張春雷 楊琦 周逢海 徐東波 康亞芬 常德輝

CDR1as(又稱ciRS-7，hsa_circ_0001946)已被證明在包括肝細胞癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌等[1]在內的多種腫瘤疾病中發(fā)揮促進腫瘤進展的作用，在膀胱癌中通過CDR1as-miR-7-p21/CDR1as-miR1270途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[2]。CDR1as是目前研究廣泛及功能強大的環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)，然而其在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用目前尚無論證，我們通過對34例前列腺癌患者術后標本的癌及癌旁配對組織樣本進行高通量測序，發(fā)現CDR1as在前列腺癌組織中顯著低表達，說明CDR1as可能在前列腺癌的疾病發(fā)生及進展中發(fā)揮重要作用，對此，我們通過基因檢測結合數據庫分析，探索CDR1as在前列腺癌中可能的作用及機制。

材料與方法

一、前列腺癌患者組織標本獲取及測序

選取就診于中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫(yī)院術后病理診斷為前列腺癌患者的腫瘤組織及癌旁組織(已通過醫(yī)院倫理審核，審批編號：2020KYLL030)，一部分留作提取RNA，一部分送至測序公司進行測序，差異分析采用edgeR分析方法，差異表達標準為Fold change>2.0 且P值<0.05，細胞測序標準與之相同。

二、細胞培養(yǎng)

將細胞接種于含有4 ml(10%胎牛血清)培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，放于37 ℃、5% CO2條件下的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。RWPE1細胞培養(yǎng)在PEpiCM培養(yǎng)液中，LNCap細胞培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)液中，PC3細胞培養(yǎng)在F-12(ham)培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液每2天更換一次，細胞在生長到70%～80% 時用0.5 ml 0.25% 的胰蛋白酶/ EDTA室溫下消化并傳代。

三、siRNA干擾處理

常規(guī)消化細胞并計數，在6孔板中預鋪1×105個細胞，1 d后至生長對數期，使用預熱的OPTI-MEM配置轉染試劑懸液和10 mmol/L干擾RNA(siRNA)懸液，按照說明書將混勻的轉染試劑溶液滴加到培養(yǎng)液中，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。siRNA1：GCACCTGTGTCAAGGTCTTTT；siRNA2：GGT-CTTCCAGCGACTTCAATT；siRNA3：GTGCTGATCTTCTGACATTTT。

四、RNA提取

將組織在液氮中磨碎，用勻漿儀進行勻漿處理后采用Trizol法常規(guī)提取RNA；將培養(yǎng)貼壁細胞用PBS清洗2遍，之后采用Trizol法常規(guī)提取RNA。

五、反轉錄及RT-qPCR

按照反轉錄試劑盒(PrimeScript?RT Master Mix試劑，Takara，中國)提供的標準方法進行配置，放至PCR儀，按照37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s條件進行反轉錄；按照RT-qPCR試劑盒(SYBR?Premix Ex TaqTM試劑，Takara，中國)提供的標準方法進行配置，放入儀器中，采用兩步法RT-qPCR的默認設定程序進行檢測，每個樣品做3次重復。引物如下：CDR1as(F：CGTCTCCAGTGTGCTGATCT；R：GTCCGGAAGACATGGATT)，β-actin(F：CGC-GAGAAGATGCCCAGATC；R：TCACCGGAGT-CCATCACG)。

六、CDR1as作用機制的預測

采用miRanda軟件預測CDR1as與miRNA結合位點，利用癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數據庫中的臨床數據信息，分析差異表達的基因對前列腺癌預后的影響，通過circinteractome網站(https://circinteractome.nia.nih.gov/)預測CDR1as是否與蛋白質存在結合位點，利用ORF Finder網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預測CDR1as是否擁有開放閱讀框(open reading frames, ORF)及IRESite網站(http://iresite.org/IRESite_web.php)預測是否具有內在的核糖體進入結合位點(internal ribosome entry site, IRES)。

七、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0軟件分析數據，計量資料采用均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，采用Pearson相關性分析預測基因與CDR1as表達的相關性及利用生存分析進行預后分析，癌與癌旁組織中表達差異變化采用表達量差值進行分析(T-N)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、CDR1as在前列腺癌患者組織及前列腺癌相關細胞系中的表達情況

在34例前列腺癌患者術后標本的配對樣本中，CDR1as在癌組織中表達量顯著低于癌旁組織(P<0.05，圖1A)；為驗證測序結果的準確性，選取17例前列腺癌患者術后標本的癌及癌旁配對組織樣本進行RT-qPCR驗證，結果表明，在3組配對的組織樣本中，CDR1as在癌組織中的表達量高于癌旁組織，在其余的14組配對組織樣本中，癌組織中的表達量均低于癌旁組織，CDR1as在癌組織中的表達量低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1B、1C)。相比于前列腺正常上皮細胞系RWPE1，CDR1as在前列腺癌細胞系PC3中高表達，在LNCap中低表達(P<0.05)。

二、篩選被CDR1as調控的下游靶基因

為篩選在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中可能被CDR1as調控的下游靶基因，采用3種CDR1as的siRNA對表達量升高的PC3細胞進行處理，模擬腫瘤組織中CDR1as表達下調，收集處理過的細胞進行mRNA測序，取3組處理細胞測序結果中同時上調或下調的mRNA，并選取與組織測序結果中差異表達mRNA變化趨勢一致的mRNA。結果表明經過siRNA處理后，3組PC3細胞中的CDR1as表達量均下調(圖2A)，與對照組相比，測序的3組配對樣本中共有225個顯著上調的mRNA和228個顯著下調的mRNA，組織測序結果中共有401個顯著上調的mRNA、1 010個顯著下調的mRNA，共篩選出7個顯著上調的mRNA和37個顯著下調的mRNA作為在前列腺癌發(fā)生及發(fā)展中被CDR1as調控的下游靶基因(圖2B)。

A：34例前列腺癌患者術后標本的癌及癌旁配對組織樣本中CDR1as測序表達量對比；B、C：17例前列腺癌患者腫瘤組織與癌旁組織CDR1as表達量的RT-qPCR驗證；D：CDR1as在3種前列腺癌相關細胞系中的表達圖1 CDR1as在前列腺癌組織及細胞中的表達量(*P<0.05，**P<0.01)

A：PC3細胞中采用3種siRNA干擾處理后CDR1as表達量；B：篩選組織測序結果及PC3細胞采用3種siRNA干擾處理后測序結果中差異表達變化趨勢一致的mRNA 圖2 被CDR1as調控的下游靶基因的篩選

三、探索CDR1as與差異表達基因的相關性

采用Pearson相關性分析組織測序結果， 探索腫瘤組織中與CDR1as表達變化存在相關性的基因，并對這些基因在癌與癌旁組織中表達差異變化與CDR1as在癌與癌旁組織中表達差異變化(用表達量差值表示)是否存在相關性進行檢測，表1列舉了與前列腺癌或其他惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展存在相關性的基因，共有19個基因在前列腺癌患者腫瘤組織中與CDR1as表達變化存在相關性，其中表達上調的為BIRC5和PRDX4，表達下調的為RASGRP2、MRVI1、RUNX1T1、CD200、RARRES2、ASPA、CD69、RGS22、GSTM5、LRP4、ASXL3、MYO1F、CCL5、FBLN2、PRRX2、ACOX2和INPP5D；共有12個基因在癌與癌旁組織中表達差異變化與CDR1as表達差異變化存在相關性，其中表達上調的為PRDX4，表達下調的為MRVI1、RUNX1T1、CD200、RARRES2、ASPA、GSTM5、LRP4、FBLN2、PRRX2、ACOX2和INPP5D(P<0.05)。采用TCGA數據庫中的臨床數據信息，分析差異表達的基因對前列腺癌預后的影響，結果表明低表達的GSTM5與前列腺癌不良預后有關(P<0.05，圖3)。

圖3 GSTM5表達對前列腺癌患者預后分析

表1 在前列腺癌患者組織中與CDR1as表達變化趨勢存在相關性的mRNA

四、預測CDR1as與miRNA結合位點

為進一步探索CDR1as在前列腺癌發(fā)生及發(fā)展中可能的作用機制，采用miRanda軟件預測CDR1as與miRNA結合位點，共檢測出CDR1as與68個miRNA存在結合位點，存在5個以上結合位點的miRNA為hsa-miR-7-5p、hsa-miR-3617-5p、hsa-miR-8056、hsa-miR-641、hsa-miR-1290、hsa-miR-1246、hsa-miR-3156-5p、hsa-miR-139-3p及hsa-miR-3167(圖4)。

圖4 miRanda軟件預測CDR1as與miRNA結合位點

五、預測CDR1as是否與蛋白質相互作用或翻譯蛋白的可能性

circRNA可以與蛋白質相互結合或翻譯蛋白而發(fā)揮作用，通過circinteractome網站預測CDR1as是否與蛋白質存在結合位點，結果表明CDR1as序列與蛋白質無結合位點，反向剪接位點與IGF2BP2存在結合位點，其側翼序列與FUS、IGF2BP2、IGF2BP3存在結合位點(表2)。為探索circRNA是否具有翻譯蛋白質的潛能，利用ORF Finder網站及IRES網站進行預測，結果顯示CDR1as具有14個ORF(表3)及8個IRES(表4)。

表2 CDR1as與蛋白質結合位點預測

表3 CDR1as ORF預測

表4 CDR1as IRES預測

討 論

CDR1as具有1 485個堿基，它是由CDR1反義鏈環(huán)化形成的circRNA，其序列具有豐富的miRNA結合位點，不但種類多，而且與多個miRNA具有5個以上的miRNA結合位點，預示著其miRNA海綿作用機制功能強大，miRanda軟件預測其與miRNA結合位點證明了這一點。通過對34例前列腺癌患者術后標本的癌及癌旁配對組織樣本測序結果發(fā)現CDR1as在前列腺癌組織中顯著低表達，CDR1as在另外17例前列腺癌患者的癌及癌旁配對組織標本中的RT-qPCR表達量也驗證了測序結果的準確性，表明其可能在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。為了進一步探索其潛在作用和可能的作用機制，我們通過測序及數據統(tǒng)計分析方式篩選出可能被CDR1as影響表達的候選基因，根據候選基因的功能推測CDR1as在前列腺癌疾病中的作用。PRDX4是篩選出的與CDR1as在前列腺癌患者組織中變化相關且在前列腺癌組織中上調的基因，前列腺癌組織中PRDX4過表達，并促進前列腺癌細胞的增殖[3]，但下調的CDR1as如果通過miRNA海綿機制發(fā)揮作用，理論上PRDX4在前列腺癌組織中受到miRNA作用會出現下調，說明CDR1as可能通過其他途徑調節(jié)PRDX4，比如與長鏈非編碼RNA等相互協(xié)調共同發(fā)揮作用。其他與CDR1as變化顯著相關的幾個基因主要發(fā)揮抑癌作用，比如miR-940通過下調MRVI1促進子宮內膜癌的增殖和轉移[4]，RUNX1T1抑制結直腸癌細胞的增殖并促進化療藥物抵抗[5]，ASPA、PRRX2和GSTM5在前列腺癌組織中顯著下調[6-7]，FBLN2在鼻咽癌中發(fā)揮抗血管生成和腫瘤抑制作用[8]，ACOX2在心臟惡性腫瘤中表達缺乏[9]，INPP5D作為抑癌基因p53的下游靶基因，在多個腫瘤中的缺氧誘導調控過程起到促進細胞凋亡的作用[10]，而且低表達的GSTM5與前列腺癌不良預后有關。如果前列腺癌腫瘤組織中低表達的CDR1as導致這些發(fā)揮抑癌作用的基因表達降低，那么其發(fā)揮促腫瘤作用的機制可能是通過這些基因實現的，這些基因表達的下調也證明CDR1as的表達下降可能是前列腺癌疾病進展的因素。

腫瘤微環(huán)境是調節(jié)腫瘤疾病進展的重要因素，而免疫調節(jié)在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用。在與CDR1as表達變化顯著相關的基因中，RARRES2表達的蛋白是一種內源性白細胞趨化劑，可通過其受體ChemR23募集先天免疫細胞。在腫瘤微環(huán)境中增強RARRES2可以部分抑制免疫效應細胞的募集，從而顯著抑制腫瘤的生長，升高的RARRES2可以通過增加PTEN的表達及降低PD-L1的表達顯著抑制前列腺癌細胞系DU145的成瘤作用[11]，說明 RARRES2表達的下調也是前列腺癌進展的可能因素之一。另外，腫瘤特異性TH1細胞在抗癌免疫反應中也起到重要作用，CD200和CD69是腫瘤特異性CD4+T細胞表面特異性分子[12]，兩者表達的下降是否意味著下調的CDR1as也影響著腫瘤特異性T細胞的表達，進而影響其抗腫瘤的功能，值得進一步探索。

當然，這些與CDR1as表達密切相關的下調基因也有發(fā)揮促癌作用的基因，比如LRP4促進胃癌及甲狀腺癌的發(fā)展[13-14]，FBLN2在肺腺癌中也是惡性進展的促進因子[15]。那么它們的下調意味著作為抑癌因素存在。此外，ASXL3、MYO1F和CCL5也是促癌基因[16-18]，尤其是有報道表明CCL5通過激活β-catenin/STAT3信號通路促進前列腺癌干細胞的轉移[19]，但這些基因在腫瘤組織與癌旁組織中差異變化并未體現出與CDR1as表達差異變化存在相關性，說明它們可能并非CDR1as調控?？傮w來說，這些與CDR1as表達密切相關的基因主要以發(fā)揮抑癌作用的基因為主。

除了miRNA海綿作用，circRNA還可以通過與蛋白質相互作用，甚至翻譯蛋白發(fā)揮作用。雖然CDR1as是反義鏈circRNA，但如果其具備翻譯蛋白質的必備條件，也有可能通過翻譯成蛋白質發(fā)揮作用。已有研究表明CDR1as通過破壞P53/MDM2復合物從而限制P53蛋白的泛素化來促進其穩(wěn)定性，最終達到抑制膠質瘤的進展[20]，因此CDR1as在前列腺癌中也可能通過與蛋白質相互作用的機制發(fā)揮功能。通過數據庫的預測及分析，CDR1as具有14個ORF及8個IRES，那么其能否翻譯蛋白質也是值得探索的。另外，CDR1as的剪接位點及側翼序列可能與FUS、IGF2BP2、IGF2BP3相結合，而FUS/TLS是前列腺癌細胞中雄激素受體的共激活因子，可以促進前列腺癌細胞系LNCap細胞的雄激素依賴性增殖[21]，IGF2BP3在前列腺癌組織中高表達，且與高Gleason評分相關[22]，下調的CDR1as可能因為對FUS、IGF2BP2、IGF2BP3抑制作用減輕而發(fā)揮促腫瘤作用。

在進行前列腺癌細胞系的CDR1as表達量驗證時發(fā)現，前列腺癌骨轉移細胞系PC3中CDR1as高表達，在LNCap細胞中低表達，考慮原因可能是細胞系為純化的細胞，導致其分子表達量與組織中表達量不一致，另外PC3細胞系并不能很好的作為前列腺癌研究模型，PC3細胞為骨轉移細胞系，其基因表達與原位細胞系的基因表達差異比較大，但是CDR1as在骨轉移細胞系中的高表達是否意味著隨著表達量的改變導致轉移的發(fā)生也是將要探索的方向。這種現象也提示我們在研究CDR1as在前列腺癌疾病進程中的作用應選擇LNCap細胞模型?？傮w而言，通過對CDR1as在腫瘤組織中低表達以及CDR1as與差異表達基因的相關性進行統(tǒng)計分析,得出低表達的CDR1as可能促進前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展的結論，其具體功能有待進一步進行細胞生物學的鑒定，比如利用CDR1as低表達的LNCap細胞構建CDR1as過表達的穩(wěn)轉株并檢測其生物學變化，以及CDR1as精確的作用機制等都有待進一步探索。