的表達(dá)，而且還可以依賴于JA 信號通路相關(guān)蛋白JAZ1 來調(diào)控ABA 信號通路關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子ABI1的功能，從而降低植物對非生物脅迫的耐受性[54]。

3.2 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫條件下對植物內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)作用

植物在遭受非生物脅迫時(shí)體內(nèi)的活性氧平衡、離子平衡以及滲透平衡會被破壞，使得植物的內(nèi)穩(wěn)態(tài)紊亂，從而影響植物的生長發(fā)育。環(huán)境中的非生物脅迫可以導(dǎo)致植物體中積累過量的過氧化氫(H2O2)、羥自由基(·OH)、單線態(tài)氧(1O2)等活性氧，破壞植物內(nèi)氧化平衡，并對植物細(xì)胞膜系統(tǒng)造成損傷，限制了植物的生長發(fā)育。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子可以通過調(diào)控植物體內(nèi)多種抗氧化酶的含量來清除過量積累的活性氧，保持植物在非生物脅迫條件下的活性氧平衡，提高植物的非生物脅迫耐受性，包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)等。例如，在非生物脅迫條件下，小黑楊(Populus simonii×P.nigra)中的WRKY56轉(zhuǎn)錄因子和沙棘(Hippophae rhamnoides)中的HrWRKY 21轉(zhuǎn)錄因子均可以通過提高植物中POD和SOD的活性來降低植物的氧化損傷程度，從而提高植物對鹽脅迫的耐受性[55,56]。DgWRKY1、DgWRKY3、DgWRKY4和DgWRKY5的轉(zhuǎn)基因植物在鹽脅迫條件下的H2O2含量、丙二醛和超氧陰離子含量顯著低于野生型植株(P<0.05)，而POD、CAT 和SOD活性顯著高于野生型植株，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)抗氧化酶基因CAT、SOD和APX在轉(zhuǎn)基因植株中具有更高的表達(dá)量，這些結(jié)果表明這3個(gè)DgWRKY轉(zhuǎn)錄因子可以促進(jìn)抗氧化酶基因的表達(dá)，提高抗氧化酶活性，降低植物在鹽脅迫條件下受到的氧化損傷[57-60]。在擬南芥中過表達(dá)GhWRKY6基因也提高了轉(zhuǎn)基因植株的SOD和POD活性，降低了丙二醛和H2O2的含量，從而提高了轉(zhuǎn)基因植株的鹽脅迫耐受性和滲透脅迫耐受性[61]。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族對植物體內(nèi)抗氧化酶水平的調(diào)控機(jī)制較為簡單，其可以直接結(jié)合在CAT、POD、SOD等抗氧化酶合成途徑相關(guān)基因啟動(dòng)子上，對其表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控。例如在氧化脅迫條件下，F(xiàn)cWRKY40轉(zhuǎn)錄因子能夠提高FcWRKY40轉(zhuǎn)基因煙草中CAT基因和POD基因的表達(dá)水平，從而降低了轉(zhuǎn)基因煙草中丙二醛和H2O2的含量，提高了FcWRKY40轉(zhuǎn)基因煙草對氧化脅迫的耐受性[62]。在鹽脅迫條件下，RtWRKY23轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合在轉(zhuǎn)基因擬南芥POD、POD22和POD23基因的啟動(dòng)子上并誘導(dǎo)其表達(dá)，提高轉(zhuǎn)基因擬南芥體內(nèi)的過氧化物酶水平，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的鹽脅迫耐受性[63]。JcWRKY2 轉(zhuǎn)錄因子可以誘導(dǎo)JcWRKY2轉(zhuǎn)基因煙草中NtCAT和NtSOD基因的表達(dá)，提高CAT和SOD的酶活，使得JcWRKY2轉(zhuǎn)基因煙草可以在鹽脅迫條件下保持體內(nèi)的活性氧平衡，增強(qiáng)了JcWRKY2轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性[64]。然而，部分WRKY 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到抗氧化酶合成途徑相關(guān)基因啟動(dòng)子上之后，也能夠抑制靶基因的表達(dá)，在植物響應(yīng)非生物脅迫過程中起到負(fù)調(diào)控作用。CaWRKY27基因能夠被鹽脅迫、滲透脅迫和ABA 處理誘導(dǎo)表達(dá)，但在煙草中過表達(dá)的CaWRKY27基因卻降低了轉(zhuǎn)基因煙草中抗氧化酶合成途徑相關(guān)基因NtAPX1、NtSOD、NtPOX1和NtPOX2的表達(dá)水平，并增加了轉(zhuǎn)基因煙草對鹽脅迫和滲透脅迫的敏感性，證明CaWRKY27轉(zhuǎn)錄因子通過抑制抗氧化酶合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)在植物響應(yīng)鹽脅迫和干旱脅迫過程中發(fā)揮了負(fù)調(diào)控作用[65]。

另外，非生物脅迫，例如干旱脅迫、鹽脅迫等，還能夠引起植物體內(nèi)失水以及累積過量的金屬離子，破壞植物體內(nèi)的離子平衡，影響植物的生長發(fā)育。WRKY轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控植物體內(nèi)的Na+和K+含量，幫助植物在非生物脅迫條件下保持離子平衡。擬南芥中的WRKY33轉(zhuǎn)錄因子可以通過誘導(dǎo)鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtKUP2的表達(dá)，降低擬南芥在鹽脅迫條件下的Na+/K+比率，保持?jǐn)M南芥體內(nèi)的離子平衡，增強(qiáng)了擬南芥的耐鹽性[66]。GhWRKY34基因在擬南芥中異源表達(dá)，提高了擬南芥中與離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的SOS基因家族的表達(dá)量，降低了轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫條件下的Na+/K+比率，使得植株在鹽脅迫條件下保持了離子平衡，并具有更好的生長狀況[67]。沉默擬南芥中WRKY8基因，提高了鹽脅迫條件下的Na+/K+比率，增強(qiáng)了對鹽脅迫的敏感性，這表明WRKY8 蛋白在擬南芥抵抗鹽脅迫和保持離子平衡過程中起到了重要的作用[68]。在非生物脅迫條件下，植物體內(nèi)的過度失水及離子平衡紊亂也會導(dǎo)致植物的滲透平衡被破壞，使得植物遭受次級滲透脅迫。脯氨酸(proline)是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子可以通過調(diào)控脯氨酸的代謝保持植物在非生物脅迫條件下的滲透平衡。在干旱脅迫條件下，GmWRKY12轉(zhuǎn)基因大豆(Glycine soja)具有比野生型大豆更好的生長狀況及更高的脯氨酸含量，表明GmWRKY12轉(zhuǎn)錄因子可以通過提高植物體內(nèi)脯氨酸含量幫助植物響應(yīng)干旱脅迫[69]。P5CS基因是脯氨酸合成途徑中的關(guān)鍵基因，在菊花(Dendranthema grandiflorum)中過表達(dá)DgWRKY2基因顯著提高了轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量和DgP5CS基因的表達(dá)水平(P<0.05)，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對鹽脅迫的耐受性，證明WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以通過誘導(dǎo)脯氨酸合成途徑關(guān)鍵基因來促進(jìn)脯氨酸的累積，增強(qiáng)植物對非生物脅迫的耐受性[70]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子同樣可以通過抑制脯氨酸降解途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)來提高植物體內(nèi)的脯氨酸水平，維持植物在非生物條件下的滲透平衡。例如，RtWRKY23轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在脯氨酸降解途徑關(guān)鍵基因PRODH2的啟動(dòng)子上抑制其表達(dá)，阻止植物體內(nèi)脯氨酸的降解，提高了植物體內(nèi)脯氨酸的水平，從而保持了植物在鹽脅迫條件下的滲透平衡，增強(qiáng)了植物的鹽脅迫耐受性[63]。

一些WRKY 轉(zhuǎn)錄因子也能同時(shí)調(diào)控植物體內(nèi)的ROS平衡、離子平衡和滲透平衡，幫助植物適應(yīng)非生物脅迫環(huán)境。例如，在番茄(Lycopersicon esculentum)中過表達(dá)SlWRKY3基因，提高了大量與抗氧化酶、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、水分轉(zhuǎn)運(yùn)、防御信號相關(guān)基因的表達(dá)量，使得轉(zhuǎn)基因植物在鹽脅迫條件下具有更高的生物量和光合作用[71]。過表達(dá)和基因沉默試驗(yàn)證明，GmWRKY27蛋白能夠通過降低植物體內(nèi)的ROS水平和提高脯氨酸含量來增強(qiáng)植物對鹽脅迫和干旱脅迫的耐受性[72]。JcWRKY 蛋白通過參與水楊酸(salicylic acid，SA)信號通路，提高了轉(zhuǎn)基因煙草的脯氨酸、可溶性糖以及K+的含量，抑制了ROS和Na+的累積，使得轉(zhuǎn)基因煙草在鹽脅迫條件下具有更好的種子萌發(fā)率、光合作用和生長狀況[73]?？偠灾?，在植物響應(yīng)非生物脅迫過程中，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合在下游靶基因的啟動(dòng)子上，包括CAT、SOD、AtKUP2和P5CS等非生物脅迫相關(guān)基因，調(diào)控這些靶基因的表達(dá)，引起植物體內(nèi)抗氧化酶活性升高、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)累積、Na+/K+比率降低等生理變化，維持植物的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，最終幫助植物適應(yīng)惡劣生境(圖2)。

圖2 非生物脅迫條件下WRKY 轉(zhuǎn)錄因子對植物內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)控機(jī)制Figure2 The regulatory mechanism of WRKY TF in plant homeostasisunder abiotic stresses

4 WRKY轉(zhuǎn)錄因子對植物響應(yīng)生物脅迫的調(diào)控功能

除了非生物脅迫，植物在自然界中還會受到多種生物脅迫，例如，植物病原菌的侵染、昆蟲的侵食、植物之間的寄生等[74]。植物在長久的進(jìn)化過程中形成了復(fù)雜的防御信號網(wǎng)絡(luò)來響應(yīng)各種生物的侵害，而且越來越多的研究表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子在這些防御信號途徑中起到了非常復(fù)雜的調(diào)控作用。植物激素介導(dǎo)的信號通路在植物響應(yīng)生物脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用，例如，茉莉酸JA 和乙烯(ethylene，Eth)介導(dǎo)的信號通路可以幫助植物抵抗死體營養(yǎng)型病原菌，而水楊酸SA 介導(dǎo)的信號通路則參與了植物抵抗活體營養(yǎng)型病原菌的過程[75]。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子可以通過調(diào)控植物激素的合成代謝或者作為植物激素介導(dǎo)的信號通路的下游靶基因參與到植物激素介導(dǎo)的信號通路中，從而調(diào)控植物響應(yīng)生物脅迫的過程。例如，PlWRKY13轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控芍藥(Paeonia lactiflora)體內(nèi)JA 和SA 水平，提高了芍藥對細(xì)極鏈格孢菌(Alternaria tenuissima)的抵抗性[76]。水稻中的兩個(gè)等位基因OsWRKY45-1和OsWRKY45-2在其抵抗水稻白葉枯菌(Xanthomonas oryzae)侵染的過程中發(fā)揮了不同的作用，OsWRKY45-1基因提高了水稻對白葉枯菌的敏感性，而OsWRKY45-2基因則增強(qiáng)了水稻對白葉枯菌的抵抗能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，OsWRKY45-1蛋白和OsWRKY45-2蛋白對SA 合成途徑相關(guān)基因ICS1和PAD4、SA 依賴途徑的關(guān)鍵基因PR1a以及SA 依賴途徑和JA 依賴途徑的共同關(guān)鍵基因PR1b的表達(dá)具有不同的調(diào)控作用，導(dǎo)致OsWRKY45-1蛋白在水稻抵抗白葉枯菌過程中同時(shí)引起了SA 和JA 的累積，而OsWRKY45-2蛋白在該過程中僅引起了JA 的累積，證明了OsWRKY45-1和OsWRKY45-2基因主要是通過調(diào)控SA 水平和JA 的水平，從而在水稻抵抗白葉枯菌過程中發(fā)揮了不同功能[77]。美洲葡萄(Vitis labrusca)中的VlWRKY3基因可以被茉莉酸甲酯和Eth 處理誘導(dǎo)表達(dá)，在擬南芥中異源表達(dá)VlWRKY3基因發(fā)現(xiàn)，VlWRKY3蛋白可以通過調(diào)控PR1、PDF1.2、NPR1和LOX3基因的表達(dá)水平來增強(qiáng)植物對灰霉菌(Botrytis cinerea)的敏感性以及對白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)的抵抗性，表明VlWRKY3基因作為JA 和Eth 介導(dǎo)的信號通路的下游靶基因參與調(diào)控了植物響應(yīng)生物脅迫的過程[78]。PtrWRKY18和PtrWRKY35基 因 能 被 丁 香 假單胞菌(Pseudomonas syringae)、灰霉菌(Botrytis cinerea)、SA 和JA 處理誘導(dǎo)表達(dá)，在擬南芥中過表達(dá)PtrWRKY18和PtrWRKY35基因發(fā)現(xiàn)，PtrWRKY18和PtrWRKY35轉(zhuǎn)錄因子通過誘導(dǎo)JA 信號通路關(guān)鍵基因PR3和PDF1.2的表達(dá)來增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥對灰霉菌的抵抗性，以及抑制SA 信號通路關(guān)鍵基因PR1、PR2和NPR1的表達(dá)來提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對丁香假單胞菌的敏感性，表明PtrWRKY18和PtrWRKY35轉(zhuǎn)錄因子對SA 信號通路和JA 信號通路具有不同的調(diào)控機(jī)制，并導(dǎo)致了這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在JA 介導(dǎo)的植物響應(yīng)灰霉菌過程和SA 介導(dǎo)的植物響應(yīng)丁香假單胞菌過程中發(fā)揮了不同的調(diào)控作用[79]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，除了通過調(diào)控SA、JA 等植物激素的合成代謝及其介導(dǎo)的信號通路，來影響植物對各種生物脅迫的耐受性以外，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子還能通過調(diào)控植物的次級代謝來影響植物對生物脅迫的耐受性。在南非醉茄(Withania somnifera)中沉默WsWRKY1基因，增強(qiáng)了南非醉茄對丁香假單胞桿菌、灰霉菌以及斜紋夜蛾幼蟲(Spodoptera litura)取食的敏感性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，WsWRKY1基因的沉默導(dǎo)致了內(nèi)源蕓苔素內(nèi)酯和內(nèi)源醉茄內(nèi)脂的濃度降低，引起了依賴于蕓苔素內(nèi)酯的SA 依賴病原相關(guān)蛋白編碼基因PR1、PR3和PR5的表達(dá)水平下調(diào)，同時(shí)醉茄內(nèi)脂具有抗細(xì)菌、抗真菌以及拒食草動(dòng)物取食的作用，因此，WsWRKY1轉(zhuǎn)錄因子可能通過調(diào)控蕓苔素內(nèi)酯和醉茄內(nèi)脂的合成代謝途徑幫助南非醉茄抵抗丁香假單胞桿菌、灰霉菌以及斜紋夜蛾幼蟲取食[80]。目前關(guān)于WRKY 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物響應(yīng)生物脅迫過程的研究主要集中于植物激素介導(dǎo)的信號通路方面，諸如VpWRKY3、AtWRKY18、AtWRKY40和AtWRKY60等蛋白[81-84]，然而關(guān)于WRKY 轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控植物次級代謝過程來參與到植物響應(yīng)生物脅迫過程中的研究較少，仍需要進(jìn)行更深入的研究。

5 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在牧草中的研究及應(yīng)用

隨著WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族的生物學(xué)功能及調(diào)控機(jī)理逐漸被挖掘、認(rèn)識和研究，展現(xiàn)出了其在牧草資源保護(hù)及利用、牧草遺傳育種、草地生態(tài)恢復(fù)等牧草相關(guān)領(lǐng)域的研究必要性及重要應(yīng)用價(jià)值，目前已有大量牧草WRKY 轉(zhuǎn)錄因子被挖掘和利用(表1)。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族在牧草生長發(fā)育、適應(yīng)環(huán)境及抵抗蟲害和病害的過程中具有重要作用，大量WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員被證明參與了牧草生長發(fā)育、響應(yīng)生物和非生物脅迫過程。例如，二穗短柄草(Brachypodium distachyon)中的BdWRKY38轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控SA 信號通路，提高了植物對立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)的抗性[84]。玉米(Zea mays)是一種重要的農(nóng)作物及青貯飼料，研究表明大量WRKY 轉(zhuǎn)錄因子參與了玉米響應(yīng)非生物脅迫過程，包 括ZmWRKY106、ZmWRKY40、ZmWRKY114、ZmWRKY53等轉(zhuǎn)錄因子[50,85-87]。在紫花苜蓿(Medicago sativa)中共發(fā)現(xiàn)了107個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因，其中27個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因可以被低溫、鹽、干旱等非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族在紫花苜蓿適應(yīng)惡劣生境過程中發(fā)揮了重要作用[88]。同樣在木豆(Cajanus cajan)中發(fā)現(xiàn)了94個(gè)CcWRKY基因，其中CcWRKY13、CcWRKY27、CcWRKY31、CcWRKY32、CcWRKY67、CcWRKY77和CcWRKY80的表達(dá)水平在鹽脅迫和干旱脅迫條件下有顯著變化(P<0.05)，表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族參與了木豆響應(yīng)非生物脅迫的過程[89]。中間錦雞兒(Caragana intermedia)的CiWRKY75-1蛋白可以降低植物的干旱脅迫耐受性，而CiWRKY40-4蛋白可以延遲植物葉片衰老，這兩個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子為深入研究中間錦雞兒響應(yīng)干旱脅迫及其葉片衰老機(jī)制提供了切入點(diǎn)，有助于深入探索中間錦雞兒的生長發(fā)育過程和抗逆機(jī)理[90]。

表1 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在牧草中的生物學(xué)功能Table 1 Functionsof WRKY TFsin pasture plants

目前一些珍稀瀕危荒漠牧草的WRKY 轉(zhuǎn)錄因子同樣被進(jìn)行了深入研究及利用，這些研究既保護(hù)了珍稀瀕?；哪敛菸锓N，維持了荒漠植被多樣性，又為培育優(yōu)良抗逆牧草品種提供了優(yōu)異的抗逆基因資源。例如，從荒漠中的重要牧草長葉紅砂(Reaumuria trigyna)中克隆獲得的RtWRKY1和RtWRKY23基因可以被多種非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，而RtWRKY1和RtWRKY23蛋白可以結(jié)合在CAT1、SOD1、POD、PRODH2下游非生物脅迫相關(guān)基因的啟動(dòng)子上，維持植物在鹽脅迫條件下的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，幫助植物抵抗鹽脅迫，這些研究結(jié)果有助于理解長葉紅砂響應(yīng)惡劣生境的分子機(jī)理，為長葉紅砂的保護(hù)工作奠定了基礎(chǔ)，并為牧草遺傳育種提供了優(yōu)異抗逆基因資源[63,100]。

另外，一些其他植物的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因也可以應(yīng)用于牧草遺傳育種，通過轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)手段提高牧草品質(zhì)。例如，小麥TaWRKY2基因在二穗短柄草中進(jìn)行過表達(dá)，通過調(diào)控病理相關(guān)蛋白基因的表達(dá)，提高了二穗短柄草對赤霉病的抵抗力[105]。在紫花苜蓿中異源表達(dá)野生大豆的GsWRKY20基因，通過降低轉(zhuǎn)基因苜蓿的Na+/K+和氣孔密度，提高了轉(zhuǎn)基因苜蓿對鹽脅迫和干旱脅迫的耐受性，獲得了紫花苜?？购敌缕贩N[103]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族在牧草中的研究，有助于我們深入理解牧草抵抗惡劣生境及其他生物侵?jǐn)_的分子機(jī)制，為保護(hù)珍稀野生牧草品種、培育優(yōu)良牧草品種及恢復(fù)草地生態(tài)環(huán)境奠定了基礎(chǔ)。

6 小結(jié)

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族廣泛存在于多種植物中，例如擬南芥、水稻、小麥、番茄、玉米、棉花、菊花等。有關(guān)WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族的研究已有很多，大量研究表明WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育、響應(yīng)生物和非生物脅迫過程中起到了重要的調(diào)控作用，可以從多種途徑來提高或者降低植物對生物和非生物脅迫的耐受性，深入研究WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制有助于了解植物生長發(fā)育以及響應(yīng)多種脅迫過程的分子機(jī)理。然而，目前關(guān)于WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的研究多集中在模式植物和園藝植物中，而關(guān)于野生珍稀荒漠植物體內(nèi)WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)研究較少。相對于模式植物和園藝植物，自然界中許多野生珍稀荒漠植物對各種生物和非生物脅迫具有更高的耐受性，因此深入研究野生植物體內(nèi)WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)理，可能會為我們探索WRKY 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控功能提供新的視角，對深入理解植物響應(yīng)生物脅迫及非生物脅迫的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。