占今舜，霍俊宏，詹 康，趙國琦，武艷平，馬月輝

（1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,江西南昌 330200；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100093；3.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225009）

槲皮素是一種廣泛存在于植物的花、葉和果實(shí)中的多羥基黃酮類化合物，具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗腫瘤等生物功能[1]。在肉羊飼糧中添加槲皮素，能夠調(diào)控瘤胃菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵，提高營養(yǎng)物質(zhì)消化率，進(jìn)而提高飼料利用率；能夠提高機(jī)體抗氧化能力和免疫力，改善肉品質(zhì)[2-4]。瘤胃是反芻動(dòng)物營養(yǎng)消化和吸收的主要場所，瘤胃上皮在營養(yǎng)物質(zhì)吸收和運(yùn)輸、瘤胃壁保護(hù)等方面發(fā)揮重要的生理作用[5]。反芻動(dòng)物采食高比例易發(fā)酵的碳水化合物飼糧后，可能會出現(xiàn)瘤胃酸中毒，促使瘤胃脂多糖(LPS)濃度升高，導(dǎo)致瘤胃上皮屏障受損，引發(fā)消化道內(nèi)源LPS移位，進(jìn)而引發(fā)宿主炎癥[3]。給山羊飼喂高精料(精粗比75∶25)飼糧中添加槲皮素，能夠下調(diào)山羊肝臟和蹄組織炎癥因子(IL-1β、TNF-α)基因表達(dá)水平，增加肝臟IL-10的表達(dá)水平。有研究結(jié)果表明，槲皮素能夠提高山羊組織的抗炎能力，有預(yù)防蹄葉炎的作用[6]。體外研究發(fā)現(xiàn)，LPS能夠抑制山羊瘤胃上皮細(xì)胞增殖，上調(diào)細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[7]。前期研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿黃酮和苜蓿素等黃酮類化合物能夠通過調(diào)控TLR/MyD88信號通路來緩解LPS誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的炎癥損傷[8-9]。然而，槲皮素是否能夠保護(hù)山羊瘤胃上皮細(xì)胞免受炎性損傷尚不清楚。因此，研究槲皮素對LPS刺激下山羊瘤胃上皮細(xì)胞抗氧化和抗炎癥的影響，可以為今后合理利用槲皮素來緩解反芻動(dòng)物瘤胃酸中毒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

槲皮素(HPLC≥99%)和脂多糖(LPS，血清型O55:B5)均購于美國Sigma 公司，細(xì)胞培養(yǎng)級的二甲基亞砜(DMSO)購于北京索萊寶公司；試驗(yàn)所用原代瘤胃上皮細(xì)胞來自波爾山羊，由揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物培養(yǎng)物保藏與應(yīng)用研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞活性檢測

試驗(yàn)于2019年9月開始，細(xì)胞活性采用CCK-8法進(jìn)行檢測。將山羊瘤胃上皮細(xì)胞接種到96孔板中，每孔數(shù)量為1×105個(gè)·mL?1，細(xì)胞在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，去除培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗后加入分別含0、5、10、20、40、60、80、120、160和320μg·mL?1槲皮素的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每組5個(gè)重復(fù)，其中槲皮素用DMSO溶解，每組的DMSO含量為1‰。細(xì)胞培養(yǎng)6 h 后，每孔中加入10μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育3 h 后，用酶標(biāo)儀測定450 nm 處的吸光值，然后計(jì)算細(xì)胞活性。以此確定下一步槲皮素試驗(yàn)的最佳濃度。

1.2.2抗氧化指標(biāo)的測定

取密度為5×105個(gè)·mL?1細(xì)胞接種到六孔板，待細(xì)胞貼壁后，去除培養(yǎng)基，PBS清洗后加入DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基(對照組，Con)以及DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基[分別加入1μg·mL?1的LPS(L)、80 μg·mL?1槲皮素(Q)和1 μg·mL?1的LPS + 80 μg·mL?1槲皮素(L + Q)]中，每組5個(gè)重復(fù)，其中槲皮素用DMSO溶解，每組的DMSO含量為1‰。細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)6 h，然后收集細(xì)胞。根據(jù)試劑盒(南京建成生物工程研究所)中的說明書進(jìn)行總抗氧化力(total antioxidant capacity，T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathion peroxidase，GSH-PX)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)等指標(biāo)的測定。

1.2.3基因相對表達(dá)的檢測

試驗(yàn)分組和細(xì)胞培養(yǎng)方法同1.2.2。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，然后直接加入1 mL的Trizol，混勻靜置5～10 min。RNA 提取參照試劑盒(天根生化科技有限公司)中說明書上的方法進(jìn)行。RNA 提取后采用One Drop儀器進(jìn)行總RNA 的濃度和純度的檢測，采用Roche 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA 的合成，然后按照RT-PCR 試劑盒中試驗(yàn)方法進(jìn)行PCR 反 應(yīng) 液 的 配 制，在Light Cycler?96 PCR 儀(Roche公司)上進(jìn)行PCR 檢測。操作方法、反應(yīng)體系和反應(yīng)液配制參照占今舜等[8]。試驗(yàn)所需引物根據(jù)Gene Bank 中的基因序列，由Invitrogen 公司合成。引物序列如表1所列。

表1 引物序列與參數(shù)Table 1 Sequencesand detailsof the primersused in thisstudy

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先用Excle 2007進(jìn)行預(yù)處理，基因相對表達(dá)量采用2?△△Ct方法進(jìn)行計(jì)算。然后用SPSS 21.0軟件進(jìn)行ANOVA 分析，LSD法進(jìn)行多重比較，以P<0.01表示差異極顯著，P< 0.05表示差異顯著。結(jié)果用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素對山羊瘤胃上皮細(xì)胞活性的影響

添加5～320μg·mL?1槲皮素均能顯著增加山羊瘤胃上皮細(xì)胞的活性(P<0.05)(圖1)。隨著槲皮素添加水平的升高，細(xì)胞活性呈先增加后下降的趨勢，其中80μg·mL?1槲皮素組的細(xì)胞活性最高。結(jié)果表明，槲皮素能夠增加山羊瘤胃上皮細(xì)胞的活性。本研究選擇濃度為80μg·mL?1槲皮素開展后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 槲皮素對山羊瘤胃上皮細(xì)胞相對活性的影響Figure 1 Effects of quercetin on the relative activity of goat rumen epithelial cells

2.2 槲皮素對脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮細(xì)胞氧化性能的影響

如表2所列，Q組和L + Q組細(xì)胞的T-AOC、GSH-PX 活性極顯著高于其他兩組(P<0.01)。Con組和L +Q組細(xì)胞的CAT活性極顯著高于L 組(P<0.01)，Con 組CAT活性極顯著低于Q組(P<0.01)，Con 組和L +Q組細(xì)胞的SOD活性顯著高于L 組(P<0.05)，但極顯著低于Q組(P<0.01)。L 組和L +Q組細(xì)胞的MDA 含量顯著高于其他兩組(P<0.05)，Q組最低。結(jié)果表明，槲皮素能夠增加山羊瘤胃上皮細(xì)胞的抗氧化能力。

表2 槲皮素對脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的影響Table 2 Effects of quercetin on the antioxidant indices of goat rumen epithelial cellsstimulated by lipopolysaccharide

2.3 槲皮素對脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)的影響

如表3所列，Con 組和Q組細(xì)胞CXCL6、CXCL8、IL-6、TNF-α和IL-1β的mRNA 相對表達(dá)量極顯著低于L 組和L+Q組(P<0.01)，以L 組表達(dá)量最高。L組和L +Q組細(xì)胞CCL5的mRNA 相對表達(dá)量極顯著高于Con 組和Q組(P<0.01)，以Q組最低。Q組和L +Q組細(xì)胞IK的mRNA 相對表達(dá)量極顯著低于L 組和Con 組(P<0.01)，以L組表達(dá)量最高。以上結(jié)果表明，槲皮素具有抑制與炎癥相關(guān)細(xì)胞因子基因的表達(dá)。

表3 槲皮素對脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)的影響Table 3 Effect of quercetin on themRNA expression of cytokinesin goat rumen epithelial cells stimulated by lipopolysaccharide

2.4 槲皮素對脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮細(xì)胞調(diào)控因子mRNA 表達(dá)的影響

如表4所列，L組細(xì)胞TLR 2和TLR 4的mRNA相對表達(dá)量極顯著高于Q和L +Q組(P<0.01)，Q和L+Q組之間無顯著差異(P>0.05)。L組細(xì)胞NF-κB和MyD 88的mRNA 相對表達(dá)量極顯著高于其他3組(P<0.01)，L +Q組極顯著高于其他兩組(P<0.01)。L 組細(xì)胞TOLLIR的mRNA 相對表達(dá)量極顯著高于Q和L +Q 組(P<0.01)，但與Con 組無顯著差異(P>0.05)。L組細(xì)胞IRF3和IFIT 3的mRNA 相對表達(dá)量顯著高于Q組(P<0.05)，但各處理組細(xì)胞UXT的mRNA 相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。以上結(jié)果表明，槲皮素能夠下調(diào)TLR/MyD88/NF-κB 信號通路相關(guān)基因的表達(dá)。

表4 槲皮素對脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮細(xì)胞調(diào)控因子mRNA 表達(dá)的影響Table4 Effectsof quercetin on the mRNA expression of regulatory factorsin goat rumen epithelial cellsstimulated by lipopolysaccharide

3 討論

3.1 槲皮素對山羊瘤胃上皮細(xì)胞活性的影響

通過體外細(xì)胞培養(yǎng)方法研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類物質(zhì)如大豆異黃酮、辣木葉黃酮和苜蓿素等均能夠增加乳腺上皮細(xì)胞的活力和促進(jìn)細(xì)胞增殖[10-12]。結(jié)果表明，黃酮類物質(zhì)能夠增加細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖。槲皮素是植物中比較常見的黃酮類物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠增加豬小腸上皮細(xì)胞和奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活力，促進(jìn)細(xì)胞增殖[13-14]。本研究也得到相似結(jié)果，說明槲皮素有促進(jìn)山羊瘤胃上皮細(xì)胞增殖的作用。

3.2 槲皮素對脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮細(xì)胞氧化性能的影響

黃酮類化合物通過釋放的氫離子能夠與活性氧相結(jié)合而直接清除自由基，通過抑制氧化酶的活性和提高防御酶的活性來清除自由基，通過螯合作用、減少金屬離子誘導(dǎo)自由基等來發(fā)揮抗氧化作用[15]。黃思瑩等[16]以桑(Morus alba)葉槲皮素為研究對象，探索其對D-半乳糖衰老小鼠抗氧化能力的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，桑葉槲皮素高劑量組能夠提高小鼠血清T-AOC水平、GSH-Px 和SOD的活性，顯著降低MDA 含量。楊璐愷等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍保護(hù)劑中添加槲皮素能夠提高羊卵巢組織的CAT 活性。本研究結(jié)果與其相似，結(jié)果表明，槲皮素能夠提高山羊瘤胃上皮細(xì)胞的抗氧化能力。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜的主要成分，在體內(nèi)通過細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)激活上皮細(xì)胞合成和釋放細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，抑制抗氧化酶類的活性，導(dǎo)致脂質(zhì)氧化，產(chǎn)生活性氧自由基等，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞氧化損傷[18]。研究發(fā)現(xiàn)，LPS能夠降低奶牛乳腺上皮細(xì)胞和人腎小球上皮細(xì)胞SOD的活性，升高M(jìn)DA 的含量[19-20]。本研究得到相似的結(jié)果，表明LPS能夠誘導(dǎo)山羊瘤胃上皮細(xì)胞的氧化損傷。在本研究中，LPS刺激下添加槲皮素能夠顯著提高細(xì)胞T-AOC、CAT、SOD和GSH-PX 的活性，結(jié)果表明，槲皮素能夠提高抗氧化酶類活性來緩解LPS誘導(dǎo)山羊瘤胃上皮細(xì)胞的氧化損傷。

3.3 槲皮素對脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響

LPS 是革蘭性陰性菌細(xì)胞壁成分，當(dāng)細(xì)菌死亡溶解時(shí)，其釋放出來會誘導(dǎo)細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)參與炎癥反應(yīng)[21]。帕提古麗[7]研究體外LPS誘導(dǎo)山羊瘤胃上皮細(xì)胞損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS顯著提高了細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA 表達(dá)，本研究結(jié)果與其一致。槲皮素、柚皮素、蘆丁和苜蓿黃酮等黃酮類物質(zhì)能夠降低單核細(xì)胞和奶牛乳腺 上 皮 細(xì) 胞 炎 癥 因 子TNF-α、IL-6和IL-1β基因的表達(dá)[8,22]。本研究得到相似結(jié)果，說明槲皮素能夠抑制炎癥反應(yīng)。主要組織相容性復(fù)合體II(MHCII)抗原大多位于抗原提呈細(xì)胞(APC)上，如巨噬細(xì)胞等。當(dāng)細(xì)菌侵入組織時(shí)，巨噬細(xì)胞吞食細(xì)菌后，并將細(xì)菌碎片利用主要組織相容性復(fù)合體(MHC)提示給輔助T 細(xì)胞，啟動(dòng)免疫反應(yīng)。IK 細(xì)胞因子能夠抑制MHCII抗原的表達(dá)和由IFN-γ 誘導(dǎo)的MHC II 抗原的表達(dá)[23]。從本研究結(jié)果來看，LPS能夠促進(jìn)山羊瘤胃上皮細(xì)胞的自身免疫反應(yīng)，而槲皮素具有抑制細(xì)胞自身免疫的作用。趨化因子是一類由細(xì)胞分泌，具有誘導(dǎo)附近反應(yīng)細(xì)胞定向趨化能力的細(xì)胞因子，分為CXC、CC、CX3C和C4類[24]。CCL5具有調(diào)節(jié)正常T 細(xì)胞表達(dá)和分泌的細(xì)胞因子，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的釋放的作用[25]。CXCL6由巨噬細(xì)胞和上皮及間質(zhì)細(xì)胞等分泌，具有趨化粒細(xì)胞、促血管生成、抗菌和調(diào)節(jié)免疫等功能。IL-1β、TNF-α 和LPS均能誘導(dǎo)CXCL6表達(dá)，其中IL-1β是CXCL6的主要誘導(dǎo)劑[26]。CXCL8為中性粒細(xì)胞趨化因子，它可以誘導(dǎo)靶細(xì)胞向感染部位趨化，是一種促炎趨化因子[27]。LPS能夠刺激趨化因子的表達(dá)，而槲皮素則抑制趨化因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制炎癥的產(chǎn)生。

3.4 槲皮素對脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮細(xì)胞調(diào)控因子基因表達(dá)的影響

Toll 樣受體(TLRs)是一類廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，可以識別病原微生物的蛋白質(zhì)、核酸、脂類以及代謝產(chǎn)物等物質(zhì)，激活銜接蛋白，啟動(dòng)下游信號傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子及趨化因子，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[28]。TLR2和TLR4能識別微生物的脂蛋白和LPS。激活TLRs介導(dǎo)的信號通路需要MyD88、MyD88樣銜接蛋白、誘導(dǎo)β干擾素的TIR 結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TRIF)等銜接蛋白的參與。TLR2和TLR4需要MyD88和含TIR結(jié)構(gòu)域的銜接蛋白的共同作用，引起NF-κB活化，誘導(dǎo)IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎性細(xì)胞因子的分泌和干擾素的表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)[29]。另外，TLR2和TLR4還可以通過招募TRIF蛋白分子，激活I(lǐng)RF3蛋白分子，繼而進(jìn)入細(xì)胞核并誘導(dǎo)一系列相關(guān)炎癥因子的分泌[30]。IFIT 家族蛋白參與蛋白之間的相互作用，并行使起始翻譯、識別雙鏈RNA、參與細(xì)胞遷徙及增殖等多種功能。通常該家族分子在大多數(shù)細(xì)胞中表達(dá)量較低，但在LPS刺激可以強(qiáng)烈誘導(dǎo)其表達(dá)，其中IFIT3 能夠在體內(nèi)和體外促進(jìn)IFN 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[31]。從本研究結(jié)果來看，槲皮素能夠抑制TLR2、TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的激活，進(jìn)而抑制炎性細(xì)胞因子的分泌，發(fā)揮抗炎癥作用。泛表達(dá)轉(zhuǎn)錄子(UXT)蛋白主要在細(xì)胞核，可以與NF-κB形成信號依賴性動(dòng)態(tài)復(fù)合體，促進(jìn)NF-κB增強(qiáng)體形成的核分子伴侶[32]。本研究結(jié)果表明，槲皮素不會影響UXT 調(diào)控NF-κB 信號通路的功能。

4 結(jié)論

槲皮素能夠提高山羊瘤胃上皮細(xì)胞活性，通過提高抗氧化酶類的活性和調(diào)節(jié)TLR/MyD88/NF-κB信號通路抑制炎性細(xì)胞因子的分泌來緩解LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。