張黃成昊 嚴兵 楊震

牡荊主要生長于南方山區(qū)，在云南、四川地區(qū)尤為常見。牡荊素(分子式為C21H20O10)是由牡荊葉和牡荊子中提取的天然黃酮類化合物。傳統(tǒng)研究認為，牡荊素的主要作用是活血化瘀、理氣通脈。用于瘀血阻脈所致的胸痹，癥見胸悶憋氣、心前區(qū)刺痛、心悸健忘、眩暈耳鳴、冠心病心絞痛、高脂血癥、心臟動脈供血不足等癥候者[1-4]，常用于心血管疾病的治療[1]。目前，牡荊素粗提產(chǎn)物已有成藥用于臨床醫(yī)療[1]，其精提產(chǎn)物已在臨床試驗中。

腎惡性橫紋肌樣瘤(malignant rhabdoid tumor of kidney， MRTK)是惡性橫紋肌樣瘤(malignant rhabdoid tumor， MRT)的一種，是發(fā)生在腎臟的一種高度侵襲性腫瘤，常發(fā)生于嬰幼兒，其男性發(fā)病率稍高于女性(1.5∶1)[5]。該腫瘤由Beckwith等[6]在1978年首次提出，起初被認為是腎母細胞瘤的一種亞型，1981年Haas等[7]發(fā)現(xiàn)了其不同于腎母細胞瘤和腎橫紋肌肉瘤的獨特性，而將其獨立命名。隨著研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)MRT還包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)起源的非典型畸胎瘤樣/橫紋肌樣瘤及腎外頭顱外起源的非中樞神經(jīng)系統(tǒng)橫紋肌樣瘤，且MRTK有著與所有MRT共同的特點，即抑癌基因SMARCB1或SMARCA4突變[8]。本文結(jié)合MRTK的發(fā)生、發(fā)展機制來探究牡荊素對其可能的作用機制，以期為臨床治療及研究提供新的思路和理論依據(jù)。

一、牡荊素的抗腫瘤作用

近年來的研究發(fā)現(xiàn)牡荊素還是防癌抗腫瘤的天然藥物成分，Scarpa等[9]報道從黃荊牡荊中得到的黃酮類化合物(如牡荊素)在生物活性測定中對人類癌細胞顯示了廣泛的細胞毒作用；Abdelhady等[10]的研究也發(fā)現(xiàn)，紫花牡荊素在MTT試驗中顯示對人結(jié)腸癌細胞(HCT116)的生長有抑制作用。自此，牡荊素的抗腫瘤作用開始受到人們的關(guān)注。

牡荊素在幾種體外和體內(nèi)模型中均顯示有顯著的抗腫瘤作用(表1)，這些報道為牡荊素的抗腫瘤藥用價值提供了有力依據(jù)。在這些報道中牡荊素發(fā)揮抗腫瘤作用的主要途徑是通過促進腫瘤細胞凋亡、自噬及抑制多種細胞增殖和遷移的信號傳導(dǎo)途徑完成的(圖1)。

有研究報道，牡荊素通過靶向U937細胞中的細胞凋亡而表現(xiàn)出抗腫瘤活性[13]。牡荊素觸發(fā)的細胞凋亡通常還伴隨著線粒體膜電位和Bcl-2蛋白水平的降低以及Caspase-3和Caspase-9蛋白表達的增加。

在與熱應(yīng)激相關(guān)的研究中顯示，牡荊素通過上調(diào)Hsp90表達并隨后激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來促進細胞自噬[16]。Hsp90可能參與了牡荊素抗腫瘤作用的相關(guān)信號通路。

另外有證據(jù)表明，異牡荊苷及牡荊素還可以強烈趨向性結(jié)合一種名為轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin， TF)[17]的特殊鐵結(jié)合糖蛋白[18-19]。由于該蛋白可在癌細胞中高度表達[20-21]，因此，我們推測，以TF受體為靶標發(fā)揮牡荊素的抗腫瘤作用存在較高潛力[17]。

二、牡荊素可能通過表觀遺傳學(xué)調(diào)控HIF-1α的表達進而影響腫瘤的發(fā)生及發(fā)展

在PC12細胞中還發(fā)現(xiàn)了牡荊素通過抑制HIF-1α并減少缺氧誘導(dǎo)的多種基因表達發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。這些基因編碼VEGF、GAPDH、膠原蛋白III、醛縮酶A、烯醇酶1、TGF-β1和PDGFα，可導(dǎo)致PC12細胞轉(zhuǎn)移能力和血管生成的減弱[14]。Epstein等[11]對乳腺癌細胞系的研究表明，牡荊素通過抑制HIF-1α途徑降低細胞運動性而發(fā)揮抗腫瘤作用。P53作為一種主要的抑癌蛋白，在人口腔癌OC2細胞中的研究結(jié)果表明，牡荊素通過 P53-PAI1-MMP2級聯(lián)顯著降低了腫瘤細胞活力和細胞遷移[12]。

HIF-1α在1992年由Semenza等[22]首先發(fā)現(xiàn)。HIF-1α普遍存在于人和哺乳動物細胞內(nèi)，常氧(21% O2)下也有表達，但合成的HIF-1α蛋白很快即被細胞內(nèi)氧依賴性泛素蛋白酶降解途徑所降解。所以，HIF-1α只有在缺氧條件下才可穩(wěn)定表達。癌細胞能夠在缺氧環(huán)境中生存，而缺氧本身可以激活導(dǎo)致腫瘤進展的適應(yīng)性細胞反應(yīng)[23]。許多HIF-1α介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)對腫瘤進展有益，包括將代謝轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒狻⒄T導(dǎo)血管生成、調(diào)節(jié)細胞凋亡、誘導(dǎo)遷移等以抵抗低氧環(huán)境[23-24]。HIF-1α在腫瘤細胞中主要有兩種作用：①HIF-1α觸發(fā)Src的磷酸化，隨后磷酸化STAT3的酪氨酸殘基Y705(信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3)；②HIF-1α可誘導(dǎo)Bcl-2/BNIP3/BNIP3-like的表達增加，以及促進Beclin-1/Bcl-2復(fù)合體解離，通過以上兩種機制激活細胞自噬[25]。

已有文獻報道牡荊素可以顯著抑制HIF-1α的表達[26]，而腫瘤致癌基因HIF-1α的表達則受H3K27me3甲基化水平調(diào)控。

表1 牡荊素抗腫瘤作用的近期研究

HIF-1α：缺氧誘導(dǎo)因子-1α；LC3-Ⅱ：微管相關(guān)蛋白1輕鏈3自噬體膜型；VEGF：血管內(nèi)皮生長因子；PAI-1：纖溶酶原激活劑抑制劑-1；PPARγ：過氧化物增殖體激活受體γ；Beclin-1：螺旋肌球蛋白樣Bcl-2相互作用蛋白1；MPP-2：膜棕櫚?；鞍?圖1 牡荊素發(fā)揮抗腫瘤作用的主要途徑

三、牡荊素與H3K27me3甲基化水平的潛在聯(lián)系

牡荊素可能通過調(diào)控下列靶點作用于多種癌癥，我們描繪了牡荊素對各種類型惡性腫瘤的分子靶標的作用機理及可能的機制(圖2)。

圖2 牡荊素在惡性腫瘤中參與的主要下游信號通路

我們歸納這些牡荊素的分子靶標后發(fā)現(xiàn)，其大多也受到組蛋白相關(guān)修飾，即表觀遺傳學(xué)修飾的影響。例如：Bcl-2[27-29]、P53[27]、Caspases[28]、Bax[29]等均受到組蛋白H3不同位點尤其是H3K27me3甲基化水平的調(diào)控。因此，這些證據(jù)提示牡荊素對惡性腫瘤發(fā)揮作用的具體機制可能是通過調(diào)控表觀遺傳學(xué)修飾實現(xiàn)的；同時我們也發(fā)現(xiàn)這些靶點與MRTK的主要致病基因的下游基因(包括Bcl-2、P53)具有高度的一致性。

組蛋白H3K27em3的甲基化被認為在MRTK的發(fā)生及發(fā)展中扮演重要角色[30]。H3K27em3蛋白的甲基化可以抑制多種效應(yīng)分子的結(jié)合[31]，其甲基化水平的過度升高會導(dǎo)致包括細胞周期及凋亡等基因調(diào)控發(fā)生紊亂進而誘導(dǎo)細胞癌變[32]。而H3K27em3的甲基化則受到甲基化轉(zhuǎn)移酶EZH2酶活性的嚴格調(diào)控[25]，交換型轉(zhuǎn)換缺陷/蔗糖不發(fā)酵型(SWI/SNF)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)殘缺會對其介導(dǎo)的EZH2蛋白表達與酶活性的激活造成影響，進而降低對H3K27em3蛋白甲基化水平的調(diào)控[33]。有研究報道SMARCB1表達缺失會嚴重影響SWI/SNF復(fù)合物功能的完整性，造成該復(fù)合物功能或結(jié)構(gòu)的殘缺[25-26]。

四、SMARCB1/SMARCA4突變誘導(dǎo)的SWI/SNF復(fù)合物結(jié)構(gòu)功能缺失參與包括MRTK在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)生及發(fā)展

SMARCB1和SMARCA4基因編碼的蛋白INI1與BRG1是參與SWI/SNF復(fù)合物的重要成員[34]，被認為是腫瘤抑制基因，二者任一表達或功能的缺失都會導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生[35]。SMARCB1或SMARCA4缺失誘導(dǎo)的腫瘤往往被稱MRT，在多處組織皆可發(fā)生，但以MRTK最為常見，其擁有極高的侵襲性與致命性。文獻報道MRT免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示SMARCB1或SMARCA4的核表達完全喪失[36]，分子實驗同樣證實絕大多數(shù)MRT中等位基因SMARCB1或SMARCA4失活[37]。臨床上超過70%的患有MRT的兒童存在遠處轉(zhuǎn)移，該病預(yù)后極差，單獨化療少有療效，總生存率僅為5%[38]，現(xiàn)階段以長春新堿、卡鉑、放線菌素等為首的傳統(tǒng)化療方案對兒童身體負擔(dān)過重，急需新的治療方案。

Renard等[39]認為SMARCB1或SMARCA4表達缺失會嚴重影響SWI/SNF復(fù)合物結(jié)構(gòu)與功能的完整性，造成該復(fù)合物功能或結(jié)構(gòu)的殘缺。另有研究表明MRT主要通過表觀遺傳學(xué)途徑發(fā)生，SWI/SNF復(fù)合物結(jié)構(gòu)功能的完整性在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用，組蛋白H3K27的甲基化水平往往受其嚴格調(diào)控[40]。

表觀遺傳學(xué)修飾在多種惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中扮演重要角色，近年來被廣泛研究。其主要調(diào)節(jié)性機制包括DNA修飾、組蛋白修飾(甲基化、乙?；刃揎?等。兒童MRTK的病因及發(fā)病機制較為復(fù)雜，至今仍不明確。近年主流的觀點認為其與表觀遺傳修飾密切相關(guān)，并已作為兒童MRTK的潛在治療靶點受到廣泛關(guān)注[32]；隨著研究的不斷深入，在MRTK中許多對DNA和組蛋白進行修飾的酶的表達與活性變化被發(fā)現(xiàn)[41]。

大量研究結(jié)果表明H3K27蛋白的甲基化可以抑制多種效應(yīng)分子與之結(jié)合，該蛋白甲基化水平的過度升高會導(dǎo)致包括與細胞周期及細胞凋亡等相關(guān)基因的調(diào)控發(fā)生紊亂，致使包括P16、P21、Bcl-2、Bax、P53等表達異常，進而誘導(dǎo)細胞癌變的發(fā)生[29-30，32，42]。

五、結(jié)論

綜上所述，牡荊素的主要下游靶點與MRTK主要致病因子的下游靶點吻合度極高，這使我們對其在MRTK的治療效果擁有較高期待；而H3K27me3的甲基化水平變化在其中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。HIF-1α不僅作為牡荊素抗腫瘤的一個關(guān)鍵靶標更作為H3K27me3甲基化水平調(diào)控的下游蛋白，進一步提示了牡荊素可能通過表觀遺傳學(xué)水平發(fā)揮調(diào)控作用。目前還沒有進一步證據(jù)表明牡荊素對MRTK的治療作用是否確切，但大量文獻報道可驗證我們的猜想：牡荊素可通過表觀遺傳學(xué)途徑來調(diào)控HIF-1α的表達，例如改變H3K27me3甲基化水平，進而改善MRTK的發(fā)生及發(fā)展。MRTK與腎透明細胞肉瘤等兒童罕見腎惡性腫瘤相似[43]，傳統(tǒng)的治療手段毒副作用大，預(yù)后差[44]。隨著牡荊素抗腫瘤作用機制的日益完善，其對MRTK的潛在治療價值與優(yōu)勢顯得愈發(fā)突出。

盡管牡荊素已在心血管疾病的治療中作為輔助用藥投入臨床，并證實了其安全性及可靠性；但目前臨床上尚無將其應(yīng)用于抗腫瘤治療療效的相關(guān)報道。本文從MRTK發(fā)病機制以及牡荊素對其潛在的抗腫瘤靶點作用兩個方面的挖掘分析，闡明牡荊素的潛在抗腫瘤藥用價值，為臨床MRTK的治療提供了新的思路。我們認為，如果將牡荊素成功應(yīng)用于MRTK的治療，勢必會改善目前放化療不良反應(yīng)過重、費用昂貴且效果不佳的弊端，最大限度地降低傳統(tǒng)放化療對患者身心健康的影響，提高MRTK患兒的存活率。