蔡偉雅，盧維玉，陳 曉，黃 燕，于毅鵬

(廈門理工學(xué)院 材料科學(xué)與工程學(xué)院，福建 廈門 361024)

碳點(Carbon Dots，CDs)是碳納米家族的新成員，因其尺寸優(yōu)勢，該納米材料具有較強的量子局限和邊緣效應(yīng)，以及類似于量子點和熒光染料的優(yōu)良發(fā)光性質(zhì)．CDs是Xu等[1]于2004年通過電泳的方法純化單壁碳納米管首次制得，其具備低毒性、良好的生物相容性，不僅可以用來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的碳量子點和熒光染料，而且可用于細胞成像等方面．因為碳點具有優(yōu)異的化學(xué)惰性、易官能團化以及上述優(yōu)點，所以其已成為燃料電池催化劑[2]、金屬離子傳感器[3]、陰離子傳感[4]、生物分析檢測[5]、生物成像[6]、光催化[7-8]等領(lǐng)域的研究熱點．因此，作為一種新興的納米材料，碳點具有廣闊的應(yīng)用前景．

熒光分析法是用所測得的熒光強度來測定實驗樣品熒光物質(zhì)的含量，而熒光強度不僅與熒光物質(zhì)的本性與溶度有關(guān)，還與激發(fā)波長和熒光儀器的檢測器靈敏度有關(guān)．加大激發(fā)強度，可以增強熒光強度，從而提高分析的靈敏度[9]．熒光分析法的靈敏度相較于一般分析法高出2～3個數(shù)量級，具有很強的選擇性．

本文主要討論了碳點和吖啶橙之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移的條件．以吖啶橙為熒光傳感器，檢測咖啡因，尋找碳點和吖啶橙之間的最佳比例．此外，所采用的熒光分析法檢測吖啶橙是基于熒光共振轉(zhuǎn)移原理．而熒光共振能量轉(zhuǎn)移是指化合物分子受到光激發(fā)后，分子內(nèi)部發(fā)生能量供體與能量受體之間的一種非輻射過程的能量轉(zhuǎn)移．

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

AB104-N電子天平(Mettler Toledo)；酸度計(美國Origin公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；KQ-300DB數(shù)控超聲波清洗器(祁山市超聲儀器有限公司)；RCT Basic恒溫磁力攪拌器(德國Zeiss公司)；FLS 920穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀(英國Edinburgh Instruments公司)；UV-2600紫外-可見分光光度計(日本Shimadzu公司)；F-3000熒光分光光度計(日本Hitachi公司)．

檸檬酸銨、高錳酸鉀、咖啡因、無水乙醇、丙酮、氯化鈉、鹽酸(國藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司)；吖啶橙(又稱為3，6-(二甲氨基)吖啶鹽酸鹽)(上海生工生物工程有限公司)．

1.2 碳點材料的合成

碳點制備參照文獻[10]的方法．將2 g檸檬酸銨溶于25 mL二次水中，等到檸檬酸銨固體全部溶解之后，將溶液轉(zhuǎn)移至50 mL聚四氟乙烯反應(yīng)釜內(nèi)襯中．隨后將反應(yīng)釜內(nèi)襯放入不銹鋼反應(yīng)釜外襯中，并轉(zhuǎn)移至烘箱．烘箱溫度設(shè)置為160 ℃，時間為6 h．待反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫．當取出反應(yīng)液時，溶液呈現(xiàn)深藍色，如圖1所示．

圖1 水熱法合成碳點樣品的流程

1.3 CDs-AO熒光探針的制備

將CDs溶液與吖啶橙溶液(Acridine orange，AO)按照一定比例混合，利用磁力攪拌器混合攪拌2.5 h，即可獲得CDs-AO熒光探針．

1.4 檢測咖啡因

取10 mL比色皿，加入4 mL的中性PBS緩沖液(pH=7)，再加入一定比率的碳點和吖啶橙，最后在比色皿中滴加一定濃度的咖啡因，用二次水定容至10 mL， 搖勻靜置一段時間，測定熒光強度ICDs與IAO．

2 結(jié)果與討論

2.1 碳點的物理表征

為了證明碳點的成功制備，對所合成碳點的形貌進行TEM表征，如圖2(a)所示．碳點溶液在室溫條件下，長期穩(wěn)定，沒有任何明顯的沉降．碳點樣品的透射電鏡圖顯示出較為均一的球形顆粒，碳點的粒徑集中分布在3.07 nm+0.55 nm范圍內(nèi)．與石墨烯不同的是，這些熒光碳點粒子可以自由分散在水中，實驗過程中沒必要再次超聲分散，因此，其被稱為“水溶性熒光碳點”．

圖2(b)為碳點X射線衍射表征結(jié)果，從圖2(b)可以看出，所測得的碳面晶間距為0.33 nm(或根據(jù)布拉格公式計算)，與石墨相(002)相似．由此可以斷定，所制備的熒光碳點顆粒是石墨相的碳納米顆粒．

圖2 (a)碳點的透射電鏡圖像，(b)碳點的X射線衍射圖

2.2 抗鹽性考察實驗

將一定量的碳點儲備液分配在8支比色管中，分別加入不同體積的NaCl溶液，定容至5 mL，使得其中的NaCl溶液的濃度分別為0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0 mol/L，將配置好的溶液搖勻靜置30 min后測定其熒光光譜．由圖3可見，碳點的熒光強度性質(zhì)基本保持穩(wěn)定．

圖3 碳點在不同濃度NaCl溶液中的熒光強度

2.3 抗光漂白性考察實驗

將制備好的碳點水溶液放在365 nm紫外燈下照射，每間隔一段時間就表征樣品的熒光性質(zhì)，實驗結(jié)果如圖4所示．在120 min內(nèi)，碳點的熒光強度基本保持不變，說明所合成的CDs很穩(wěn)定，幾乎沒有光漂白現(xiàn)象．

圖4 CDs熒光強度隨紫外光照時間變化曲線

2.4 碳點與吖啶橙之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移

圖5為碳點和發(fā)射光譜與吖啶橙的吸收光譜．從圖5看出，二者的重疊性很大．碳點在438 nm的位置具有較大發(fā)射信號峰，吖啶橙在490 nm具有最大吸收峰，存在很大一部分重疊．

圖5 吖啶橙的吸收光譜與CDs的發(fā)射光譜

2.5 酸堿度對檢測體系的影響

CDs-AO熒光探針與一定濃度的咖啡因在不同的酸堿條件下會有不同的響應(yīng)效果，實驗結(jié)果如圖6所示．在中性條件(pH=7)下，碳點和吖啶橙的熒光強度比值最大，說明咖啡因?qū)z測體系的熒光增強效果最好．因此，在后續(xù)研究過程中，均選用中性條件進行研究．

首先，選取吖啶橙濃度為1.0×10-4mol/L，加入不同濃度的碳點溶液，表征碳點與吖啶橙的熒光強度變化情況，實驗結(jié)果如圖7(a)所示．由圖7(a)可知，加入碳點后，碳點與吖啶橙的熒光強度變化依次增強．其次，確定碳點濃度為4.22×10-5mol/L，加入不同濃度的吖啶橙溶液，檢測吖啶橙溶液為單一變量的情況下的碳點與吖啶橙的熒光強度變化情況，實驗結(jié)果如圖7(b)所示．碳點的熒光信號峰在吖啶橙加入后逐漸減弱，而吖啶橙的熒光強度是先增強，當吖啶橙濃度超過160 μmol/L時，吖啶橙的熒光強度變?nèi)酰C合以上實驗結(jié)果說明，選擇合適的比率，碳點與吖啶橙之間會發(fā)生能量轉(zhuǎn)移．

以上實驗證明，控制CDs與AO的濃度比可以得到一系列不同的熒光強度比值．在之后的研究工作中，為了使體系中AO熒光增強效果明顯，選取4.2×10-5mol/L的CDs和8.0×10-4mol/L的AO混合制備的用于檢測咖啡因的熒光比率探針．

圖7 (a)AO在不同濃度CDs下的熒光強度與濃度的關(guān)系趨勢圖，(b)CDs在不同濃度AO下的熒光強度與濃度的關(guān)系趨勢圖

2.6 CDs-AO熒光比率探針對咖啡因的傳感

在上述實驗條件下，進一步研究了CDs-AO比率熒光探針檢測咖啡因的線性范圍和檢測限．從8(a)可知，加入不同濃度的咖啡因，CDs和AO的熒光光譜，隨著咖啡因濃度增大，CDs熒光強度基本不變，而AO熒光強度逐漸增強．此外，由圖8(b)可以看出，ICDs/IAO與咖啡因具有良好的線性關(guān)系，本方法的線性回歸方程為ICDs/IAO=0.001 0×C+0.553 0，式子中C的單位是μmol/L，檢測范圍6.0×10-6～8.0×10-4mol/L，檢測限為4.4×10-7mol/L (3SD/K)．

2.7 選擇性表征(共存物質(zhì)干擾)

在茶葉或者茶類飲料中，常見的主要成分有茶多酚、氨基酸、礦物質(zhì)以及咖啡因．在研究過程中，選用L-茶氨酸、兒茶素、沒食子酸以及常用的4種金屬離子作為干擾物質(zhì)(咖啡因濃度為10.0 μmol/L，L-茶氨酸、兒茶素、沒食子酸的濃度為50.0 μmol/L，K+、Na+、Ca2+、Mg2+的濃度為100.0 μmol/L)，見圖9．在這些干擾物質(zhì)共存下檢測咖啡因，經(jīng)過測試，沒有其他成分能夠使得吖啶橙熒光顯著增強．

圖8 (a)含有不同濃度咖啡因溶液的熒光光譜圖，(b)ICDs/IAO與咖啡因濃度的線性關(guān)系圖

圖9 在常見物質(zhì)共存下CDs-AO探針的選擇性

3 實際應(yīng)用與機理探討

為研究CDs-AO探針在實際生活中的應(yīng)用，選取荷花茶作為研究對象(荷花茶樣品如圖10(a)所示)，稱取2 g茶葉樣品于燒杯中，加入80 ℃的開水后靜置6 h，讓茶水冷卻至室溫，過濾掉溶液中的茶葉．按照之前所設(shè)計的實驗操作步驟檢測茶葉樣品中的咖啡因和金屬陽離子．從10(b)可知，樣品溶液中分別加入10.0 μmol/L咖啡因或者各類100.0 μmol/L的金屬陽離子，對CDs-AO探針檢測茶葉樣品中的咖啡因的性能影響較小，從而驗證了CDs-AO探針檢測茶葉中的咖啡因具有較好的選擇性和靈敏度．

AO溶液中的單體和二聚體之間存在化學(xué)平衡．然而，AO的單體有熒光峰，而AO的二聚體沒有熒光．咖啡因單體能夠與咖啡因形成π-π復(fù)合物(如圖11)，促使化學(xué)平衡向吖啶橙單體方向移動，體系熒光逐漸增強．

此外，AO的單體和二聚體都有紫外吸收信號．AO單體的紫外吸收在490 nm，而AO二聚體的吸收在467 nm．當體系中不存在咖啡因或者咖啡因含量較少時，AO的吸收有兩個明顯的紫外吸收峰．當增加咖啡因含量時，AO單體峰逐漸增強，二聚體峰逐漸減弱，說明此時在溶液中發(fā)生了二聚體向單體的化學(xué)平衡移動．

4 結(jié)論

以CDs為能量供體，AO為能量受體，基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移，構(gòu)建比率熒光傳感體系來檢測咖啡因．將CDs-AO的比率傳感體系用于檢測咖啡因，檢測范圍為6.0×10-6～8.0×10-4mol/L，檢測限為4.4×10-7mol/L，表明本方法能夠?qū)崿F(xiàn)對咖啡因的快速檢測．此外，CDs-AO雙熒光比率傳感體系檢測咖啡因可以提高檢測的準確度．

圖10 (a)茶葉樣品，(b)CDs-AO探針對于茶葉樣品中的咖啡因的選擇性檢測

圖11 吖啶橙與咖啡因作用示意圖

在CDs傳感體系中加入咖啡因時，AO的熒光強度逐漸增強，碳點的熒光強度變化不夠明顯，其原因可能是加入咖啡因時，咖啡因與AO作用形成π-π復(fù)合物，使得CDs與AO之間的距離不易調(diào)控，二者發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移的效率較低．因此，對于進一步提高碳點熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率仍需深入研究．