劉 洋，陳立軍，靳秋月，袁建龍

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；2.武警后勤學(xué)院衛(wèi)生勤務(wù)系）

pim基因?qū)儆诮z氨酸/蘇氨酸細(xì)胞蛋白激酶（proviral integration site of murine）家族，對(duì)凋亡誘導(dǎo)通道進(jìn)行有效的控制不僅可有效阻止染色體異常細(xì)胞凋亡，而且還能夠?qū)?xì)胞周期進(jìn)行實(shí)時(shí)調(diào)控，一旦染色體分離會(huì)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致失敗，同時(shí)還會(huì)呈現(xiàn)出多倍性，此時(shí)也就會(huì)出現(xiàn)惡性腫瘤[1～3]。本實(shí)驗(yàn)通過STAT3-si RNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染肝癌SMMC-7721細(xì)胞株，研究STAT3-siRNA表達(dá)載體對(duì)更有助于對(duì)STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行研究，同時(shí)還便于分析下游pim-2基因的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

si LentGeneTM-2 U6 Hairpin Cloning System（Human）試劑盒在此次實(shí)驗(yàn)中我們所選定的供應(yīng)商為Promega公司、購自NEB公司的限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ、購自博奧申公司的質(zhì)粒提取試劑盒、總RNA提取試劑在此次實(shí)驗(yàn)中我們所選定的供應(yīng)商為Invitrogen公司、RT-PCR試劑盒在此次實(shí)驗(yàn)中我們所選定供應(yīng)商為索來寶公司、購自Promega公司的CodeBreakerTMsiRNA脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、購自Santa Cruz公司的PIM-2單克隆抗體、購自博奧申公司的β-actin單克隆抗體、由大連寶生物公司合成的STAT3基因片段、由上海賽百盛公司合成的內(nèi)參βactin引物和pim-2引物。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

肝癌細(xì)胞株SMMC-7721放置在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，5%CO2，37℃靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%的小牛血清RPMI-1640。

1.3 化學(xué)合成si RNA

從Genebank獲取人STAT3mRNA全序列（序列號(hào)：NM003150）。在RNA干擾設(shè)計(jì)原則的指導(dǎo)下，尋找干擾RNA的靶序列，該序列在對(duì)EST基因庫進(jìn)行檢索時(shí)主要采用了BIast，這樣就可以保證是獨(dú)一無二的靶向基因，同時(shí)需要保證STAT3特異性的，對(duì)于其他基因的表達(dá)沒有任何的抑制，同時(shí)該部位也沒有任何的堿基多態(tài)性，1426-1444的核苷酸堿基序在此時(shí)也就可以確定TTGAATTCTGCAGAGAGGC，是RNA的干擾序列。按照promega公司siLentGeneTMU6盒RNA干擾系統(tǒng)的引物設(shè)計(jì)的原則，構(gòu)建序列的下游引物。該下游引物囊括了5＇端磷酸基、局部EcoRⅤ序列、U6所對(duì)應(yīng)的終止序列、靶序列所對(duì)應(yīng)的反義互補(bǔ)序列、袢環(huán)以及靶序列形成回文莖環(huán)結(jié)構(gòu)、U6盒配對(duì)序列，如下：5'-ATCTAAAAAGCCTCTCTGCAGAATTCAATCTCT TGAATTGAATTCTGCAGAGAGGCGGTGTTTCGTCC TTTCCACAAGA-3'

1.4 重組載體si RNA的構(gòu)建

使用試劑盒擴(kuò)增系統(tǒng)擴(kuò)增發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在T4 DNA連接酶作用下，將純化好的SECs與psiLentGeneTM載體置于4℃連接，此時(shí)需要一直過夜，向DH5α轉(zhuǎn)化，后續(xù)所展開的抗性篩選主要采用了Amp，基于平板來進(jìn)行培養(yǎng)。陽性克隆提取DNA，用EcoRⅤ酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。成功篩選陽性重組質(zhì)粒后，對(duì)其進(jìn)行測序，psiLent GeneTM載體此時(shí)也就證明被插入目的DNA片段。

1.5 RT-PCR檢測pim-2 mRNA水平表達(dá)的變化

腫瘤組織總RNA的提取在此次實(shí)驗(yàn)中主要采用了Trizol試劑，后續(xù)所進(jìn)行的操作必須要嚴(yán)格的遵循RT-PCR試劑盒說明書。反應(yīng)條件為94℃5min，94℃50s→55℃50s→72℃1min 35cycle，72℃8min。Pim-2引物序列為，sense：5'CATTCCCGTGGAGTTGTC3'；antisense：5'CATCCTCGGCTGGTGTTT3'；擴(kuò)增產(chǎn)物長度為415bp。β-actin引物序列為，sense：5'GTGGACATCCGCAAAGAC3'；β-actin antisense：5'GAAAGGGTGT AACGCAAC；擴(kuò)增產(chǎn)物長度在經(jīng)過了測定后也就可以確定為302bp?；?%瓊脂糖凝膠電泳，這樣也就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)物的擴(kuò)增，接下來需要掃描，這一操作需要用到的設(shè)備為BIO-RAD圖象分析儀，能夠?qū)Y(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行詳細(xì)記錄。

1.6 檢測PIM-2蛋白表達(dá)水平的變化基于Western blot

基于腫瘤組織還需實(shí)施超聲破碎，在對(duì)腫瘤組織進(jìn)行處理時(shí)首先要選取定量的蛋白上樣緩沖液，然后煮沸，充分的混合均勻，后續(xù)也就可以將其保存在-20OC的溫度條件下。之后是對(duì)SDS-PAGE分離膠和濃縮膠進(jìn)行配制，濃度分別為10%和5%。對(duì)所保存樣品進(jìn)行取樣，容量為20μL，之后進(jìn)行90V恒壓電泳和20V恒壓電泳，時(shí)間分別設(shè)定為1h和2h。上述操作完成后進(jìn)行凝膠提取，4℃、90V恒壓電轉(zhuǎn)1～2h。取出PVDF膜，加1：500稀釋的PIM-2一抗溶液，再在4℃環(huán)境中進(jìn)行過液。之所以對(duì)所收取的進(jìn)行微微振蕩其目的是為了更好的將反應(yīng)液過濾，然后選擇PBS進(jìn)行洗滌，次數(shù)為3次。最后是染色操作，可選用DAB染色試劑來進(jìn)行，同時(shí)使用相機(jī)進(jìn)行拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果需進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，可借助SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)來實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建與鑒定

基于重組質(zhì)粒需進(jìn)行EcoR V酶切，然后與空載體酶進(jìn)行對(duì)比分析。另外還需實(shí)施凝膠電泳，這樣酶切質(zhì)粒，此時(shí)也就獲得了載體片段以及小片段，對(duì)應(yīng)分子量為4000bp以及300bp。而空載體經(jīng)酶切后只有一條約4000bp的載體片段。重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功可通過測序結(jié)果進(jìn)行體現(xiàn)，同時(shí)還能夠判斷所插入的DNA序列是否正確。

圖1 重組質(zhì)粒酶切鑒定圖

圖2 重組載體測序圖

2.2 RT-PCR檢測pim-2 mRNA表達(dá)

基于條帶亮度來實(shí)現(xiàn)對(duì)pim-2mRNA表達(dá)有效的判斷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見圖3），通過分析測試結(jié)果了解到空轉(zhuǎn)染試劑組（SMMC-7721）、空質(zhì)粒組（SMMC-7721）、pim-2基因（SMMC-7721）變化并不明顯，基因表達(dá)量減少變化最大的當(dāng)屬SMMC-7721 STAT3-SECs表達(dá)載體組pim-2基因。

圖3 STAT3-siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞后pim-2 mRNA水平

2.3 Western Blot檢測PIM-2蛋白表達(dá)

基于PIM-2蛋白的表達(dá)水平可借助Western Blot進(jìn)行檢測，在34KD處標(biāo)定特異條帶，選擇βactin作為基準(zhǔn)，對(duì)PIM-2和β-actin顯色條帶進(jìn)行灰度掃描，結(jié)果顯示其與β-actin表達(dá)一致，在這一環(huán)節(jié)中表達(dá)量變化程度最大的當(dāng)屬PIM-2蛋白，而SMMC-7721空轉(zhuǎn)染試劑組、空質(zhì)粒組PIM-2蛋白表達(dá)量并無實(shí)質(zhì)變化。

圖4 STAT3-siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞后PIM-2蛋白表達(dá)水平

3 討論

越來越多的研究人員開始關(guān)注RNA干擾（RNA interference，RNAi）、小分子干擾RNA片段（small interfering RNA，siRNA）。RNA能夠使基因mRNA被雙鏈RNA分子敲除，表現(xiàn)要優(yōu)于正義和反義RNAi[4，5]。RNAi最可實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)或關(guān)閉。而siRNA即RNAi階段產(chǎn)生的小雙鏈RNA分子，大約擁有2l-25個(gè)核苷酸，屬于核心中間效應(yīng)分子，當(dāng)前siRNA已經(jīng)被人工合成，可將mRNA有敲除[6]。si RNA在基因治療和基因功能研究中有著廣泛應(yīng)用。

有關(guān)激活子和轉(zhuǎn)錄信號(hào)傳導(dǎo)子從本質(zhì)上來講皆屬于STAT3重要的組成成員[7～9]。在家族基因分類上pim基因可歸屬到絲氨酸/蘇氨酸細(xì)胞蛋白激酶的范疇，其能夠更好促進(jìn)細(xì)胞增殖[1～3]。在Pim激酶的表達(dá)調(diào)控中，STATs扮演著非常關(guān)鍵的角色，STAT3／STAT5在被活化后，其可以結(jié)合于ISFR／GAS序列，這在很大程度上可以上調(diào)pim-1基因表達(dá)[10，11]，受體酪氨酸激酶FLT3在白血病中能夠起到關(guān)鍵作用，同時(shí)還可以對(duì)pim-1基因進(jìn)行表達(dá)。STATs根據(jù)研究顯示其顯著關(guān)聯(lián)著Pim-1激酶，受到后者的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，Pim-1激酶使得SOCS1／SOCS3被磷酸化，讓SOCS1／SOCS3分子可以展現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性，對(duì)于STATs活性有間接抑制的作用[12]。通過對(duì)stat3和pim家族的關(guān)系分析了解到前者能夠?qū)笳叩谋磉_(dá)進(jìn)行調(diào)控，這不僅有利于對(duì)pim家族作用機(jī)制進(jìn)行分析，而且還便于STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用的發(fā)揮。應(yīng)用RNAi技術(shù)研究stat3對(duì)肝癌SMCC-7721腫瘤細(xì)胞中pim-2基因的影響還未見報(bào)道。

基于STAT3的研究是建立在前人實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，同時(shí)再輔以RNAi技術(shù)，進(jìn)而對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞進(jìn)行分析，研究過程中所選擇的靶點(diǎn)為STAT3第400～500位之間的氨基酸，并以此為基準(zhǔn)進(jìn)行構(gòu)建表達(dá)載體，最后對(duì)pim-2基因表達(dá)的影響進(jìn)行探究。通過分析可以看出，不管是mRNA水平，或者是細(xì)胞水平都表現(xiàn)出了pim-2基因的抑制作用。綜上所述不論是細(xì)胞水平還是蛋白水平都能夠在特定條件下發(fā)揮其功能優(yōu)勢，能夠?qū)im-2基因的表達(dá)效果起到良好的抑制作用?；谀[瘤基因的臨床治療可借鑒細(xì)胞水平上RNAi，原因在于其能夠肝癌治療提供強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。有關(guān)體外腫瘤細(xì)胞基因的培養(yǎng)僅僅借助RNAi技術(shù)還存在一定的漏洞，仍需不斷對(duì)其進(jìn)行完善，其切入點(diǎn)可選擇siRNA使用劑量和siRNA人體方式，通過不斷深入研究進(jìn)而解決siRNA對(duì)人體所造成的副作用問題。有關(guān)轉(zhuǎn)染率的提高、使用什么方式對(duì)siRNA表達(dá)載體作用最多的時(shí)間、通過何種方法檢測其轉(zhuǎn)染效率、shRNA可以穩(wěn)定進(jìn)行表達(dá)與否、表達(dá)shRNA效率情況等，這些問題需要進(jìn)行深入的分析研究。