黃 杰， 張郎織， 邢玉芬， 鄒曉燕， 劉國(guó)道， 虞道耿*， 陳志堅(jiān)*

(1. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海南 海口 571101；2. 海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院， 海南 ?？?570228)

磷(Phosphorus，P)是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素之一，是組成脫氧核糖核酸、腺苷三磷酸和脂質(zhì)等物質(zhì)的重要元素[1-2]。并且，磷參與植株光合作用、呼吸作用、能量代謝和信號(hào)傳遞等關(guān)鍵的生理生化過(guò)程，調(diào)控植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育[3-5]。在自然界中，土壤中的磷主要以難溶性無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷形式存在，不能被植物直接吸收和利用[6]。因此，缺磷脅迫會(huì)導(dǎo)致植物出現(xiàn)一系列的癥狀，如植株矮小，生長(zhǎng)緩慢，葉色暗綠和根系發(fā)育受阻等，從而嚴(yán)重限制了作物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量[7]。在傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，雖然通過(guò)施用磷肥可以有效的促進(jìn)作物生長(zhǎng)和增加產(chǎn)量，但是，過(guò)量施肥可能會(huì)導(dǎo)致磷肥流失、水體富營(yíng)養(yǎng)化和土壤生產(chǎn)力降低等問(wèn)題[8]。因此，培育磷高效吸收和利用的作物品種是降低磷肥投入的重要舉措。

為了適應(yīng)低磷脅迫環(huán)境，植物在進(jìn)化過(guò)程中形成了多種調(diào)節(jié)磷吸收和磷平衡的策略。例如，通過(guò)改變根系形態(tài)和構(gòu)型增加與土壤的接觸面積[9-10]、通過(guò)誘導(dǎo)高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)來(lái)提高根系對(duì)土壤磷的吸收[11]、通過(guò)分泌有機(jī)酸和酸性磷酸酶(Acid phosphatase，ACP)來(lái)活化利用土壤難溶性有機(jī)磷[12-13]、通過(guò)調(diào)控磷信號(hào)網(wǎng)絡(luò)維持細(xì)胞磷平衡[14]。ACP是一種能水解單磷酸酯鍵釋放無(wú)機(jī)磷的水解酶類(lèi)，其活性的提高被認(rèn)為是植物適應(yīng)低磷脅迫的重要機(jī)制[15]。一般認(rèn)為，植物根系分泌的酸性磷酸酶能夠水解土壤有機(jī)磷，增加植物對(duì)土壤有機(jī)磷的利用[16]。另外，酸性磷酸酶也能活化利用植物組織中的有機(jī)磷，促進(jìn)磷的再利用[17]。研究表明，低磷脅迫顯著增加了水稻(Oryzasativa)、大豆(Glycinemax)、鷹嘴豆(Cicerarietnum)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)等植物的酸性磷酸酶活性，從而有助于促進(jìn)植物對(duì)磷的活化利用[18-21]。

‘崖州硬皮豆’(‘Macrotylomauniflorum(Lam.) Verdc. Yazhou’)為豆科硬皮豆屬一年生草本植物，莖葉柔軟，適口性好，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是草食家畜的優(yōu)質(zhì)飼料?！轮萦财ざ埂?015年通過(guò)全國(guó)草品種審定委員會(huì)審定登記為地方品種?！轮萦财ざ埂哂懈蛋l(fā)達(dá)、抗旱和耐貧瘠等特點(diǎn)，被認(rèn)為是優(yōu)良的豆科綠肥，也是常規(guī)和基因工程育種的潛在材料[22]。然而，以往研究主要對(duì)硬皮豆的生物學(xué)特性和栽培技術(shù)進(jìn)行了摸索，對(duì)硬皮豆響應(yīng)低磷脅迫的研究未見(jiàn)報(bào)道，對(duì)其適應(yīng)低磷脅迫的生理機(jī)制了解甚少。因此，本研究以‘崖州硬皮豆’為材料，通過(guò)分析不同外源磷濃度處理對(duì)硬皮豆生長(zhǎng)和酸性磷酸酶活性等生理特性的影響，以探討硬皮豆響應(yīng)低磷脅迫的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

‘崖州硬皮豆’種子由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草研究室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1植物材料培養(yǎng)與處理 參考賈怡丹等[23]方法，將硬皮豆種子在濕潤(rùn)的濾紙上萌發(fā)5 d后，長(zhǎng)成的幼苗在1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中預(yù)培養(yǎng)15 d，對(duì)幼苗進(jìn)行3個(gè)不同磷濃度水培處理[24]，磷濃度分別為5 μM，100 μM和250 μM KH2PO4，每個(gè)處理包括4個(gè)生物學(xué)重復(fù)。處理21 d后，收獲地上部和根部樣品，測(cè)定生物量、根系性狀、磷含量和酸性磷酸酶活性。樣品于75℃烘干，待烘干到恒重時(shí)測(cè)定干重和磷含量。收取成熟葉片和根系材料，用液氮速凍，用于測(cè)定細(xì)胞壁磷含量以及酸性磷酸酶活性。

1.2.2葉片及根系性狀分析 通過(guò)掃描儀12000XL(EPSON，中國(guó))掃描葉片和根系圖片，采用圖像分析軟件WinRhizo Pro(Regent Instruments，加拿大)計(jì)算葉面積、總根長(zhǎng)、根表面積和根體積[25]。

1.2.3植株磷含量測(cè)定 將硬皮豆地上部和根系樣品置于烘箱中105℃殺青30 min，75℃烘干至恒重，將樣品磨碎，稱(chēng)取0.1 g干樣，加入3 mL濃硫酸靜置過(guò)夜，375℃消煮2 h，然后參照Murphy和Riley[26]方法測(cè)定磷含量，即取500 μL上清液，加入0.5 mL鉬銻抗顯色液，再用ddH2O定容到5 mL，室溫反應(yīng)30 min后，于分光光度計(jì)(Hitachi，日本)中測(cè)定OD700吸光值。

1.2.4可溶性磷含量測(cè)定 稱(chēng)取0.16 g地上部或根部系樣品，加入預(yù)冷的1.2 mL 100 mM Tris-HCl(pH 7.0)提取液，充分研磨，4℃下12 000 rpm離心20 min，收集上清液。然后參照Murphy和Riley[26]用鉬銻抗顯色法測(cè)定磷含量。

1.2.5細(xì)胞壁分離和細(xì)胞壁磷含量測(cè)定 參考Zhu等[27]方法分離細(xì)胞壁，并作適當(dāng)修改，即稱(chēng)取0.15 g葉片和根系樣品，加入預(yù)冷的1 mL 75%乙醇充分研磨破碎組織細(xì)胞，冰浴20 min，4℃下12 000 rpm離心15 min后，去上清，收集沉淀。然后，依次用預(yù)冷的丙酮、乙醇/三氯甲烷混合液(v/v=1/1)、甲醇洗滌沉淀。每一步洗滌完成后，4℃下12 000 rpm離心15 min，并最終收集沉淀為細(xì)胞壁提取物。稱(chēng)取5 mg細(xì)胞壁提取物，加入1 mL 2 mM HCl，于搖床上震蕩混勻48 h。4℃下14 000 rpm離心30 min，收集上清液。取100 μL上清液用鉬銻抗顯色法測(cè)定細(xì)胞壁磷含量。細(xì)胞壁磷含量以單位鮮重細(xì)胞壁(mg CW)所含的磷(μg P)來(lái)計(jì)算。

1.2.6細(xì)胞壁蛋白的提取以及酸性磷酸酶(ACP)活性測(cè)定 參照Farhadi等[21]方法提取細(xì)胞壁蛋白，稱(chēng)取0.16 g樣品，加入預(yù)冷的1.5 mL 25 mM TES/KOH緩沖液(含10 mM MgCl2，1 mM EDTA，1 mM二硫酥糖醇，1% Triton X-100，1%聚乙烯吡咯烷酮，pH 7.4)充分研磨，4℃下14 000 rpm離心30 min收集沉淀，然后用TES/KOH緩沖液重復(fù)洗滌沉淀3次。4℃下14 000 rpm離心30 min收集沉淀。加入預(yù)冷的1.5 mL 0.5 mM醋酸/NaOH緩沖液(含0.2 M CaCl2，pH4.6)充分研磨，4℃下18 000 rpm離心30 min，收集蛋白上清液。參照Mehdi等[13]方法測(cè)定ACP活性，取100 μL蛋白上清液，加入1.8 mL磷酸酶底物緩沖液，緩沖液含有45 mM醋酸/醋酸鈉(pH 5.0)和1 mM對(duì)硝基苯磷酸環(huán)己胺(ρ-NPP)，補(bǔ)充ddH2O至反應(yīng)體積2 mL，充分混勻，37℃反應(yīng)15 min，然后加入1 mL 1 M NaOH溶液終止反應(yīng)。12 000 rpm離心5 min，收集上清液，測(cè)定OD405吸光值，ACP活性以每分鐘每毫克蛋白水解ρ-NPP的量(μmol)計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤計(jì)算，采用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件(V23.0，SPSS Institute，美國(guó))進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同磷濃度處理對(duì)硬皮豆地上部生長(zhǎng)的影響

從圖1A可以看出，相對(duì)100 μM和250 μM磷處理，5 μM低磷處理抑制了硬皮豆地上部的生長(zhǎng)和發(fā)育，主要表現(xiàn)為植株矮小、復(fù)葉數(shù)減少、葉片發(fā)育受阻。與100 μM和250 μM磷處理相比較，低磷(5 μM)處理下的硬皮豆株高分別降低31.2%和19.7%，復(fù)葉數(shù)減少47.4%和60%，葉面積減少28.4%和22.4%(圖1B-D)。另外，在100 μM磷處理下的株高和葉面積最大，而250 μM磷處理下的復(fù)葉數(shù)最多(圖1B-D)。以上結(jié)果表明，5 μM低磷脅迫顯著抑制了硬皮豆地上部的生長(zhǎng)，而100～250 μM磷濃度處理能維持硬皮豆正常生長(zhǎng)。

圖1 不同磷濃度處理對(duì)硬皮豆地上部生長(zhǎng)的影響

2.2 不同磷濃度處理對(duì)硬皮豆根系生長(zhǎng)的影響

由圖2A所示，5 μM磷處理抑制了硬皮豆根系的生長(zhǎng)，主要抑制了總根長(zhǎng)、根表面積和根體積。與100 μM和250 μM磷處理相比，5 μM磷處理下硬皮豆總根長(zhǎng)分別下降30.7%和35.9%，根表面積減少32.4%和36.8%，根體積下降31.9%和37.9%(圖2B-D)。然而，5 μM磷處理促進(jìn)了硬皮豆主根的生長(zhǎng)，5 μM磷處理下的主根長(zhǎng)是100 μM和250 μM磷處理下的1.2 倍(圖2E)。

圖2 不同磷濃度處理對(duì)硬皮豆根系生長(zhǎng)的影響

2.3 不同磷處理對(duì)硬皮豆干重及磷含量的影響

由圖3所示，5 μM低磷處理顯著降低了硬皮豆地上部和根部干重。在5 μM磷處理下，硬皮豆地上部和根部干重分別只有250 μM磷處理下的37.7%和68.9%，而硬皮豆地上部或根部干重在100 μM和250 μM磷處理下，差異不顯著(圖3A和B)。此外，5 μM磷處理顯著降低了地上部和根部磷含量。與250 μM磷處理相比，5 μM磷處理下的地上部和根系含量分別減少了80.3%和77.3%(圖3C和D)。100 μM和250 μM磷處理間，地上部磷含量差異不顯著；然而，在250 μM磷處理下根部的磷含量是100 μM磷處理下的1.4倍(圖3C和D)。

圖3 不同磷處理對(duì)硬皮干重及磷濃度的影響

2.4 不同磷濃度處理對(duì)硬皮豆葉片和根系可溶性磷及細(xì)胞壁磷濃度的影響

本研究進(jìn)一步比較分析了不同磷濃度處理對(duì)硬皮豆葉片和根系可溶性磷及細(xì)胞壁磷濃度的影響。結(jié)果表明，5 μM低磷處理顯著降低了硬皮豆葉片和根系的可溶性磷濃度(圖4)。5 μM磷處理下的葉片和根系可溶性磷濃度分別為250 μM磷處理下的10.4%和9.7%，然而，葉片或根系可溶性磷濃度在100 μM和250 μM磷處理下差異不顯著(圖4A和B)。同樣，5 μM磷處理顯著降低了葉片和根系細(xì)胞壁磷濃度。5 μM磷處理下的葉片和根系細(xì)胞壁濃度分別為250 μM磷處理下的2.1%和20.9%(圖4C和D)。此外，250 μM磷處理下葉片和根系細(xì)胞壁磷濃度顯著高于100 μM磷處理下的葉片和根系細(xì)胞壁磷濃度(圖4C和D)。

圖4 不同磷處理對(duì)硬皮豆可溶性磷及細(xì)胞壁磷濃度的影響

2.5 不同磷濃度處理對(duì)硬皮豆葉片和根系及其細(xì)胞壁ACP活性的影響

由圖5A和B可知，隨著磷處理濃度的增加，硬皮豆葉片和根系總ACP活性逐漸降低，5 μM磷處理顯著提高了葉片和根系A(chǔ)CP活性。在5 μM磷處理下，葉片、根系A(chǔ)CP活性分別是100 μM和250 μM磷處理下的1.4，1.6倍和1.4，1.5倍。硬皮豆葉片和根系細(xì)胞壁ACP活性隨磷處理濃度的增加而降低。在5 μM磷處理下，葉片細(xì)胞壁ACP活性最高，是250 μM磷條件下的1.2倍，而根系細(xì)胞壁ACP活性是250 μM磷條件下的1.3倍(圖5C和D)。

圖5 不同磷處理對(duì)崖州硬皮豆葉片和根系及其細(xì)胞壁ACP活性的影響

3 討論

磷是維持植物正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，低磷脅迫抑制植物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量。本研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)100 μM和250 μM磷處理，5 μM低磷處理顯著抑制了硬皮豆的生長(zhǎng)，降低了株高、復(fù)葉數(shù)和葉面積，并降低了植株干重(圖1-2)。同樣，低磷處理也抑制了小麥(Triticumaestivum)[28]、柳枝稷(Panicumvirgatum)[29]和玉米(Zeamays)[30]的生長(zhǎng)，說(shuō)明硬皮豆的生長(zhǎng)受到外源磷有效性的影響。另外，100 μM和250 μM外源磷處理下硬皮豆地上部的磷含量差異不顯著，但是，100 μM磷處理下根部的磷含量顯著低于250 μM磷處理下的磷含量(圖3)。在玉米(Zeamays)中的研究也發(fā)現(xiàn)，磷被根系吸收后會(huì)向葉片轉(zhuǎn)運(yùn)，并在葉片中積累[31]。因此，在低磷脅迫下，硬皮豆根系吸收的磷可能被轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部，優(yōu)先滿(mǎn)足地上部生長(zhǎng)對(duì)磷素的需求。

在應(yīng)對(duì)低磷脅迫過(guò)程中，植物形成了如改變根系形態(tài)構(gòu)型等適應(yīng)性機(jī)制，進(jìn)而增加了對(duì)土壤磷的吸收和利用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，在大豆和玉米中，低磷脅迫會(huì)促進(jìn)主根的生長(zhǎng)來(lái)擴(kuò)大根系與土壤的接觸面積，從而提高磷的吸收效率[32-33]，而白羽扇豆(Lupinusalbus)會(huì)通過(guò)減少主根長(zhǎng)度，增加側(cè)根數(shù)量和密度，并形成排根來(lái)應(yīng)對(duì)低磷脅迫[34]。同樣，本研究發(fā)現(xiàn)，雖然5 μM低磷處理抑制了硬皮豆總根長(zhǎng)、根表面積和根體積，但是，低磷處理促進(jìn)了主根的生長(zhǎng)(圖2)，這可能有利于硬皮豆吸收更多的磷。

在低磷脅迫下，植物可以通過(guò)分泌酸性磷酸酶來(lái)活化利用土壤和植物組織中的有機(jī)磷，從而增加細(xì)胞磷有效性[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，低磷處理顯著提高了硬皮豆葉片和根系總ACP活性(圖5)。同樣，低磷脅迫也顯著增加了水稻、大豆和鷹嘴豆等植物的ACP活性[18-20]。另外，隨著葉片和根系細(xì)胞壁磷有效性的降低，硬皮豆葉片和根系細(xì)胞壁ACP活性顯著提高(圖4和5)，暗示硬皮豆組織中的細(xì)胞壁磷可能被活化，并進(jìn)一步被代謝活動(dòng)所利用。在柱花草(Stylosanthesguianensis)中的研究發(fā)現(xiàn)，低磷脅迫顯著增加了葉片和根系細(xì)胞壁的ACP活性，且磷高效柱花草基因型中細(xì)胞壁ACP活性顯著高于磷低效柱花草基因型[35]。并且，在大豆和擬南芥中已經(jīng)鑒定到了多個(gè)細(xì)胞壁定位的ACP[19,36]。因此，增加ACP活性可能是硬皮豆適應(yīng)低磷脅迫的重要生理變化。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)低磷脅迫抑制了硬皮豆的株高、復(fù)葉數(shù)、葉面積等，并降低了植株磷含量和細(xì)胞壁磷濃度，從而抑制植株的生長(zhǎng)。在低磷脅迫條件下，硬皮豆可以通過(guò)促進(jìn)主根生長(zhǎng)、提高葉片和根系總酸性磷酸酶活性，以及增加葉片和根系細(xì)胞壁的酸性磷酸酶活性來(lái)適應(yīng)低磷脅迫環(huán)境。增加酸性磷酸酶活性可能有利于硬皮豆對(duì)細(xì)胞中貯存磷的活化利用，從而滿(mǎn)足植株生長(zhǎng)對(duì)磷元素的需求。本研究結(jié)果為選育磷高效利用的硬皮豆新品種提供了重要的理論依據(jù)。