林娟，韓玲*，陳顥予，余群力，李維正，朱躍明，張偉，韓明山

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州， 730070)2(張掖市萬(wàn)禾草畜產(chǎn)業(yè)科技開發(fā)公司，甘肅 張掖， 734000) 3(甘肅康美現(xiàn)代農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)集團(tuán)有限公司，甘肅 臨夏， 731500)4(內(nèi)蒙古科爾沁牛業(yè)股份有限公司，內(nèi)蒙古 通遼， 028000)

牛肉因其具有高蛋白低脂肪、營(yíng)養(yǎng)豐富和味道鮮美等特點(diǎn)，深受消費(fèi)者的青睞[1]。隨著社會(huì)的發(fā)展、人們生活質(zhì)量的不斷提高，對(duì)肉制品安全和品質(zhì)的關(guān)注度也逐漸提高。冷鮮牛肉因其嫩度好、顏色新鮮和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高而優(yōu)于冷凍和冷藏牛肉[2]。但在貯藏、運(yùn)輸和銷售環(huán)節(jié)中，易受到外部微生物或自身酶的影響，發(fā)生脂肪和蛋白氧化，從而導(dǎo)致腐敗變質(zhì)[1,3]，同時(shí)氧化產(chǎn)生的系列產(chǎn)物會(huì)影響肉品的品質(zhì)以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，導(dǎo)致色澤劣變、風(fēng)味惡化、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失等[4-6]。目前，添加抗氧化劑是防止肉制品中脂肪和蛋白氧化的方法之一，但人工合成的抗氧化劑存在較多的安全隱患，對(duì)人體健康具有不利影響，甚至能致癌[7]。天然抗氧劑因其具有較高的安全性、抗氧化能力和一定的保鮮作用，越來(lái)越受到人們的青睞[8]。因此，天然抗氧化劑在肉及肉制品中的應(yīng)用成為人們關(guān)注和研究的熱點(diǎn)。

多酚類物質(zhì)是一類具有生物活性的植物次生代謝產(chǎn)物[9]，廣泛分布于植物的根、莖、葉、皮和果中，在自然界的儲(chǔ)量非常豐富[10]。研究表明，植物多酚因具有抗氧化、抗菌和抗炎等特性[11-12]，開發(fā)前景良好。這些特性能改善肉品質(zhì)，并且能夠抑制肉制品中微生物的生長(zhǎng)、延緩脂肪和蛋白氧化，從而延長(zhǎng)其保質(zhì)期[8]。甜瓜營(yíng)養(yǎng)豐富，含有大量的可溶性糖、維生素C、氨基酸、有機(jī)酸和可溶性蛋白質(zhì)等物質(zhì)[13]，其果肉性寒，具有利尿、除煩熱等功效[14]。目前甜瓜主要以鮮品和甜瓜干形式銷售，其他形式的產(chǎn)品較為少見，而甜瓜皮和不少殘次瓜被隨意丟棄或者直接喂養(yǎng)牲畜，這造成很大的農(nóng)產(chǎn)品資源浪費(fèi)，既浪費(fèi)資源又污染環(huán)境。植物多酚提取方法主要有超聲波輔助法、溶劑浸提法、微波提取法、超臨界CO2提取法、生物酶解提取法以及超高壓提取法等[15]。超聲波輔助法是利用超聲波的機(jī)械和空化作用從而產(chǎn)生振動(dòng)使細(xì)胞壁破碎，有效成分短時(shí)間被釋放，減少了多酚的氧化破壞[16]。相比傳統(tǒng)方法，超聲波輔助法耗時(shí)短、提取率高，近年來(lái)受到廣泛應(yīng)用[15]。然而，目前采用超聲波輔助法提取甜瓜皮中多酚且甜瓜皮多酚在肉及肉制品貯藏中的影響，國(guó)內(nèi)外鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。

本文采用超聲波輔助法提取甜瓜皮多酚，響應(yīng)面法優(yōu)化多酚提取工藝，選用不同濃度甜瓜皮多酚保鮮牛肉，在4 ℃條件貯藏，分別在第0、1、3、5、7、9天測(cè)定牛肉的pH、色度、揮發(fā)性鹽基氮(total volatile base nitrogen，TVB-N)、硫代巴比妥酸反應(yīng)物(thiobarbituric acid reactant substances，TBARS)值并結(jié)合感官評(píng)價(jià)，探究甜瓜皮多酚對(duì)牛肉保鮮過(guò)程中品質(zhì)的變化，旨在為甜瓜皮的深加工和利用、延緩和降低肉制品貯藏過(guò)程中的品質(zhì)劣變提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“瑪瑙”厚皮甜瓜，甘肅省民勤縣收成鄉(xiāng)露地栽培大田，將瓜皮打漿破碎，于-18 ℃冰箱中保存，使用前置于4 ℃的冰箱中融解備用；牛肉，甘肅省武威市天祥肉類加工有限公司。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、福林酚試劑，上海源葉生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、無(wú)水碳酸鈉、三氯乙酸、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、乙二胺四乙酸二鈉、2-硫代巴比妥酸，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-500E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TGL-24MC高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；PHS-3C數(shù)顯酸度計(jì)，上海宇隆儀器有限公司；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海雅榮生化儀器有限公司；CR-10型色度計(jì)，柯尼美能達(dá)有限公司；WFZ UV-2802SH型紫外可見分光光度計(jì)，上?？聝x器有限公司；K9840型自動(dòng)凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 甜瓜皮多酚的提取

甜瓜皮多酚的提取工藝流程如下：

甜瓜皮→破碎、打漿→超聲波輔助提取→抽濾→多酚粗提液→離子沉淀純化→乙酸乙酯萃取→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→多酚提取液→真空冷凍干燥→多酚粉末

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用福林-酚法測(cè)定[17]。稱量20 mg沒食子酸于20 mL 容量瓶，加蒸餾水溶解并定容，配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取1、2、3、4、5 mL上述標(biāo)準(zhǔn)液于100 mL容量瓶，定容，稀釋成質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL。各取1 mL置于10 mL具塞比色管，加入0.25 mL福林酚試劑，室溫下反應(yīng)5 min 后加入15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Na2CO3溶液1 mL，定容，50 ℃水浴10 min，冷卻，在760 nm處測(cè)定吸光度。

1.3.3 多酚提取率的測(cè)定

取甜瓜皮多酚粗提液1.0 mL，按沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的方法進(jìn)行測(cè)定。平行測(cè)定3次，取平均值。通過(guò)線性回歸方程計(jì)算甜瓜皮多酚濃度，多酚提取率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：C表示多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V表示粗提液體積mL；n表示稀釋倍數(shù)；m表示原料質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(40%、50%、60%、70%、80%)、液料比[5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1(mL∶g),后同]、超聲時(shí)間(30、60、90、120、150 min)、超聲溫度(30、40、50、60、70 ℃)對(duì)提取率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲時(shí)間和超聲溫度設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)。

1.3.6 肉樣處理

開啟紫外線燈殺菌30 min，在無(wú)菌環(huán)境下去除脂肪和筋膜，將肉塊分割成方形，每塊大約100 g。分別用無(wú)菌水和不同濃度的多酚濃縮液浸泡約5 min，取出瀝干2～5 min后用無(wú)菌保鮮袋分裝于4 ℃冷藏條件保存，在第0、1、3、5、7、9天對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7 指標(biāo)測(cè)定

1.3.7.1 pH值

參照楊斌等[2]的方法，用便攜式酸度計(jì)測(cè)定肉樣pH值，將酸度計(jì)探頭插入到肉樣中，待酸度計(jì)讀數(shù)穩(wěn)定后記錄。

1.3.7.2L*值和a*值

參照楊斌等[2]的方法，將牛肉切面自然氧合30 min，校準(zhǔn)色差計(jì)后，垂直于牛肉切面進(jìn)行測(cè)量。

1.3.7.3 揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定

參照GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》[18]中的半微量定氮法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7.4 硫代巴比妥酸反應(yīng)物

參照GB 5009.181—2016《食品中丙二醛的測(cè)定》[19]中的分光光度法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7.5 感官評(píng)價(jià)

參考郝瑞等[20]的方法稍作修改進(jìn)行評(píng)定，每項(xiàng)指標(biāo)滿分為10分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 感官評(píng)價(jià)表Table 1 Sensory evaluation table

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)均平行3次，數(shù)據(jù)取平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 9.0軟件繪圖和SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(ANOVA)和多重比較(Duncan法)，差異顯著水平為0.05，Design Expert 8軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果分析

圖1-a為乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚提取率的影響，多酚提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的上升逐漸增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，多酚提取率最高，且顯著,高于乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%的多酚提取率(P<0.05)，其原因可能是乙醇體積分?jǐn)?shù)在一定的條件下，能有效促進(jìn)多酚類物質(zhì)的溶解[17]。繼續(xù)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，多酚提取率變化差異不顯著，可能是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)增大，一些弱極性成分、醇溶性色素等雜質(zhì)溶解，抑制了有效多酚物質(zhì)的充分溶出[15]。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

液料比對(duì)多酚提取率的影響如圖1-b所示，多酚提取率隨液料比的增加先增加后趨于平緩，可能是因?yàn)橐欢w積的乙醇溶劑可以促進(jìn)多酚類物質(zhì)的溶出，當(dāng)液料比為20∶1時(shí)，多酚提取率最高，此時(shí)多酚類物質(zhì)的溶解度達(dá)到飽和狀態(tài)[17]。繼續(xù)增大液料比，多酚提取率變化不顯著，可能是因?yàn)橐掖既軇┑脑黾邮挂恍┥睾痛既苄缘入s質(zhì)溶解[21]，阻止了有效成分的溶出，因此選用液料比為20∶1。

圖1-c為超聲時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響，多酚提取率隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)槌暡ㄊ辜?xì)胞組織破壞，促進(jìn)多酚類物質(zhì)溶出，但超聲時(shí)間過(guò)短會(huì)導(dǎo)致多酚類物質(zhì)提取不充分[17]，超聲60 min時(shí)提取率最高。繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間，超聲波產(chǎn)生強(qiáng)烈的熱效應(yīng)導(dǎo)致一些不穩(wěn)定多酚被分解轉(zhuǎn)化，同時(shí)超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使多酚類物質(zhì)被氧化分解，導(dǎo)致多酚提取率下降[21]，故選擇超聲時(shí)間為60 min。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、液料比(B)、超聲時(shí)間(C)、超聲溫度(D)4個(gè)單因素，進(jìn)行4因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果和方差分析結(jié)果分別見表2、表3。

通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析軟件Design Expert 8對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，得到二次多元回歸線性方程:

Y=5.37+0.078A+0.14B-0.005C-0.091D-0.21AB+0.20AC-0.15AD+0.14BC-0.068BD+0.26CD-0.58A2-0.67B2-0.79C2-0.71D2

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and results

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

F值的大小反映因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度[21]，由F值可知，各個(gè)因素對(duì)多酚提取率的影響從弱到強(qiáng)依次為液料比、超聲溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時(shí)間。其中一次項(xiàng)B、二次項(xiàng)、交互項(xiàng)CD對(duì)多酚提取率的影響極顯著(P<0.01)，交互項(xiàng)AB、AC差異顯著(P<0.05)。

各因素對(duì)甜瓜皮多酚提取率影響的響應(yīng)面曲線圖如圖2所示。主要反映了乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲時(shí)間和超聲溫度之間的相互作用關(guān)系。響應(yīng)面圖形坡度越陡峭、越傾斜，說(shuō)明兩因素的交互作用越強(qiáng)[17]。由3D圖可知超聲溫度與超聲時(shí)間交互效應(yīng)極顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間交互效應(yīng)顯著。

我國(guó)農(nóng)業(yè)水價(jià)整體偏低，現(xiàn)行水價(jià)政策在定價(jià)方面存在不合理情況，水費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)不符合經(jīng)濟(jì)規(guī)律，其根據(jù)供水成本進(jìn)行收費(fèi)，成本中排除農(nóng)業(yè)投勞折資導(dǎo)致的固定資產(chǎn)折舊，使得水費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)低于供水成本，弱化了水資源的價(jià)值。水價(jià)偏低致使人們節(jié)水意識(shí)低下，無(wú)法發(fā)揮市場(chǎng)的調(diào)控作用，造成水資源的大量浪費(fèi)。

2.3 最優(yōu)提取工藝及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用響應(yīng)面優(yōu)化分析，得到甜瓜皮多酚提取的最優(yōu)工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60.61%，液料比20.51∶1，超聲時(shí)間60.02 min，超聲溫度39.25 ℃，此條件下得到的甜瓜皮多酚提取率為5.39 mg/g。但考慮實(shí)際操作范圍，將提取工藝參數(shù)調(diào)整為：乙醇體積分?jǐn)?shù)61%，液料比21∶1，超聲時(shí)間60 min，超聲溫度 40 ℃。在最優(yōu)工藝下平行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到甜瓜皮多酚的平均提取率為5.31 mg/g。與理論預(yù)測(cè)值的誤差為1.5%。因此，利用響應(yīng)面優(yōu)化的工藝穩(wěn)定，可行。

2.4 甜瓜皮多酚對(duì)貯藏期間牛肉品質(zhì)的影響

2.4.1 pH

pH是評(píng)價(jià)肉類新鮮程度的重要指標(biāo)之一[2]。根據(jù)GB/T 9695.5—2008，pH 5.8～6.2為一級(jí)鮮度，pH 6.3～6.6為二級(jí)鮮度，高于6.7為變質(zhì)肉。從圖3可以看出，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，牛肉的pH值均先下降后上升，可能是因?yàn)樵缀笄捌趧?dòng)物肌肉發(fā)生糖酵解，最終產(chǎn)物是乳酸，導(dǎo)致pH值下降，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，在內(nèi)源酶和微生物的作用下使蛋白分解產(chǎn)生堿性含氮物質(zhì)，致使肉的pH上升[23]。對(duì)照組pH值均顯著低于處理組，且pH值隨添加量的增加升高緩慢，對(duì)照組在第9天時(shí)，pH值為6.44，多酚處理組在第9天時(shí)pH均顯著低于對(duì)照組，這說(shuō)明多酚對(duì)冷卻肉具有很強(qiáng)的抑菌作用和保鮮效果，可以延長(zhǎng)牛肉的保質(zhì)期。

2.4.2 色度

色澤在一定程度上反映肉的感官品質(zhì)，直接影響消費(fèi)者的喜好[2]。不同處理組牛肉在貯藏過(guò)程中色度變化如表4所示。L*隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，可能是因?yàn)殡S貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)的變性程度增加，肉的保水性下降，肌肉內(nèi)部的水分滲出堆積在肉的表面，提高了對(duì)光的反射能力[24]，而對(duì)照組的L*值在整個(gè)貯藏期間總體顯著高于中高濃度多酚處理組(P<0.05)，說(shuō)明多酚較好地抑制了肉中水分的流失。a*值的變化與肌紅蛋白的含量和狀態(tài)關(guān)系密切[25]。對(duì)照組、處理組a*值均隨著保藏時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)?？赡苁且?yàn)橘A藏前期肌紅蛋白與空氣中O2反應(yīng)，生成氧合肌紅蛋白，使a*不斷上升；貯藏后期肉中氧合肌紅蛋白(MbO2)逐步被氧化為高鐵肌紅蛋白(MetMb)，導(dǎo)致a*值下降。中高濃度處理組的a*值均顯著低于對(duì)照組，可能是因?yàn)榉宇愇镔|(zhì)可與Fe2+離子絡(luò)合，從而抑制肉色的褐變[26]。

表4 貯藏期間牛肉色度的變化Table 4 Changes in color of beef during storage

2.4.3 TVB-N

TVB-N是檢驗(yàn)肉品新鮮度的重要指標(biāo)[27]。肉在貯藏期間由于受到微生物和酶的作用將蛋白質(zhì)分解為氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì)，從而使肉腐敗變質(zhì)[27]。由圖4可知，對(duì)照組和不同濃度多酚處理的冷卻肉的TVB-N含量隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，且中高濃度處理組TVB-N值顯著低于空白組。貯藏至第9天時(shí)，對(duì)照組達(dá)到26.37 mg/100g，已超過(guò)國(guó)標(biāo)限定值。與之相比較的多酚處理的冷卻肉貯藏至第9天時(shí)均未超過(guò)25 mg/100g且相比對(duì)照組降低14.30%，但20和25 g/L差異不顯著。說(shuō)明甜瓜皮多酚能夠能延緩冷卻肉TVB-N值的升高，延長(zhǎng)其貨架期。

2.4.4 TBARS

TBARS表征反應(yīng)中氧化產(chǎn)物丙二醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，丙二醛是酯類物質(zhì)氧化的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，肉及肉制品中脂肪氧化酸敗水平可用丙二醛含量反映，丙二醛含量越高，TBARS越大，表明產(chǎn)生較多的小分子物質(zhì)如醛、酮、酸等，脂肪氧化酸敗的程度越高[28]。鮮肉TBARS為0.201～0.665 mg/kg，TBARS高于1.0 mg/kg為變質(zhì)肉[29]。如圖5所示，對(duì)照組和處理組TBARS均隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，但對(duì)照組上升幅度明顯高于中高濃度多酚處理組(P<0.05)。對(duì)照組在貯藏至第9天時(shí)達(dá)到了1.08 mg/kg，肉品發(fā)生腐敗變質(zhì)，而多酚處理組TBARS均低于1.0 mg/kg，說(shuō)明多酚處理能有效延緩脂肪氧化。

2.4.5 感官評(píng)價(jià)

感官是反映肉制品最直觀的指標(biāo)，肉的感官特性直接影響消費(fèi)者的購(gòu)買欲望[30]。圖6是牛肉在貯藏期間色澤、氣味、黏度和彈性綜合得分。隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，牛肉的綜合感官評(píng)分均呈下降的趨勢(shì)且對(duì)照組下降最快。且中高濃度多酚處理組與對(duì)照組之間差異顯著(P<0.05)，第9天時(shí)，對(duì)照組的感官已處于不可接受水平，而經(jīng)過(guò)中高濃度的多酚處理的樣品在第9天感官評(píng)分顯著高于對(duì)照組，這可能是因?yàn)槎喾恿己玫囊志院涂寡趸?，抑制微生物的生長(zhǎng)和延緩肉制品的氧化，從而延緩牛肉感官特性的劣變[20]。

3 結(jié)論

甜瓜皮多酚提取的最優(yōu)工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)61%，液料比21∶1(mL∶g)，超聲時(shí)間60 min，超聲溫度40 ℃。通過(guò)對(duì)牛肉各個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)，結(jié)果表明，甜瓜皮多酚對(duì)牛肉有較好的保鮮效果，可有效延緩貯藏過(guò)程中的腐敗變質(zhì)。當(dāng)甜瓜皮多酚質(zhì)量濃度為20 和25 g/L時(shí)，其保鮮效果無(wú)明顯差異。因此，甜瓜皮多酚的最佳質(zhì)量濃度為20 g/L，可作為天然抗氧化劑應(yīng)用于食品加工及肉制品的保鮮過(guò)程中。