尤其 郭輝

溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療是心肌梗死后恢復(fù)血供的有效方法，但隨著血供恢復(fù)會造成額外的心肌損傷，即心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷。因此，減輕I/R損傷對改善心肌梗死患者預(yù)后具有重要意義。近年來，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）受到人們的關(guān)注，其通過與靶微小RNA（microRNA，miRNA）結(jié)合抑制miRNA對靶mRNA表達的負調(diào)控，具有多種生理和病理功能[1]。目前，已有多種lncRNA參與心肌I/R損傷的調(diào)控[2-3]。研究報道，在缺血性腦卒中體內(nèi)外模型中l(wèi)ncRNA小核RNA宿主基因6（small nuclear RNA host gene 6，SNHG6）表達增加，抑制SNHG6表達可提高神經(jīng)元細胞活力，抑制氧糖剝奪誘導(dǎo)的細胞凋亡，減少腦梗死面積，并改善神經(jīng)系功能[4]。然而，SNHG6在心肌I/R損傷中的作用并不清楚。DIANA工具預(yù)測到微小RNA-335-3p（microRNA-335-3p，miR-335-3p）與SNHG6存在特異結(jié)合位點。已有研究表明，在小鼠局灶性腦I/R模型中，敲除環(huán)狀RNA絲氨酸/蘇氨酸蛋白擾動樣激酶1（circular RNATousled-like Kinase1，circTLK1）通過上調(diào)miR-335-3p表達減少梗死體積，可減輕神經(jīng)元損傷，改善神經(jīng)功能缺損[5]。Targetscan預(yù)測到程序性細胞凋亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）與miR-335-3p存在特異結(jié)合位點，在I/R心肌細胞中PDCD4表達上調(diào)，下調(diào)PDCD4可增強心肌細胞活力，促進細胞周期進程，抑制細胞凋亡[6]。但SNHG6/miR-335-3p/PDCD4分子軸在心肌I/R損傷中的作用尚未闡明。本研究旨在研究SNHG6在心肌I/R損傷中的作用，并通過miR-335-3p/PDCD4進一步探討其作用機制。

1 材料和方法

1.1 細胞、試劑和儀器 大鼠心肌細胞系H9C2購自中國武漢典型培養(yǎng)物保藏中心；杜爾伯格氏伊戈爾培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）及胎牛血清購自美國Gibco公司；SNHG6小干擾RNA（si-SNHG6）、miR-335-3p模 擬 物（mimics）、miR-335-3p抑制物（anti-miR-335-3p）以及相應(yīng)陰性對照（si-NC、miR-NC、anti-miR-NC）購自北京六合華大基因公司；miRNA提取試劑盒（200116）購于北京天根生化科技公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（200101）購自美國Life Technologies公司；SYBR Green PCR Master Mix（191028）購自美國ABI公司；miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（190812）、miRNA檢測試劑盒（191201）、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin-V-FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測試劑盒（191011）購自北京百奧萊博生物公司；小鼠PDCD4單克隆抗體（sc-376430）、小鼠磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體（sc-47724）、羊抗鼠IgG二抗（sc-2005）購自美國Santa Cruz公司；鼠源裂解的半胱氨酸蛋白酶3（Cleaved Caspase-3）多克隆抗體（ab2302）、羊抗兔IgG二抗（ab97051）購于美國Abcam公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒（190911）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（191005）購自北京索萊寶生物公司；雙熒光素酶活性測定試劑盒（200201）購自北京天恩澤基因科技公司。熒光定量PCR儀（7500型）購自美國ABI公司；流式細胞儀（FACSCalibur）購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組 細胞培養(yǎng)：參照李瑞萍等[7]實驗方法建立心肌細胞缺氧復(fù)氧損傷模型，H9C2細胞接種于無血清低糖（糖濃度1.0 g/L）DMEM培養(yǎng)液，放入缺氧培養(yǎng)箱（95%N2，5%CO2）培養(yǎng)3 h，然后更換為含10%胎牛血清的DMEM高糖（糖濃度4.5 g/L）培養(yǎng)液，放入正常培養(yǎng)箱（95%空氣，5%CO2）復(fù)氧培養(yǎng)6 h。細胞轉(zhuǎn)染：將對數(shù)期H9C2細胞以2×105個/孔接種于6孔板。利用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000將si-SNHG6、si-NC、miR-335-3p mimics、miR-NC、si-SNHG6+anti-miR-NC、si-SNHG6+anti-miR-335-3p分別轉(zhuǎn)染匯合度為60%的H9C2細胞，收獲轉(zhuǎn)染48 h細胞。分組：對照組為正常培養(yǎng)的H9C2細胞；模型組為缺氧處理3 h、復(fù)氧處理6 h的H9C2細胞；模型+si-NC組、模型+si-SNHG6組、模型+miR-NC組、模型+miR-335-5p組分別為轉(zhuǎn)染si-NC、轉(zhuǎn)染si-SNHG6、轉(zhuǎn)染miR-NC、轉(zhuǎn)染miR-335-5p mimics的H9C2細胞（缺氧處理3 h、復(fù)氧處理6 h）；模型+si-SNHG6+anti-miR-NC組、模型+si-SNHG6+anti-miR-335-5p組分別為轉(zhuǎn)染si-SNHG6與anti-miR-NC、轉(zhuǎn)染si-SNHG6與anti-miR-335-5p的H9C2細胞（缺氧處理3 h、復(fù)氧處理6 h）。

1.2.2 實時定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測SNHG6、miR-335-3p表達TRIzol試劑盒、miRNA提取試劑盒分離H9C2細胞的總RNA和miRNAs。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，再用SYBR Green PCR Master Mix進行熒光定量PCR以檢測SNHG6表達水平。采用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成互補DNA（complementary DNA，cDNA），采用miRNA檢測試劑盒進行熒光定量PCR以檢測miR-335-3p表達水平。SNHG6、miR-335-3p分別以GAPDH和U6作 為 內(nèi) 參 對 照，2-ΔΔCt法 計 算SNHG6、miR-335-3p表達量。引物序列如下（5'-3'）：SNHG6上游ATACTTCTGCTTCGTTACCT，下游CTCATTTTCATCATTTGCT；GAPDH上游GGGAGCCAAAAGGGTCATCA，下游TGATGGCATGGACTGTGGTC；miR-335-3p上游UUUUUCAUUAUUGCUCCUGACC，下游CCAGTCTCAGGGTCCGAGGTATTC；U6上游CTCGCTTCGGCAGCACA，下游AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡H9C2細胞處理完畢后，收集細胞，PBS洗滌細胞2次，并用結(jié)合緩沖液重懸細胞。取100 μL細胞懸液（細胞數(shù)約1×105個），加入Annexin-V-FITC和PI各5 μL，暗室內(nèi)孵育30 min后添加400 μL結(jié)合緩沖液，混勻后上流式細胞儀檢測凋亡細胞百分比。

1.2.4 分光光度法檢測細胞中SOD活性、MDA水平 缺氧復(fù)氧處理結(jié)束后，收集細胞至離心管，加入提取液超聲破碎細胞，收集上清液，按照商品試劑盒說明書測定SOD活性、MDA水平。

1.2.5 蛋白質(zhì)印記法檢測PDCD4和Cleaved Caspase-3蛋白表達 放射免疫沉淀試驗（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液提取H9C2細胞總蛋白。取等量的蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），然后轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏二氟乙烯膜上，封閉膜后與特異性一抗（PDCD4和GADPH均 為1∶300稀 釋，Cleaved Caspase-3為1∶500稀釋）在4℃孵育過夜。室溫下將膜與對應(yīng)二抗孵育1 h。將膜置于孵育盒，滴加化學發(fā)光試劑暗室顯影。Image-Pro Plus 6.0軟件分析PDCD4蛋白條帶和GADPH條帶灰度值，二者的比值表示PDCD4蛋白表達量。

1.2.6 雙熒光素酶報告實驗 將含有miR-335-3p結(jié)合位點的野生型（wild type，WT）或突變型（mutant type，MUT）SNHG6或PDCD4-3'-UTR序列克隆至psiCHECK-2載體，構(gòu)建熒光素酶報告質(zhì)粒WTSNHG6、MUT-SNHG6、WT-PDCD4、MUT-PDCD4。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將上述報告質(zhì)粒分別與miR-335-3p mimics（miR-335-3p組）、miR-NC（miR-NC組）轉(zhuǎn)染H9C2細胞，雙熒光素酶活性測定試劑盒分析轉(zhuǎn)染48 h后各組細胞相對熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，正態(tài)分布的計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞SNHG6、miR-335-5p、PDCD4、Cleaved Caspase-3表達水平及凋亡等指標的比較 見圖1、表1。

由圖1、表1可見，與對照組比較，模型組SNHG6表達量，PDCD4、Cleaved Caspase-3蛋白表達量，細胞凋亡率及MDA水平均顯著升高（均P＜0.01），miR-335-5p表達量、SOD活性均顯著降低（均P＜0.01）；與模型+si-NC組比較，模型+si-SNHG6組SNHG6表達量，PDCD4、Cleaved Caspase-3蛋白表達量，細胞凋亡率及MDA水平均顯著降低（均P＜0.01），miR-335-5p表達量、SOD活性均顯著升高（均P＜0.01）。

表1 各組細胞SNHG6、miR-335-5p、PDCD4、Cleaved Caspase-3表達水平及凋亡等指標的比較

圖1 干擾SNHG6對細胞凋亡流式圖及PDCD4蛋白表達電泳圖的影響

2.2 雙熒光素酶報告實驗結(jié)果DIANA工具預(yù)測到miR-335-5p與SNHG6序列存在連續(xù)特異性結(jié)合位點，Targetscan預(yù)測到miR-335-5p與PDCD4-3'-UTR區(qū)域存在連續(xù)特異性結(jié)合位點，見圖2。雙熒光素酶報告實驗顯示，與miR-NC組比較，miR-335-5p組WT-SNHG6、WT-PDCD4的相對熒光素酶活性均顯著下降（均P＜0.01），而MUT-SNHG6、MUT-PDCD4的相對熒光素酶活性差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表2。

表2 雙熒光素酶報告實驗結(jié)果

圖2 小核RNA宿主基因6（SNHG6）、微小RNA（miR）-335-5p和程序性細胞凋亡因子4（PDCD4）的互補序列

2.3 各組細胞miR-335-5p、PDCD4、Cleaved Caspase-3蛋白表達水平及凋亡等指標的比較 見圖3、表3。

由圖3、表3可見，與模型+miR-NC組比較，模型+miR-335-5p組miR-335-5p表達量、SOD活性均顯著升高（均P＜0.01），PDCD4和Cleaved Caspase-3蛋白表達量、細胞凋亡率、MDA水平均顯著降低（均P＜0.01）。

表3 各組細胞miR-335-5p、PDCD4、Cleaved Caspase-3蛋白表達水平及凋亡等指標的比較

圖3 微小RNA（miR）-335-5p對細胞凋亡流式圖及程序性細胞凋亡因子4（PDCD4）蛋白表達電泳圖的影響

2.4 各 組 細 胞miR-335-5p、PDCD4、CleavedCaspase-3表達及凋亡等指標的比較 見圖4、表4。

由圖4、表4可見，與模型+si-SNHG6+antimiR-NC組比較，模型+si-SNHG6+anti-miR-335-5p組miR-335-5p表達量、SOD活性均顯著降低（均P＜0.01），PDCD4和Cleaved Caspase-3蛋白表達水平及細胞凋亡率、MDA水平均顯著升高（均P＜0.01）。

表4 各組細胞miR-335-5p、PDCD4、Cleaved Caspase-3表達及凋亡等指標的比較

圖4 抑制微小RNA（miR）-335-5p可逆轉(zhuǎn)干擾小核宿主基因6（SNHG6）對凋亡流式圖及程序性細胞凋亡因子4（PDCD4）蛋白表達電泳圖的影響

3 討論

lncRNA通過調(diào)控基因表達參與心肌I/R損傷的多種病理過程，具有作為心肌I/R損傷治療靶點的潛力。Du等[8]研究指出lncRNA核富集轉(zhuǎn)錄體1（NEAT1）/miRNA-520a軸參與心肌I/R損傷中線粒體途徑細胞凋亡的調(diào)控。Xue等[9]的研究表明，lncRNA低氧誘導(dǎo)因子1α反義RNA1（HIF1AAS1）通過吸附miRNA-204調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白抑制因子2表達參與心肌I/R損傷后心室重構(gòu)。Liang等[10]報道抑制lncRNA ROR可減弱缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡和炎癥反應(yīng)。然而，SNHG6在心肌I/R損傷中功能并未闡明。已有文獻證實SNHG6在結(jié)直腸癌、乳腺癌等實體腫瘤中表達上調(diào)，具有致癌因子作用[11-12]。SNHG6表達增加還可能與室間隔缺損形成有關(guān)[13]。本研究證實缺氧復(fù)氧處理后H9C2細胞中SNHG6表達量明顯增加，提示SNHG6表達改變可能與心肌I/R損傷有關(guān)。功能實驗表明，轉(zhuǎn)染si-SNHG6干擾SNHG6表達顯著抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的細胞凋亡，抑制Cleaved Caspase-3蛋白表達。心肌缺氧后，尤其在復(fù)氧階段產(chǎn)生大量的活性氧，SOD是清除活性氧的重要氧抗氧化酶，當機體氧化抗氧化失衡時導(dǎo)致活性氧攻擊生物膜誘導(dǎo)廣泛的氧化應(yīng)激損傷[14-15]。本研究中干擾SNHG6表達后，缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)H9C2細胞中SOD活力明顯增加，脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA水平明顯降低，說明干擾SNHG6表達能夠減弱缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激損傷。Shan等[16]證實在動脈粥樣硬化中，敲減SNHG6能夠提高人臍靜脈內(nèi)皮細胞活力，減弱低密度脂蛋白誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、炎癥和細胞凋亡，這與本研究中干擾SNHG6表達的保護作用一致。以上數(shù)據(jù)表明，SNHG6可能參與心肌I/R損傷。

研究表明lncRNA通過表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄或翻譯機制參與人類心血管疾病進展[17]。對SNHG6進行分析發(fā)現(xiàn)其功能的發(fā)揮多與調(diào)控miRNA表達有關(guān)，例如SNHG6通過靶向miR-101-3p參與膠質(zhì)瘤細胞的增殖、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和遷移，抑制細胞凋亡[18]。SNHG6靶向miR-26a-5p調(diào)控結(jié)直腸癌細胞的5-氟尿嘧啶耐藥性[19]。本研究通過熒光素酶實驗證實SNHG6與miR-335-3p直接存在相互作用，進一步研究顯示缺氧復(fù)氧處理后H9C2細胞中miR-335-3p表達明顯降低，而干擾SNHG6表達顯著減弱缺氧復(fù)氧對miR-335-3p表達的抑制作用，提示SNHG6可能靶向miR-335-3p參與心肌I/R損傷。轉(zhuǎn)染miR-335-3p mimics進行功能實驗，結(jié)果表明過表達miR-335-3p顯著減輕缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細胞凋亡和SOD活力下降，下調(diào)Cleaved Caspase-3蛋白表達并降低MDA水平，這與Wu等[5]報道的miR-335-3p在腦I/R損傷中的保護作用一致。miRNA主要通過識別靶mRNA抑制其翻譯來調(diào)控蛋白表達進而發(fā)揮作用。PDCD4是細胞凋亡的關(guān)鍵介質(zhì)，正常心肌組織中PDCD4表達水平較低，過氧化氫或缺氧復(fù)氧處理后心肌細胞中PDCD4表達上調(diào)可加重細胞凋亡，通過下調(diào)PDCD4表達可改善過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細胞損傷和心肌I/R損傷[20-22]。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧復(fù)氧處理后H9C2細胞中PDCD4表達增加，并證實PDCD4是miR-335-3p的靶基因，且干擾SNHG6或過表達均可減弱缺氧復(fù)氧處理對PDCD4表達的促進作用，這說明SNHG6/miR-335-3p/PDCD4途徑可能在心肌I/R損傷中發(fā)揮作用?；貜?fù)實驗顯示，抑制miR-335-3p表達顯著減弱干擾SNHG6表達對H9C2細胞缺氧復(fù)氧損傷的影響，這說明SNHG6通過靶向miR-335-3p進而上調(diào)PDCD4表達參與缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷。

總之，本研究證實干擾SNHG6表達通過上調(diào)miR-335-3p/PDCD4途徑能夠減弱缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷，這進一步揭示了心肌I/R損傷中l(wèi)ncRNA/miRNA/mRNA調(diào)控機制，為心肌I/R損傷提供潛在治療靶點。