彭美玲，郝剛，唐善虎，李思寧

(西南民族大學 食品科學與技術學院，四川 成都，610041)

被譽為 “高原之舟”的牦牛，生活在高海拔地帶，是高原牧區(qū)的主要家畜之一，大都生活在我國青藏高原。它極其耐寒，適應高海拔、低氧的氣候環(huán)境，因而牦牛肉不同于其他品種的牛肉[1]。牦牛肉味道鮮美、高蛋白、低脂、富含多種氨基酸，是極富營養(yǎng)且高經(jīng)濟價值的天然綠色肉食品[2]。

殼聚糖(chitosan，CS)與乳酸鏈球菌素(Nisin)是常用的食品保鮮劑，肉制品中添加Nisin可以使肉腸的色澤更加鮮艷[3]。殼聚糖復合抗菌膜對貯藏過程中冷鮮肉的揮發(fā)性鹽基氮、感官等指標有影響，能夠有顯著延緩冷鮮肉的腐敗[4-5]。殼聚糖涂層也能很好地抑制冷凍魚的變質(zhì)[6-7]。殼聚糖復合膜包裝豬肉腸貯藏于4 ℃條件下，肉腸的顏色，質(zhì)地、脂質(zhì)氧化等方面的變化均低于對照組(未添加殼聚糖)[8]。徐暢等[9]研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖復合保鮮能夠改善冷鮮豬肉的感官品質(zhì)，降低汁液流失率，并抑制微生物生長。Nisin處理冷鮮羊肉的保鮮在4 ℃下的貨架期可從6 d 延長至18 d[10]。侯曉衛(wèi)等[11]研究發(fā)現(xiàn)Nisin能抑制冷鮮牦牛肉貯藏過程中菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮的增長。乳酸鏈球菌素能有效抑制單核細胞增生李斯特菌、蠟樣芽胞桿菌、肉毒梭狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性細菌[12]。楊雯舸等[13]研究了Nisin與植物乳酸桿菌素的復合膜對冷鮮豬肉保鮮時間可延長4 d。乳酸鏈球菌素復合其他保鮮劑可有效提高肉制品的安全性，抑制腐敗微生物生長[14-16]。

月桂酰精氨酸乙酯(lauroyl giycine ethyl ester，LAE)是一種新型食品保鮮劑，對許多食源性病原菌有較高的抑制性能[17]。LAE早在2005年已被FDA批準為一般公認安全(GRAS)食品添加劑，2012年澳大利亞食品標準局發(fā)布134號食品標準修訂公告，批準將LAE作為食品保鮮劑使用于香腸與香腸肉中，規(guī)定最大使用量為315 mg/kg[18]。有文獻報道LAE可應用于乳制品、果蔬和肉制品[19-21]保鮮，李陽等[22]研究了LAE對果蔬腐敗菌的抑菌性能，包括意大利青霉、指狀青霉、鏈格孢和灰葡萄孢，并測定了LAE對4種菌的最小抑菌濃度分別為400、400、200、400 μg/mL。研究者測定LAE對2株大腸桿菌0157∶H7的抗菌性，證明含有26%LAE的薄膜包裝對綿羊奶酪中細菌的數(shù)量有影響[23]。研究者將LAE制成薄膜用于即食食品保鮮，對大腸桿菌有顯著的抑制作用[24]。但將LAE與其他保鮮劑復配的研究較少，殼聚糖與Nisin是安全性高、抑菌性強、生物相容性好抑菌保鮮劑，LAE與上述2種抑菌劑復配能顯著提高保鮮能力。牦牛肉腸具有高品質(zhì)、高營養(yǎng)的特點，但在貯藏過程中容易滋生細菌而影響其品質(zhì)。本試驗研究了單獨使用LAE 以及將LAE與殼聚糖、Nisin復配應用于牦牛鮮肉腸中，探究其對牦牛鮮肉腸貯藏期間品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：牦牛肉(背最長肌)，四川紅原牦牛肉食品責任有限公司；豬腸衣、肥豬膘，成都農(nóng)貿(mào)市場；月桂酰精氨酸乙酯，BR 成都傲飛生物化學品責任有限公司；殼聚糖(食品級)，深圳市星牧生物工程有限公司；Nisin(食品級)，山東元泰生物工程有限公司。

輔料：食鹽、五香粉、料酒、雞精，成都農(nóng)貿(mào)市場。

主要試劑：氧化鎂、硼酸、鹽酸、甲基紅指示劑、無水乙醇，均為分析純，成都科龍化工試劑廠。

試驗儀器：BSA224S-CW型電子天平，賽多利斯儀器有限公司；PHS-320型 pH計，成都世紀方舟科技有限公司；XR53648型電熱恒溫水浴鍋，金壇區(qū)西城新瑞有限公司；5810R型臺式冷凍離心機，德國Eppendorf公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 牦牛肉腸制作工藝

牦牛鮮肉腸工藝流程：原料肉→修整切塊→混料拌勻→腌制→絞肉→灌腸→結(jié)扎排氣→成品。具體流程：精選優(yōu)質(zhì)牦牛肉和豬肥膘，清洗后修整除去筋膜、筋腱，切成約2 cm×2 cm×2 cm的塊狀，瀝干表面水分，將原料[m(豬肥膘)∶m(牦牛肉)=3∶7]、輔料(原料以100%計，食鹽3.5%，五香粉0.5%，雞精0.4%，料酒1.0%，均為質(zhì)量分數(shù))混合均勻，置于4 ℃冰箱腌制24 h，當肉呈現(xiàn)均勻鮮紅色、手觸有質(zhì)感、滑膩感，完成腌制，分別將LAE保鮮組分混入腌制完畢的牦牛肉中攪碎，灌裝成長度為5～8 cm 的腸體，用排氣針扎眼排除腸內(nèi)氣體后放置于0～4 ℃冰箱低溫貯藏，于第0、3、6、9、12、15天測定指標。各處理組如下：

(1)對照組：不添加任何保鮮劑，僅以牦牛肉與豬肥膘為主原料，添加輔料混勻后灌腸。

(2)低濃度LAE組：LAE的添加量為0.1 g/kg，并以牦牛肉與豬肥膘為主原料，添加輔料混勻后灌腸。

(3)高濃度LAE組：LAE的添加量為0.3 g/kg，并以牦牛肉與豬肥膘為主原料，添加輔料混勻后灌腸。

(4)LAE與Nisin復配組：LAE(0.2 g/kg)+Nisin(0.3 g/kg)，并以牦牛肉與豬肥膘為主原料，添加輔料混勻后灌腸。

(5)LAE與CS復配組：LAE(0.2 g/kg)+CS(5 g/kg)，并以牦牛肉與豬肥膘為主原料，添加輔料混勻后灌腸。

(6)LAE、Nisin與CS復配組：LAE(0.2 g/kg)+Nisin(0.3 g/kg)+CS(5 g/kg)，并以牦牛肉與豬肥膘為主原料，添加輔料混勻后灌腸。

1.2.2 汁液流失率測定

參考李儒仁等[25]的方法，于各測定時間點取出牦牛鮮肉腸，迅速將試樣表面的汁液用濾紙吸干稱重(記為M2)，貯藏前試樣的質(zhì)量為M1，從而計算其失水率，每個樣品重復3次取平均值。計算如公式(1)所示：

(1)

式中：M1為貯藏前試樣的質(zhì)量；M2為貯藏后試樣的質(zhì)量。

1.2.3 pH測定

取攪碎的牦牛鮮肉腸樣品5 g置于小燒杯內(nèi)，加入50 mL蒸餾水混合，室溫靜置15 min左右過濾，將酸度計的玻璃電極插入濾液內(nèi)，并在酸度計表頭上讀出其pH值。分別在第0、3、6、9、12、15天測其pH值，每個樣品重復3次取平均值。

1.2.4 蒸煮損失

將牦牛鮮肉腸切成約5 g(M1)，用樣品袋裝好，將袋中氣體擠出，放入水浴鍋85 ℃加熱10 min，取出沖水冷卻10 min至室溫，再次稱重，計為M2，計算如公式(2)所示：

(2)

1.2.5 揮發(fā)性鹽基氮測定

采用自動凱氏定氮儀法測定牦牛鮮肉腸中揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)[26]。

1.2.6 感官評價

牦牛鮮肉腸在沸水中煮熟取出后，晾5 min，用刀將其切成3 mm左右的片狀，邀請10位有一定感官品評經(jīng)驗的人，分別從外觀、色澤、香氣、質(zhì)地4個方面進行肉腸感官評價，詳見表1。

表1 牦牛鮮肉腸的感官評價標準Table 1 Sensory evaluation criteria of yak sausage

1.2.7 抗菌活性的評估

1.2.7.1 菌落總數(shù)的測定

按照國標GB 4789.2—2016測定牦牛鮮肉腸中菌落總數(shù)[27]。

1.2.7.2 CFU-time關系模型

CFU-time關系變化邏輯函數(shù)可提供良好評估LAE及與其他保鮮劑復配在肉腸中的抑菌效果的模型(圖1)，計算見公式(3)：

(3)

式中：CFU(t)為細菌達到最大生長速度的菌落數(shù)；CFUasym為漸近CFU值(由于對照組在15 d貯藏期內(nèi)菌落生長沒有達到固定值，即生長曲線調(diào)整值)；k為生長曲線在拐點處(即生長速率最大值)的斜率，tc為添加LAE應用生長曲線拐點的位置；t為對照組生長曲線拐點的位置。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、IBM SPSS Statistics 20軟件進行統(tǒng)計分析，差異顯著用P<0.05表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同LAE處理組對牦牛鮮肉腸貯藏期間汁液流失率的影響

牦牛鮮肉腸貯藏期間汁液流失率如表2所示，在整個貯藏期15 d內(nèi)，對照組與保鮮組的汁液流失率都呈顯著增大的趨勢(P<0.05)。低濃度LAE組與高濃度LAE組的增加趨勢小于對照組，且低濃度LAE的汁液流失率大于高濃度LAE。LAE+Nisin和LAE+CS組汁液流失率低于對照組與低濃度LAE組，且LAE+CS遠小于高濃度LAE與低濃度LAE組，但LAE+Nisin卻略大于高濃度LAE，說明LAE+CS在一定時間內(nèi)能顯著降低牦牛肉腸的汁液流失率，而LAE+Nisin復配阻止汁液流失的效果并不明顯。對照組第15天汁液流失最為嚴重，為1.679%，LAE+Nisin+CS在貯藏期間表現(xiàn)出較小的汁液流失率。由于添加保鮮劑后抑制細菌生長，從而細菌分泌的蛋白酶少，被水解的蛋白少，肌肉的凝膠結(jié)構(gòu)就能保持，從而留住水分；另一方面，腐敗菌被抑制后，牦牛肉腸的pH變化不大，蛋白質(zhì)凈電荷變化就不大[28]，蛋白質(zhì)持水力變化也不大，因此能較好地留住水分，而LAE+CS和LAE+Nisin+CS的汁液流失率遠小于組其他處理組，可能是因為殼聚糖具有保水性,能夠使保水能力得到進一步加強[29]。

表2 牦牛鮮肉腸貯藏期間汁液流失率的變化Table 2 Changes of juice leakage during storage of yak sausage

2.2 不同LAE處理組對牦牛鮮肉腸貯藏期間pH值的影響

牦牛鮮肉腸中細菌生長與肉的pH值有直接關系，當肉的pH值在6.0或者小于6.0時，會抑制細菌的繁殖，肉中蛋白質(zhì)分解程度相對較小，肉質(zhì)新鮮。但隨貯藏時間延長，細菌生長繁殖速度加快，導致蛋白質(zhì)分解，氨及胺類等物質(zhì)大量蓄積，導致pH值增加，達到6.7或高于6.7，此時肉已腐敗變質(zhì)[9]。

貯藏期間牦牛肉腸的pH值變化如表3所示，肉腸在貯藏過程中pH值總體呈增大的趨勢，對照組在15 d內(nèi)各測量時間點的pH值變化差異顯著(P<0.05)。低濃度LAE和高濃度LAE組除了在第0天和第9天時差異不顯著，其他時間點的pH值變化差異顯著(P<0.05)，說明不同LAE濃度在一定時間內(nèi)對牦牛肉貯藏期pH變化有影響，且高濃度LAE保鮮效果優(yōu)于低濃度LAE。低濃度LAE、高濃度LAE與LAE+Nisin、LAE+CS在貯藏期內(nèi)pH值變化差異顯著(P<0.05)，說明LAE復合保鮮效果優(yōu)于單一LAE處理組，LAE+Nisin和LAE+CS在3 d后pH值變化差異不顯著(P>0.05)，證明LAE+Nisin和LAE+CS對pH值變化影響相當。LAE+Nisin+CS組在前9 d pH值增大差異不顯著，第9天后增大趨勢顯著，說明3種保鮮劑復配在一定時間內(nèi)具有良好保鮮效果。到第15天時對照組的pH值最大，其次是LAE低、高濃度組，再次為LAE+Nisin、LAE+CS復配組，而3種保鮮劑復配時pH值最小，為6.22，說明以上3種保鮮劑復配能顯著抑制細菌的生長對pH值帶來的影響。

2.3 不同LAE處理組對牦牛鮮肉腸貯藏期間蒸煮損失的影響

在貯藏過程中，隨時間的延長，牦牛鮮肉腸纖維中的蛋白質(zhì)由于微生物生長導致蛋白質(zhì)被細菌酶分解，肉中蛋白質(zhì)三維網(wǎng)狀凝膠結(jié)構(gòu)遭到破壞，影響其鎖水能力，另外，灌腸類食品屬乳化體系，在貯藏和蒸煮過程中容易出水出油[30]，因此在蒸煮過程中會造成一定耗損。牦牛鮮肉腸貯藏期間的蒸煮損失如表4所示，對照組與保鮮組的蒸煮損失均呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(P<0.05)。但總體而言，第15天對照組蒸煮損失最大，為44.86%。低濃度LAE、高濃度LAE、LAE+Nisin的蒸煮損失小于對照組，且相差不大，證明添加LAE或其與Nisin復配在一定程度上可減少蒸煮損失，LAE+CS又優(yōu)于LAE+Nisin，表明LAE+CS的復配效果優(yōu)于LAE+Nisin，總體而言，LAE+Nisin+CS在第15天時的蒸煮損失最小，可能是由于LAE復合保鮮劑的抑菌和抑酶作用，一定程度上可緩減由微生物引起肌肉蛋白降解及組織特性被破壞，另外殼聚糖具有成膜性，可阻礙肉腸各成分的散失，也有助于減少損失[28]。

表4 牦牛鮮肉腸貯藏期間蒸煮損失的變化Table 4 Changes of cooking loss of yak sausage during storage

2.4 不同LAE處理組對牦牛鮮肉腸貯藏期間感官的影響

牦牛鮮肉腸在貯藏過程中，受微生物污染以及內(nèi)部自身酶的作用，肉腸品質(zhì)逐漸下降，切面無光澤并伴有異味。牦牛鮮肉腸感官變化如表5所示，各個組在貯藏期內(nèi)的感官評分均為降低的趨勢(P<0.05)，對照組下降的趨勢最為顯著，低濃度LAE和高濃度LAE在3 d后的評分均高于對照組，且高濃度LAE高于低濃度LAE，證明LAE高濃度有利于抑制腐敗，提高其感官評分，組LAE+Nisin、LAE+CS在第15天的評分高于高濃度LAE組，則證明通過復配后保鮮效果更好，且LAE+CS優(yōu)于LAE+Nisin。LAE+Nisin+CS在各時間點的評分相對最高，通過3種保鮮劑復配后抑制微生物生長的能力最強，顯著延緩了肉腸腐敗變質(zhì)，在第15天時還有芳香味。

表5 牦牛鮮肉腸貯藏期間感官的影響Table 5 Sensory effects of yak sausage during storage

2.5 不同LAE處理組對牦牛鮮肉腸貯藏期間TVB-N的影響

TVB-N常作為衡量肉腐敗的重要指標。牦牛鮮肉腸在貯藏過程中，隨時間延長，由于肉內(nèi)的內(nèi)源性酶和微生物作用，少量蛋白質(zhì)降解生成微量的胺類物質(zhì)[31]。由圖2可知，對照組與保鮮處理組在貯藏15 d內(nèi)的TVB-N均呈現(xiàn)顯著增長的趨勢(P<0.05)，其中對照組的增長趨勢最為顯著(P<0.05)，在第9天時達到(20.1±0.266) mg/100g，此時肉腸已腐敗變質(zhì)，添加 LAE相比于對照組能抑制TVB-N增長，且其抑制程度與LAE濃度有關，濃度越大抑制作用越強，LAE與Nisin和CS復合保鮮的抑制效果強于單一LAE作用，2組復配效果相當。當3種保鮮劑復合使用時，其抑制效果最好，到第15天時，其TVB-N值為(16.5±0.368) mg/100g，這一結(jié)果與菌落總數(shù)結(jié)果相一致。因此，相比于對照組，在牦牛肉腸中添加LAE復合保鮮劑具有良好的保鮮效果。

2.6 不同LAE處理組對牦牛鮮肉腸貯藏期間菌落總數(shù)的影響

根據(jù)肉質(zhì)腐敗變質(zhì)的評價標準，以菌落總數(shù)計：一級鮮肉(0～104CFU/g)、次級鮮肉(104～106CFU/g)、腐敗變質(zhì)肉大于106CFU/g。牦牛鮮肉腸貯藏過程中菌落總數(shù)變化如圖3所示，所有組別在貯藏期間菌落總數(shù)都顯著增加(P<0.05)，其中對照組增大的趨勢最顯著(P<0.05)，其在第6天后開始逐漸腐敗變質(zhì)，其次是低濃度LAE組，再次是高濃度LAE組，LAE+Nisin與LAE+CS的抑菌效果優(yōu)于高濃度LAE組，LAE+Nisin和LAE+CS復配組對牦牛鮮肉腸的抑菌效果相差不大。到第15天時，除了對照組與低濃度LAE組，其他處理組均為次級鮮肉，且在第15天時LAE+Nisin+CS組菌落總數(shù)增加量最小，為4.20 lgCFU/g，接近一級鮮肉標準。說明LAE能顯著抑制肉腸中腐敗菌的生長，且隨濃度增大抑菌效果越強，復配后保鮮效果強于LAE單一保鮮效果，3種保鮮劑復配能有效抑制肉腸中腐敗菌的生長，保鮮效果最顯著。

2.7 不同LAE保鮮組抗菌活性評估

CFU-time關系變化邏輯函數(shù)模型衡量了由于保鮮劑的加入導致細菌生長延遲，可量化評估保鮮劑在肉腸中的抑菌活性。通過此模型，可比較各保鮮組生長曲線拐點相對于對照組延長的時間，即Δtc(d)。生長曲線的斜率即是細菌生長速率，隨著貯藏期的延長，生長速率逐漸增大至最大值，即拐點處的斜率，此后生長速率逐漸降低。Δtc=(tc對照-tc不同保鮮組)，所有模型R2≥0.916。Δtc(d)越大則該保鮮配方的抑菌活性越高，結(jié)果如表6所示。

表6 不同處理組Δtc值Table 6 Different Δtc value of the treatment group

由表6可看出，不同LAE保鮮組合推遲細菌生長速率達到最大值的活性如下：LAE(低濃度)

由表6可知，在肉腸中加入LAE能夠顯著延長Δtc，因LAE具有表面活性，且?guī)д姡赏ㄟ^與帶相反電荷的蛋白質(zhì)或酶反應從而破壞腐敗微生物的細胞膜，抑制其生長，LAE與其他保鮮劑復合使用更能延長Δtc，LAE+Nisin+CS復配的Δtc最大，能推遲細菌達最大生長速率時間至9.1 d，其抑菌效果最顯著。

3 結(jié)論

本試驗中，各處理組對牦牛鮮肉腸的總體保鮮能力大小為：LAE+Nisin+CS>LAE+CS>LAE+Nisin>LAE(高濃度)>LAE(低濃度) >對照。復合保鮮劑保鮮效果顯著，在15 d貯藏期能降低蒸煮損失及汁液流失率，抑制腐敗菌的生長，延長腐敗菌達到最大生長速度的時間Δtc，保持良好感官品質(zhì)。綜上，LAE通過與CS或Nisin復配能有效提高牦牛鮮肉腸的保鮮能力，延長貨架期，這可為牦牛鮮肉腸復合保鮮劑的開發(fā)、生產(chǎn)應用提供新方向。