李明瑕，劉春鳳，王壬，鄭飛云，王金晶，鈕成拓，李崎*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

果汁自然發(fā)酵生產(chǎn)果酒是一個復(fù)雜的過程，涉及果汁中多種微生物(細菌和酵母)間的相互作用，其中起著核心作用的是釀酒酵母菌株[1]。使用釀酒酵母對果汁進行純種發(fā)酵，可以更好地控制發(fā)酵過程，避免感官偏差，確保產(chǎn)品品質(zhì)的均一性[2-3]。不同釀酒酵母代謝特征和生理特性的差異使最終產(chǎn)品表現(xiàn)出不同的風味特征，進一步影響果酒的感官特性。近年來，釀酒行業(yè)更加關(guān)注能夠生產(chǎn)具有果酒特征香氣的酵母菌株，野生釀酒酵母的選擇和利用受到大量關(guān)注。理想的酵母菌株需要滿足某些指標，最重要的是能在高糖濃度下生長，乙醇、二氧化硫的耐受性，硫化氫、揮發(fā)酸的低產(chǎn)量等[4-5]。

桃屬于薔薇科，李屬，其發(fā)源于我國的西北高原，后廣泛分布于亞、非、歐、美、澳5個大洲。從營養(yǎng)角度來看，桃子是碳水化合物、有機酸、膳食纖維、維生素B、維生素C、葉酸、礦物質(zhì)和飲食抗氧化劑(酚類化合物和類胡蘿卜素)的良好來源[6-7]。桃品種按照果肉的顏色可以分為白肉桃、紅肉桃、黃肉桃和綠肉桃。其中黃肉桃由于糖含量低，有機酸含量高，更適合進一步的工業(yè)加工[8]。黃桃果酒是黃桃較理想的食用途徑和深加工模式，它可以最大限度的保留黃桃中原有的營養(yǎng)成分，減少收獲后多余水果的損失，還可以滿足果酒市場多樣化的需求。

目前，有大量的文獻數(shù)據(jù)涉及葡萄酒的研究，但少見黃桃果酒酵母篩選及發(fā)酵特性的研究[8]。篩選適用于黃桃果汁發(fā)酵的釀酒酵母，是提高黃桃果酒香氣質(zhì)量的根本所在。為此，本研究以分離自黃桃果汁自然發(fā)酵液和實驗室貯存的共403株潛在的釀酒酵母菌株為研究對象，根據(jù)其在高糖條件下起始發(fā)酵的能力、乙酸和硫化氫生產(chǎn)能力、脅迫條件下的生長能力進行了篩選研究。在此基礎(chǔ)上，選擇了10株優(yōu)選釀酒酵母菌株進一步發(fā)酵黃桃汁進行香氣分析和感官評估，最終獲得了4株具有不同理化特性和揮發(fā)特性的釀酒酵母菌株，對黃桃果酒質(zhì)量的提高具有重要的參考價值和實際應(yīng)用意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 培養(yǎng)基

碳酸鈣瓊脂培養(yǎng)基：0.3%酵母粉、18%葡萄糖、0.3%碳酸鈣、1.5%瓊脂(均為質(zhì)量分數(shù))；商業(yè)Biggy agar培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；黃桃濃縮汁：可溶性固形物44.5%、總酸(18.05±0.11)g/L，福建綠泉公司。

1.1.2 試劑

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；白砂糖，市售。

1.2 儀器與設(shè)備

BSP-250生化培養(yǎng)箱，上海博訊公司；恒溫搖床，太倉市強樂實驗設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海實驗儀器有限公司；超凈工作臺，蘇凈集團蘇州安康空氣技術(shù)有限公司；Waters 1525高效液相色譜儀，美國Waters公司；氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母菌株的分離

購買來自湖北、山東武臺、山東蒙陰、安徽碭山4個不同產(chǎn)地的新鮮黃桃，分別取3～5個黃桃榨汁，調(diào)整糖度至20 °Brix，倒入無菌三角瓶中，28 ℃培養(yǎng)箱中自然發(fā)酵，發(fā)酵后期取樣，用0.85%生理鹽水連續(xù)稀釋后取不同濃度的稀釋液涂布于YPD平板中，28 ℃ 培養(yǎng)2 d。每組3個平行。從合適稀釋度的平板中挑取釀酒酵母形態(tài)的菌落，并在YPD瓊脂平板上純化2次，純化的分離物劃線到Y(jié)PD瓊脂斜面上于4 ℃保存，分別編碼為HB-1～HB-25，WT-1～WT-25，MY-1～MY-25，DS-1～DS-24。

304株分離自其他水果，保存在實驗室的潛在釀酒酵母菌株，編碼為A-1～A-304。

釀酒酵母D254作為對照菌株。

1.3.2 酵母菌株性能篩選

1.3.2.1 起始發(fā)酵能力[9]

將保存的菌株在10 mL YPD液體試管中28 ℃活化18～24 h后，接種于含糖量200 g/L的含杜氏小管的黃桃汁中，20 ℃靜置培養(yǎng)。通過杜氏小管內(nèi)截留的氣泡，觀察發(fā)酵。48 h內(nèi)氣泡充滿杜氏小管的菌株評為起酵能力好，其余菌株評為起酵能力較差。

1.3.2.2 乙酸生產(chǎn)能力

在果酒的發(fā)酵過程中，由于溶質(zhì)濃度高，酵母承受較大的高滲脅迫，這種壓力與最終產(chǎn)品中乙酸的產(chǎn)量有關(guān)[9]。根據(jù)VALLES等[10]描述的方法，將菌株活化后，分別取5 μL點樣在碳酸鈣瓊脂培養(yǎng)基上來測試該特征。酵母產(chǎn)生乙酸的能力是通過菌落周圍透明圈的大小進行評價，28 ℃培養(yǎng)3 d后，暈圈<3 mm 的菌株為低產(chǎn)乙酸菌株，暈圈>3 mm的菌株為中產(chǎn)或高產(chǎn)乙酸菌株。

1.3.2.3 硫化氫生產(chǎn)能力

酵母產(chǎn)生的硫化氫與發(fā)酵產(chǎn)品中的異味有關(guān)，對果酒產(chǎn)生負面影響，發(fā)酵過程中硫化氫的形成具有菌株依賴性。將菌株活化后，分別取5 μL點樣在Biggy agar培養(yǎng)基上來測試該特征[11-12]。酵母產(chǎn)生硫化氫的能力是通過菌落的顏色進行評價,28 ℃培養(yǎng)2 d后，顏色為白色及淺褐色的菌株評為不產(chǎn)及低產(chǎn)硫化氫菌株，顏色為深棕色及黑色的菌株評為中產(chǎn)及高產(chǎn)硫化氫菌株。

1.3.2.4 乙醇和二氧化硫耐受性

1.3.3 菌株18S rDNA鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析

將斜面保藏的菌株活化后，取適量的培養(yǎng)液，采用酵母DNA提取試劑盒提取菌體DNA，用酵母ITS通用引物(引物序列見表1)擴增基因組DNA，測序PCR產(chǎn)物。采用BLAST方式將測定的18S rDNA序列與GenBank中酵母菌的序列進行比對。系統(tǒng)發(fā)育和分子進化分析通過分子進化遺傳分析軟件進行。使用領(lǐng)接(Neihbour-joining，NJ)法計算距離和聚類分析。使用步長檢驗評估NJ樹的拓撲結(jié)構(gòu)。

表1 酵母ITS通用引物序列Table 1 Sequence of ITS primers

1.3.4 黃桃果酒的發(fā)酵

調(diào)整濃縮黃桃汁成分至含糖量180 g/L，可滴定酸5.68 g/L，105 ℃滅菌10 min。將菌株活化后以106個/mL接種于黃桃果汁中，25 ℃發(fā)酵。每24 h測定質(zhì)量損失以監(jiān)測發(fā)酵，當每100 mL發(fā)酵液24 h內(nèi)失重<0.1 g視為發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵結(jié)束后離心分離黃桃酒。設(shè)置3個生物學平行。

1.3.5 感官分析

感官品評小組由11名老師和同學組成，所有感官品評成員均經(jīng)過專業(yè)培訓。在(22±1)℃的室溫下，將黃桃酒樣品通過品評杯呈遞給小組成員。小組成員討論選擇了10個評價指標，包括果香(香氣)、甜香(香氣)、花香(香氣)、愉悅程度(香氣)、酸(口感)、甜(口感)、異味(口感)、平衡(口感)、豐滿度(口感)、嗜好程度，以描述和區(qū)分樣品，并使用0～10分對每個屬性的強度進行評分。

1.3.6 黃桃果酒的化學分析

殘?zhí)?、可滴定酸、揮發(fā)酸總二氧化硫根據(jù)GB/T 15038—2006[13]中描述的方法測定，酒精度根據(jù)GB 5009.225—2016[14]中描述的方法測定。

在黨委的帶動下，團場300名黨員干部采取一對一的方式，按照就近就地、集中聯(lián)戶的原則，下基層、真進門、真結(jié)親、結(jié)真親，與263戶各族職工群眾結(jié)對認親，結(jié)對民漢比例達到了45∶55。首次結(jié)親見面后，第九作業(yè)站的30戶回族群眾家里都會有一張?zhí)厥獾摹叭腋！?。不少人“全家福”里的親人都不是第一次見面，他們有的是一起長大的好朋友，有的是多年相處的老鄰居，有的是扶貧幫困的掛鉤干部，他們早已融為一體，勝似親人。結(jié)親見面對于他們來說就是家人的再次團聚。

葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油和山梨醇的含量通過Waters 1525 HPLC折射率檢測器，使用Sugarpak 1 (6.5 mm×300 mm)陽離子交換柱進行分析，流動相為超純水，流速0.3 mL/min，柱溫85 ℃，進樣體積 10 μL。有機酸含量通過Waters 1525 HPLC紫外檢測器，使用色譜柱Waters X select HSS T3(4.6 mm×250 mm)在206 nm下進行分析，流動相是0.02 mol/L(pH 2.5)磷酸二氫鉀緩沖液，流速0.5 mL/min，柱溫40 ℃。根據(jù)峰的保留時間和它們的峰面積與相應(yīng)的標準品比較，使用校準曲線進行定量測定。

通過固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(headspace-solid phase micro extraction-GC-MS，HS-SPME-GC-MS)測定黃桃果酒中揮發(fā)性化合物，GC-MS條件參照李凱等[15]的方法。未知化合物的定性通過與NIST 05質(zhì)譜庫中標準譜圖比對確定，化合物的定量通過在體積分數(shù)10%的乙醇溶液中配制待測化合物標準溶液并繪制標準曲線，依據(jù)標準曲線確定果酒中揮發(fā)性化合物的濃度。氣味活性值(odor activity value,OAV)計算為在果酒中測得的某種物質(zhì)濃度與其在葡萄酒中氣味閾值之間的比率[2]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有實驗數(shù)據(jù)均以3個獨立實驗的平均值和標準差表示。使用Origin 2020b和IBM SPSS Statistics 25.0軟件進行繪圖和顯著性分析，SIMCA-P 14.1軟件用于偏最小二乘回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌株的初篩

在該試驗中，從黃桃果汁自然發(fā)酵液中分離了99個菌株，以及實驗室保藏的304株潛在的釀酒酵母菌株，共有403個菌株用于進一步表征。第一個篩選標準是起始發(fā)酵的能力，20 ℃靜置48 h后有158個菌株沒有產(chǎn)生氣泡或產(chǎn)生的氣泡沒有充滿杜氏小管，這意味著它們可能發(fā)酵緩慢甚至不發(fā)酵糖，起酵能力的篩選排除了這158個菌株。對于乙酸的生產(chǎn)，釀酒酵母菌株在碳酸鈣瓊脂培養(yǎng)基上顯示出很大差異，在該實驗中有213個菌株產(chǎn)生的透明圈在3 mm以下，為低產(chǎn)乙酸菌株。通過在Biggy agar培養(yǎng)基上菌株的色素沉著評估酵母產(chǎn)生硫化氫的能力，其中202個菌株形成了白色或淺棕色菌落，歸類為低產(chǎn)硫化氫菌株。在403個菌株中有39個菌株起酵速度慢、硫化氫、乙酸產(chǎn)量高。通過以上3個篩選標準排除了317個不適合黃桃果酒發(fā)酵的菌株，其他86個菌株表現(xiàn)出較好的發(fā)酵性能，對這些菌株進行下一步的技術(shù)表征。菌株的分類如圖1所示。

優(yōu)良的釀酒酵母菌株需要能夠耐受一定濃度的二氧化硫和乙醇，試驗考察了150、200 mg/L二氧化硫?qū)晟L的影響，幾乎所有菌株都能耐受150～200 mg/L二氧化硫的壓力，與空白對照相比，多數(shù)菌株沒有延遲或在0～4 h的延遲期后達到穩(wěn)定期，穩(wěn)定期存活率略有下降。相比之下，乙醇的添加對酵母生長產(chǎn)生較大的影響，不同的乙醇添加量對酵母的抑制程度顯示出較大的差異，大部分菌株能夠耐受體積分數(shù)為8%的乙醇，有43株菌在32 h內(nèi)表現(xiàn)出明顯增長并達到穩(wěn)定期，然而在體積分數(shù)為12%的乙醇條件下，只有10株菌在32 h內(nèi)表現(xiàn)出明顯的增長。乙醇和二氧化硫?qū)晟L的影響如表2所示。

表2 乙醇和二氧化硫?qū)晟L的影響Table 2 Effects of ethanol and sulfur dioxide on the growth of strains

2.2 菌株鑒定

初步篩選獲得了10個優(yōu)選菌株，測定以上10個菌株的18S rDNA序列，并通過NJ法生成了系統(tǒng)發(fā)育樹。所有篩選菌株與釀酒酵母模式菌株CBS405T，S288CT在100%的步長檢驗置信度水平上形成了一個簇，表明所有篩選菌株均為釀酒酵母，結(jié)果如圖2所示。

2.3 黃桃果酒的發(fā)酵

基于在上述實驗中評估的野生酵母的發(fā)酵性能，選擇了10株發(fā)酵性能優(yōu)良的釀酒酵母進行黃桃果酒的發(fā)酵實驗，同時以商業(yè)釀酒酵母D254作為對照組。發(fā)酵完成后，對黃桃果酒的基礎(chǔ)理化指標、非揮發(fā)性化合物、感官得分和揮發(fā)性化合物進行了比較和分析。

2.3.1 基礎(chǔ)理化指標分析

黃桃果酒的基礎(chǔ)理化指標如表3所示,釀酒酵母WT-7，WT-14，WT-21與商業(yè)釀酒酵母D254有相當?shù)陌l(fā)酵速度，均在14 d內(nèi)完成發(fā)酵，而其余菌株在第16天完成發(fā)酵，WT系列菌株篩選自黃桃鮮果自然發(fā)酵，表明原生環(huán)境中的釀酒酵母菌株可能更適合黃桃的發(fā)酵。其中有7個菌株的乙醇產(chǎn)量與對照菌株D254沒有顯著差異，均可以達到體積分數(shù)10.50%以上，僅有A-33菌株發(fā)酵乙醇含量最低，體積分數(shù)為9.56%，發(fā)酵相對緩慢。黃桃果酒中的總糖也表現(xiàn)出明顯差異，菌株A-5，A-34，WT-7，WT-14，WT-21發(fā)酵后總糖相對較少，低于7.24 g/L，相對應(yīng)的菌株A-33發(fā)酵的果酒中總糖含量最高，高達16.15 g/L。該實驗中所有發(fā)酵后黃桃果酒可滴定酸均高于6.50 g/L，總體酸度較高。所有菌株發(fā)酵后的揮發(fā)酸度值均低于敏感閾值(0.8 g/L)[11]。

表3 黃桃果酒理化指標Table 3 Physiochemical indexes of yellow peach wine

2.3.2 非揮發(fā)性組分分析

黃桃果酒中非揮發(fā)性組分主要由糖和有機酸組成。研究進一步考察了黃桃果酒樣品中的糖和有機酸組成，結(jié)果分別如表4和表5所示。對于所有菌株發(fā)酵的黃桃果酒，葡萄糖轉(zhuǎn)化率接近100%，蔗糖轉(zhuǎn)化率>95.60%，而果糖轉(zhuǎn)化率在81.40%～96.0%，存在顯著差異。其中菌株A-5、A-34、WT-7、WT-14和WT-21發(fā)酵后果糖含量低于4.00 g/L，用于黃桃果汁發(fā)酵存在顯著的優(yōu)勢。黃桃果酒中甘油的質(zhì)量濃度在3.64～5.22 g/L，菌株A-61發(fā)酵黃桃酒甘油含量最高，菌株WT-7和商品菌D254發(fā)酵黃桃酒甘油含量最低，甘油的存在會增加果酒的復(fù)雜性，賦予果酒甜味，使果酒更加柔和[16]。

表4 黃桃果酒中糖及糖醇含量 單位：g/L

由表5可以看出，黃桃果汁中的有機酸主要是檸檬酸和奎寧酸[17]，占總有機酸總量的74.50%。黃桃果酒中有機酸種類更加豐富，主要有檸檬酸、奎寧酸、琥珀酸、乳酸和蘋果酸，占總有機酸含量的86.90%～90.80%。酵母通過酒精發(fā)酵產(chǎn)生檸檬酸，果酒中檸檬酸含量較黃桃果汁中增加了8.55%～18.22%，是黃桃酒中含量最高的有機酸。檸檬酸具有令人愉悅的柑橘味[18]，口感圓潤清爽，A-33菌株發(fā)酵后果酒檸檬酸含量最高，為3.18 g/L，A-81最低有2.92 g/L?？鼘幩峥勺鳛樘荚幢痪昀肹19]，WT-7、WT-14和WT-21發(fā)酵黃桃果酒中奎寧酸表現(xiàn)出明顯的下降，推測黃桃來源釀酒酵母對果汁有更好的適應(yīng)性。果酒中琥珀酸含量在1.03～1.55 g/L，琥珀酸帶有酸味和特殊的咸苦味，在果酒成熟的過程中有助于酯類物質(zhì)的形成[20]。乳酸在發(fā)酵過程中形成，是一種比較溫和的有機酸，使果酒的口感更加柔和[21]，菌株WT-14發(fā)酵后乳酸含量最高為1.70 g/L，A-61產(chǎn)生了最少的乳酸為1.03 g/L。蘋果酸是酸性較強的有機酸，略帶刺激性，黃桃果酒中蘋果酸含量在0.76～1.03 g/L，占總有機酸的比例較少，不會對黃桃果酒造成負面影響。

表5 黃桃果酒的有機酸組分 單位：g/L

2.3.3 感官分析

根據(jù)描述定量分析的關(guān)鍵詞對黃桃果酒進行感官品評，圖3顯示了4個感官品評結(jié)果較好的黃桃酒，同時以商品菌D254發(fā)酵的黃桃酒為對照。果香是果酒的基本特征，通常被認為是果酒品質(zhì)的重要指標，菌株WT-21在果香(香氣)、豐滿度(口感)有最高得分。A-2發(fā)酵的黃桃酒在花香(香氣)、愉悅程度(香氣)、甜(口感)、平衡(口感)、嗜好程度上均有較高得分。A-61在平衡(口感)上有較高的得分。A-34在果香(香氣)、愉悅程度(香氣)上與A-2有相當?shù)牡梅?，在豐滿度(口感)上有較高得分。

2.3.4 揮發(fā)性化合物含量分析

2.3.4.1 揮發(fā)性化合物半定量分析

主要的揮發(fā)性化合物可能在發(fā)酵飲料的質(zhì)量中起重要作用，通過GC-MS對黃桃果酒中的揮發(fā)性化合物進行檢測，在5種黃桃酒中共檢出86種揮發(fā)性化合物，其中醇類物質(zhì)20種，酯類化合物28種，脂肪酸類化合物8種，萜烯/內(nèi)酯類化合物9種，醛/酮/酚類化合物7種，烷烴/烯烴類化合物14種。不同菌株發(fā)酵的黃桃酒中揮發(fā)性化合物種類存在一定的差異，WT-21菌株發(fā)酵黃桃酒中檢出的揮發(fā)性化合物種類最少，有67種，A-61檢出的化合物種類最多有76種，A-2、A-34和D254分別檢出75、72和73種揮發(fā)性化合物(數(shù)據(jù)未顯示)。

所有揮發(fā)性化合物的聚類熱圖能夠更直觀的顯示不同菌株發(fā)酵黃桃酒中揮發(fā)性物質(zhì)含量的差異，如圖4所示，WT-21菌株發(fā)酵黃桃酒中多種化合物含量高于其他菌株，如酯類化合物(乙酸乙酯、乙酸異丁酯、乳酸乙酯、乙酸己酯、2-糠酸乙酯)、醇類化合物(異戊醇、異丁醇、9-十烯-1-醇、正丙醇、1-癸醇)、萜烯/內(nèi)酯類(丙位癸內(nèi)酯、4-萜品醇、α-松油醇、β-癸內(nèi)酯)等。D254菌株發(fā)酵黃桃酒有較多的乙酸丁酯、丁酸乙酯、4-乙酰氧基丁酸乙酯、正丁醇、癸酸甲酯等。

A-61發(fā)酵黃桃酒中有較多的2-壬醇、香茅醇、丁香酚等。菌株A-34發(fā)酵黃桃酒中芳樟醇、異戊酸乙酯、苯甲酸乙酯、大馬士酮等較高。菌株A-2發(fā)酵黃桃酒中辛酸乙酯、辛酸苯甲酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸異戊酯、癸酸異戊酯等較高。

2.3.4.2 揮發(fā)性化合物定量及主成分分析(principal component analysis, PCA)

揮發(fā)性化合物的半定量分析僅能說明不同菌株發(fā)酵黃桃果酒中揮發(fā)性化合物含量上的差異，但是揮發(fā)性化合物對果酒的影響更多的取決于其在果酒中的實際含量和閾值，在該研究中對黃桃果酒中35種揮發(fā)性化合物進行了定量測定，結(jié)果如表6所示。

表6 主要揮發(fā)性化合物的定量分析Table 6 Quantitative analysis of main volatile compounds

高級醇在數(shù)量上是果酒中最大的芳香族化合物，高級醇質(zhì)量濃度低于300 mg/L可以對果酒產(chǎn)生積極的影響[22]。黃桃果酒中高級醇含量在111.4～192.9 mg/L，異戊醇、異丁醇、2-苯基乙醇和正丙醇是黃桃果酒中含量最多的高級醇。釀酒酵母WT-21發(fā)酵黃桃果酒高級醇含量最高，相比于對照菌株D254提高了73.10%。

酯類化合物主要包括乙酸酯類和脂肪酸乙酯類。乙酸酯通過高級醇的酯化反應(yīng)產(chǎn)生[2]。乙酸乙酯是黃桃果酒中含量最高的乙酸酯，低濃度下會增加果酒的香氣復(fù)雜性，質(zhì)量濃度高于150 mg/L的情況下會給葡萄酒帶來難聞的氣味(醋味)[12]，黃桃果酒中乙酸乙酯含量在18.96～22.17 mg/L，WT-21是乙酸乙酯最高生產(chǎn)者，D254則是較小生產(chǎn)者。其次是乙酸異戊酯，菌株WT-21和D254發(fā)酵黃桃酒中乙酸異戊酯產(chǎn)量相對較高有0.56 mg/L，釀酒酵母A-2發(fā)酵的黃桃果酒中乙酸異戊酯產(chǎn)量最低為0.33 mg/L。乳酸乙酯是黃桃果酒中含量最高的脂肪酸乙酯，平均含量為5.23～6.61 mg/L，乳酸乙酯能夠提高發(fā)酵飲料的果香和花香[23]。至于丁酸乙酯、己酸乙酯和異戊酸乙酯在黃桃果酒中含量較低，但其OAV>1，可能對黃桃果酒的風味帶來積極的影響。

脂肪酸主要在發(fā)酵過程中形成，低水平下(<20 mg/L)這組揮發(fā)物對果酒的風味產(chǎn)生積極的影響，但在高濃度下會產(chǎn)生汗水，酸味和稀薄的味道[21]。黃桃果酒中的脂肪酸主要有正癸酸、辛酸和己酸，OAV>1，總脂肪酸含量<14 mg/L。己酸、辛酸在果酒中有很高的香氣強度，并賦予果酒甜美，水果和奶酪的香氣[2]。癸酸帶有脂肪味，可能對果酒的香氣帶來負面影響[24]。果酒中的脂肪酸除了本身帶有的香氣之外，在阻止其酯類物質(zhì)水解方面也具有重要作用。

在所有黃桃酒中都檢出了其他微量揮發(fā)性化合物，例如芳樟醇(柑桔香氣)、β-香茅醇、γ-癸內(nèi)酯和δ-癸內(nèi)酯。萜烯化合物與花香和檸檬香氣有關(guān)[25]，芳樟醇為酒精飲料增添了花香和果香的香氣。內(nèi)酯被認為是桃香氣的主要貢獻者，特別是γ-和δ-癸內(nèi)酯被認為是特征影響化合物[26]。

揮發(fā)性化合物對果酒風味的貢獻取決于OAV，OAV>1的揮發(fā)物通常被認為是能夠促進葡萄酒香氣的化合物[11]。通過PCA以確定不同釀酒酵母生產(chǎn)的黃桃果酒的風味差異，將OAV>1的13種揮發(fā)性化合物用作變量。如圖5所示，前2個主成分方差的累積貢獻率為69.1%，其中PC1和PC2分別解釋了40.8%和28.3%的方差。所有方差都是由揮發(fā)性化合物產(chǎn)生的，這些化合物能夠?qū)?種黃桃酒區(qū)分開來。圖5中每個酵母發(fā)酵黃桃酒的3個獨立重復(fù)結(jié)果相對接近，表明樣品之間的可重復(fù)性。與第一主成分呈正相關(guān)的化合物有乙酸乙酯、異戊醇、異丁醇、丙位癸內(nèi)酯，WT-21發(fā)酵黃桃酒主成分得分負載在PC1正向，說明與其他菌株發(fā)酵黃桃酒相比，WT-21發(fā)酵黃桃酒與乙酸乙酯、異戊醇、異丁醇、丙位癸內(nèi)酯有很強的相關(guān)性。與第二主成分呈正相關(guān)的化合物有異戊酸乙酯、苯乙醇、己酸乙酯。A-34和A-2發(fā)酵黃桃酒負載在PC2的正向，與苯乙醇、異戊酸乙酯、己酸乙酯相關(guān)性較高，其主成分得分有部分重疊，表明主要揮發(fā)性化合物含量有相似的特征。菌株A-61和D254發(fā)酵黃桃酒與丁酸乙酯、己酸、乙酸異戊酯相關(guān)性較高。

2.3.5 偏最小二乘回歸分析

為了揭示黃桃果酒中感官屬性與揮發(fā)性化合物之間的關(guān)系，使用SIMCA 14.1軟件進行了偏最小二乘回歸(partial least squares，PLS)分析。由所有揮發(fā)物(X變量)和4個感官描述詞(Y變量)生成的初始相關(guān)模型中61.3%的X變量解釋了83.0%的感官屬性變異。根據(jù)LI等[27]的研究，投影的變量重要性值(variable importance for the projection，VIP)<1的變量與解釋Y變量的關(guān)系最小，因此從矩陣中刪除了23個無關(guān)緊要的變量。生成了包含63種揮發(fā)性化合物和4個感官描述符的新集合，其中75.2%的X變量解釋了80.7%的Y變量，如圖6所示。

由圖6可以看出，“果香”位于第一象限，最大系數(shù)對應(yīng)于18、1、54、83、58、12、34、61、47、26。“甜香”位于第三象限，最大系數(shù)對應(yīng)于13、55、25、56、45、69、53、2。“花香”位于第二象限，與60、4、7、27、46、31、30、20相關(guān)性較高?！坝鋹偝潭取必撦d位于正Y軸附近，與1、42、60、21、18、4、46、20、30、27、31相關(guān)性較高。PLS結(jié)果可以很好的解釋從感官品評獲得的黃桃酒之間的感官差異。WT-21在“果香”上有最高得分可能與乙酸乙酯(果味)、乙酸苯乙酯(玫瑰花香、果香)、乳酸乙酯(水果、奶油香氣)、異戊醇(蘋果白蘭地香氣)的較高含量有關(guān)。A-2和A-34在“花香”和“愉悅程度”的得分較高可能與月桂酸乙酯(花香、甜香、果香)、苯乙醇(玫瑰花香)、癸酸乙酯(椰子香)、1-壬醇(玫瑰、橙香)、辛酸異戊酯(水果香)、乙酸苯乙酯(玫瑰花香、果香)、辛酸苯乙酯(果香)的較高強度有關(guān)。D254在“甜香”上的較高得分可能與丁酸乙酯(草莓、蘋果)、苯甲酸乙酯(水果香)有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究基于菌株生長實驗、耐受性實驗、感官品評及風味組分分析，篩選獲得了4株生長和發(fā)酵性能優(yōu)良的釀酒酵母菌株。其中，釀酒酵母菌株WT-21在14 d內(nèi)完成發(fā)酵，對黃桃果汁中的果糖、奎寧酸有很好的利用能力，發(fā)酵產(chǎn)生的黃桃果酒中多種酯類化合物、醇類化合物、萜烯內(nèi)酯類化合物含量高于其他菌株，總醇和總酯的含量相比于商業(yè)菌株D254提高了73.1%和17.4%，在感官品評中有最高的“果香”和“豐滿度”得分，這些特征使得它可以生產(chǎn)出具有強烈香氣的黃桃果酒。菌株A-61發(fā)酵黃桃酒中甘油含量最高，為5.22 g/L，揮發(fā)性化合物種類最多有76種，在感官品評中有最高的“平衡”(口感)得分，可用于提高黃桃果酒的香氣復(fù)雜性。菌株A-2和A-34發(fā)酵的黃桃果酒在“花香”和“愉悅程度”上有最高得分，多種產(chǎn)生花香的揮發(fā)性化合物含量高于其他菌株，可用于生產(chǎn)更具花香的黃桃酒。本研究提供了一種系統(tǒng)選育黃桃果酒酵母的方法，基于該方法篩選得到的4株釀酒酵母菌株具有各自典型的釀造品質(zhì)，對特征性黃桃果酒產(chǎn)品開發(fā)具有重要的參考價值和較強的工業(yè)應(yīng)用前景。