夏金，陳義倫

(山東農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，山東 泰安，271018)

酒精引起的肝損傷會引起脂肪肝、肝炎、肝纖維化和肝硬化[1]等酒精性肝病，嚴重威脅人類健康。酒精進入機體后產(chǎn)生的氧自由基和代謝產(chǎn)物是損傷肝臟的主要物質(zhì)，過量酒精進入機體后，在鐵離子的參與下會與細胞色素P450結(jié)合產(chǎn)生大量的氧自由基，這些自由基會影響肝臟正常的氧化還原狀態(tài)，引起脂質(zhì)過氧化，細胞膜通透性被破壞，進而損傷肝臟細胞的完整性和功能[2]；其代謝產(chǎn)物乙醛會與肝臟中參與代謝、轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)結(jié)合，破壞蛋白質(zhì)的生理功能，繼而引起DNA修復異常，破壞線粒體結(jié)構(gòu)和功能，導致細胞損傷[3-4]；此外，線粒體中的谷胱甘肽與氧自由基反應被大量消耗，降低線粒體氧化損傷的修復能力，進一步增加肝細胞的損傷程度[5]。

針對上述的損傷途徑，糖皮質(zhì)激素、S-腺苷蛋氨酸、多烯磷脂酰膽堿、還原型谷胱甘肽等一系列治療藥物被相繼研發(fā)并成功地應用。但這些藥物會引起過敏、代謝紊亂等副作用，對人體健康產(chǎn)生危害[6]。藥食兩用植物包含的多酚、多糖、黃酮等生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、抑菌[7]、抗炎等功效，能夠清除自由基、緩解機體應激反應，保護肝臟細胞[8]。

蒲公英是我國常見的藥食兩用植物，富含多糖、黃酮、酚酸等多種生物活性物質(zhì)，中醫(yī)和現(xiàn)代醫(yī)學研究表明其具有保肝瀝膽，利尿，抗炎，抗菌和輔助保護化學性肝損傷作用[9-10]。蒲公英乙醇提取物可提高藥物損傷小鼠肝臟中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)的含量，并使谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic pyruvic transaminase，ALT)的含量減少，有效的保護肝臟[11]；水提物可降低四氯化碳對肝臟的損傷[12]?，F(xiàn)有研究多采用不同溶劑提取蒲公英中的活性組分，研究其保肝作用，不同溶劑提取物中活性成分的種類、含量各不相同，無法對其中各類活性組分的作用進行系統(tǒng)性的比較和分析。基于現(xiàn)有研究現(xiàn)狀，本試驗采用水、乙醇作為溶劑提取蒲公英中活性組分，系統(tǒng)比較、分析不同提取物對酒精性肝損傷小鼠和HHL-5肝細胞保護作用和差異。在此基礎上，以抗氧化能力為切入點，探究其與保肝作用的內(nèi)在聯(lián)系，為系統(tǒng)分析蒲公英作用成分與機制提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蒲公英全草，山東省新泰市野菜野生水果養(yǎng)殖基地；SPF級昆明種雄性小鼠，4周齡，體重25～30 g，泰山醫(yī)學院，許可證號SCXK(魯)20170023；HHL-5細胞系，山東諾丁生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器

無水乙醇、苯酚，均為分析純；胎牛血清Gibco，美國Thermo Fisher Scientific公司；RPMI-164 0培養(yǎng)基，Biological Industries公司；ALT、AST、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、SOD、GSH、甘油三酯(triglyceride，TG)試劑盒，南京建成生物工程研究所；聯(lián)苯雙酯，北京協(xié)和藥廠；Infinite2000多功能酶標儀，法國Tecan公司；5415R臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；熒光倒置顯微鏡，日本Olympus公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蒲公英提取物的制備

去離子水清洗蒲公英全草，在70 ℃下干燥至恒重，打碎成粉，過40目篩，置于干燥器中備用。取50 g蒲公英全草粉，分別加入500 mL的水和乙醇制成提取液。提取液超聲2 h后抽濾、離心取上清液。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(35 ℃)濃縮至膏狀，冷凍干燥得所需樣品，置于-80 ℃條件下避光保存。

1.3.2 小鼠肝損傷模型的建立與試驗設計

小鼠都被安置在(25±3) ℃、相對濕度50%～60%的環(huán)境，每天喂食和飲水。小鼠環(huán)境適應7 d后，將其隨機分為9組，分別為對照組，損傷組，聯(lián)苯雙酯組，水提物的高、中、低劑量組和醇提物的高、中、低劑量組，每組8只。所有處理組小鼠均進行損傷和給藥處理(2次處理間隔12 h)，具體處理方式如表1所示，連續(xù)灌胃21 d。于最后1次灌胃后，禁食16 h進行器官處理和相關(guān)指標的測定[13]：摘除眼球取血、離心(3 500 r/min，10 min，4 ℃)獲得血清；摘取肝臟后生理鹽水沖洗，按照肝組織與生理鹽水1∶9(g∶mL)制備勻漿，離心(4 000 r/min，10 min，4 ℃)后收集上清液進行后續(xù)分析；取肝組織左葉浸泡于10%(體積分數(shù))甲醛中，脫水制成石蠟切片，用蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡觀察。

表1 各組小鼠實驗處理Table 1 Treatment of mice in each group

1.3.3 HHL-5肝細胞損傷模型建立與試驗設計

消化對數(shù)生長期的HHL-5肝細胞并計數(shù)，以1×105個/mL濃度接種于24孔板中，每個孔中加入0.5 mL細胞培養(yǎng)基，置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。除對照組外，其他處理組采用3%乙醇處理15 min[14]進行損傷；對照組和損傷組使用細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，其余各組使用添加提取物的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)(高劑量組提取物終質(zhì)量濃度為0.5 g/L；中劑量組提取物終質(zhì)量濃度為0.25 g/L；低劑量組提取物終質(zhì)量濃度為0.125 g/L)，培養(yǎng)24 h后，收集細胞培養(yǎng)液離心得上清液用于測定AST、ALT。用4 ℃的PBS沖洗24孔板后加入0.5 mL 1%(體積分數(shù)) Triton-X 100細胞裂解液，充分吹打混勻，收集細胞裂解液，離心(4 000 r/min，10 min，4 ℃)取上清液測定SOD、MDA、GSH含量。

1.3.4 生化指標檢測

參考邢佳等[15]的方法，分別測定9組小鼠血清和細胞上清液中AST、ALT、TG，肝臟組織和細胞中MDA、SOD、GSH等指標。

1.3.5 體外抗氧化試驗

分別配制質(zhì)量濃度為0.125、0.25、0.5、1、2、3、4、5 g/L的蒲公英全粉的水提取液和乙醇提取液，測定上述提取液的DPPH自由基清除能力[16]，羥自由基清除能力[17]和ABTS陽離子自由基清除能力[18]。

1.4 試驗結(jié)果統(tǒng)計分析

采用Origin 7.5軟件分析細胞內(nèi)抗氧化指標和體外自由基清除能力的相關(guān)關(guān)系；采用單因素方差分析法分析處理組間顯著性差異，采用一般線性模型分析不同提取方式(水、醇提取)的差異，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒲公英提取物對酒精性肝損傷小鼠血清中ALT、AST、TG含量和肝比重的影響

不同蒲公英提取物對小鼠血清中AST、ALT、TG含量和肝比重的影響如圖1所示。與對照組相比，損傷組小鼠血清中的AST、ALT、TG含量和肝比重均顯著增高(P<0.05)，說明酒精性肝損傷模型建模成功。水提物和醇提物的中、高劑量處理組與聯(lián)苯雙酯組處理的ALT含量無顯著性差異(圖1-a)；水提物和醇提物的高劑量組與聯(lián)苯雙酯處理組的AST含量無顯著性差異，表明2種提取物高劑量組可以有效保護線粒體(圖1-b)。上述結(jié)果表明蒲公英水、醇提物的高劑量組均能有效地保護細胞膜完整性(P<0.05)。低劑量和中劑量的水提物能夠有效維持細胞膜完整性，對線粒體的保護作用不顯著。從圖1-c可以看出，蒲公英水、醇提取物高劑量處理均能有效降低小鼠血液中TG含量；從肝比重的角度來看(圖1-d)，水提取物的全部劑量組和醇提物的高劑量組能有效降低肝比重(P<0.05)。此外，蒲公英的水、醇提物對血液中的AST、ALT和TG含量的影響有顯著性差異(P<0.05)。AST、ALT存在于肝細胞線粒體[19]和細胞質(zhì)[15]中，過量的酒精進入機體后，會引起細胞質(zhì)中自由基增加和氧化應激反應，引起線粒體和細胞膜損傷，通透性增加，血清中含量升高。高濃度的蒲公英提取物能顯著降低血清中AST、ALT含量，低濃度的提取物作用效果不明顯，說明高濃度的蒲公英提取物可能會與細胞質(zhì)中自由基反應，或是參與細胞通路的調(diào)節(jié)；而低濃度的提取物清除自由基能力較低，或調(diào)節(jié)能力相對不足，無法起到有效保護作用。當使用中濃度的提取物處理肝臟時，提取物中功能組分均可與細胞質(zhì)中氧自由基，氧化應激反應通路Nrf-2[20]，抗凋亡通路Bcl-2/Bax[21]，以及炎癥通路TLR4/NF-κB[22]發(fā)生作用，減少炎癥因子釋放、調(diào)節(jié)信號通路；而線粒體膜與細胞膜所處的微環(huán)境不同，受損傷程度，細胞因子、反應通路作用，和提取物調(diào)節(jié)程度也不同，宏觀上表現(xiàn)出中等濃度提取物能夠保持細胞膜完整性，但對線粒體膜保護作用不明顯。綜合上述結(jié)果，細胞蒲公英水、醇提取物的高劑量組能有效保護小鼠肝細胞，蒲公英水提物在維持生物膜完整性、降低血液中甘油三脂含量等方面均優(yōu)于醇提物。

2.2 蒲公英提取物對酒精性肝損傷小鼠肝臟中SOD、GSH、MDA活力的影響

酒精會導致機體活性氧(reactive oxygen species，ROS)等自由基含量增加，使非酶性抗氧化物含量降低和內(nèi)源性抗氧化酶(如SOD等)活性顯著降低，進而損傷肝臟[23]。從圖2可以看出，損傷組小鼠肝臟GSH、MDA、SOD活性較對照組活性顯著變化，聯(lián)苯雙酯處理組能有效保護肝臟(P<0.05)。具體來說，水提物各劑量和醇提物高劑量處理組均能顯著提高GSH(圖2-a)和SOD(圖2-b)的含量，僅水提物的高劑量組能有效降低MDA的含量(P<0.05)，醇提物作用效果不顯著(圖2-c)。綜合上述結(jié)果，水提物不同劑量組均能有效減輕細胞氧化損傷，醇提取高劑量組對SOD和GSH等酶活有顯著地保護作用，但對細胞中的MDA含量沒有影響；2種提取方式在細胞中MDA含量和抗氧化指標等方面存在顯著性的差異。

2.3 肝損傷病理切片分析

如圖3所示，對照組(圖3-a)肝細排列整齊，細胞分布規(guī)律，形態(tài)正常，有明顯邊界，細胞核大小合適且呈圓狀，未見異常。損傷組(圖3-b)細胞排布散亂，細胞邊界不清晰且間隙大小無規(guī)律，部分細胞質(zhì)中出現(xiàn)脂肪，有些細胞核不明顯，肝細胞出現(xiàn)變性。聯(lián)苯雙酯組(圖3-c)和各提取物組(水提物組：圖3-d～圖3-f；醇提物組圖3-g～圖3-i)可以改善酒精損傷肝細胞的程度，細胞排列較為整齊，細胞質(zhì)中脂肪減少，細胞核較為規(guī)整。各提取物高劑量組改善程度好于中低劑量組，水提物組優(yōu)于醇提物組。

2.4 蒲公英提取物對酒精損傷肝細胞HHL-5中ALT、AST、GSH和SOD的影響

不同蒲公英提取物對酒精損傷肝細胞HHL-5中ALT、AST、GSH和SOD含量的影響結(jié)果如圖4所示。與對照組相比，損傷組ALT、AST、GSH和SOD含量均發(fā)生顯著變化(P<0.05)，說明酒精損傷肝細胞模型建立成功；與損傷組相比，聯(lián)苯雙酯組和蒲公英水、醇提物均能有效地減輕肝細胞損傷。具體來說，水提物高劑量組能有效降低AST含量(圖4-b)；與小鼠血清中AST含量變化不同，蒲公英水、醇提物高劑量組均不能有效降低肝細胞中ALT含量(圖4-a)，2種提取方法對HHL-5肝細胞SOD含量沒有影響(圖4-d)，但其高劑量組能有效提高肝細胞中GSH含量(圖4-c)[24]。

2.5 不同蒲公英提取物保護作用與抗氧化能力相關(guān)性分析

蒲公英提取物的DPPH自由基、羥自由基、ABST陽離子自由基清除能力結(jié)果如表2所示。在0～2.0 g/L，水、醇提取物均具有較強的DPPH自由基清除能力，其清除能力隨著添加量的增加而增加；與DPPH自由基清除結(jié)果類似，2種提取物均具有較強的羥自由基、ABTS陽離子自由基清除能力。采用一般線性模型對不同提取物自由基清除結(jié)果進行分析，蒲公英全粉水提物體外自由基清除能力優(yōu)于醇提物，且不同濃度處理結(jié)果均具有顯著性的差異(P<0.05)。

表2 蒲公英提取物自由基清除能力Table 2 Free radical scavenging capacity of dandelion extract

為了進一步探究蒲公英抗氧化能力與細胞損傷指標的相關(guān)關(guān)系，對相同濃度的蒲公英提取物體外抗氧化劑值和小鼠細胞損傷相關(guān)指標進行相關(guān)分析，結(jié)果如表3所示。蒲公英水、醇提物的體外抗氧化能力與細胞中SOD活性和GSH含量均呈現(xiàn)出較高地相關(guān)性(R>0.82)。上述結(jié)果進一步證實了蒲公英提取物中抗氧化組分是保護肝細胞的重要基礎[25]。

表3 蒲公英水提物和醇提物的自由基清除能力與胞內(nèi)細胞損傷指標的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of radical scavenging capacity and related indexes in water extractand ethanol extract

3 結(jié)論

動物和細胞實驗表明，高劑量的蒲公英水提物、醇提物對酒精誘導的肝損傷均具有保護作用，減輕肝細胞膜和線粒體膜損傷程度，提高肝臟中SOD、GSH等抗氧化酶的水平，降低MDA的含量；與醇提物相比，水提物的作用劑量更低，保護作用更好；體外抗氧化能力及相關(guān)性分析表明，水提物和醇提物都具有很強的自由基清除能力，與胞內(nèi)抗氧化能力呈正相關(guān)性，水提物抗氧化效果更好。

蒲公英提取物保肝效果與其抗氧化作用有關(guān)，水提物與醇提物中多糖、多酚等主要活性物質(zhì)含量不同，水提物中比醇提物含有更多的抗氧化活性物質(zhì)，可能是水提物保肝作用效果好的重要原因，蒲公英中主要保肝物質(zhì)成分及其是否有協(xié)同作用需進一步研究闡明。