李志霞，董超，周杰，安文進(jìn)，張耀海，李晶，王成秋，梁國(guó)魯，焦必寧*

1(西南大學(xué) 柑桔研究所，重慶，400712)2(西南大學(xué) 園藝園林學(xué)院，重慶，400715)

隨著人們健康意識(shí)不斷增強(qiáng)，“吃得營(yíng)養(yǎng)、吃得健康”成為現(xiàn)代人飲食的主流觀念，日常膳食消費(fèi)已由溫飽型轉(zhuǎn)向質(zhì)量型，水果攝入量不斷增加。柑橘含有多種生理活性物質(zhì)，具有重要的保健功能[1-2]，在居民膳食結(jié)構(gòu)中占據(jù)著越來越重要的地位。2018年，我國(guó)柑橘產(chǎn)量達(dá)到4 138.1×104t，占水果總產(chǎn)量的16.1%，成為我國(guó)第一大水果[3]。然而，作為直接鮮食的初級(jí)農(nóng)產(chǎn)品，柑橘使用農(nóng)藥后其消解變化動(dòng)態(tài)及果實(shí)中殘留的農(nóng)藥攝入人體后是否對(duì)人體健康產(chǎn)生危害，風(fēng)險(xiǎn)水平如何等質(zhì)量安全問題受到廣大消費(fèi)者的持續(xù)關(guān)注，也成為該領(lǐng)域近年來的研究熱點(diǎn)之一[4-6]。

柑橘生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，病蟲害多發(fā)，生產(chǎn)中使用的農(nóng)藥種類較多。張耀海等[7]對(duì)我國(guó)6省(市)主產(chǎn)地的198個(gè)柑橘樣品中的農(nóng)藥殘留現(xiàn)狀進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)48.9%的樣品中有農(nóng)藥殘留，質(zhì)量安全存在潛在風(fēng)險(xiǎn)。近來，LI等[8]進(jìn)一步研究分析了我國(guó)2 922份柑橘果實(shí)樣品的農(nóng)藥殘留狀況，發(fā)現(xiàn)有86%的樣品中存在40種不同的農(nóng)藥殘留，其中，丙溴磷、聯(lián)苯菊酯和毒死蜱殘留均為影響柑橘質(zhì)量安全的重要危害因子。這3種農(nóng)藥均為廣譜類殺蟲劑，在我國(guó)柑橘生產(chǎn)中應(yīng)用極為廣泛。此外，已有研究表明，毒死蜱在環(huán)境和動(dòng)植物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物3,5,6-三氯-2-吡啶醇(3,5,6-trichloro-2-pyridinol，TCP)比毒死蜱毒性更強(qiáng)，而且有可能與毒死蜱存在協(xié)同效應(yīng)[9-10]。目前，丙溴磷、聯(lián)苯菊酯、毒死蜱和TCP的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[11-16]，但尚未見關(guān)于其同時(shí)檢測(cè)的方法以及在柑橘中的消解轉(zhuǎn)化和健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)方面的相關(guān)研究報(bào)道。為此，本試驗(yàn)以常見柑橘品種溫州蜜柑為對(duì)象，建立4種農(nóng)藥化合物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)檢測(cè)技術(shù)，同時(shí)采用田間噴藥和動(dòng)態(tài)取樣的方式研究丙溴磷、聯(lián)苯菊酯、毒死蜱及其代謝物在溫州蜜柑中的消解與代謝轉(zhuǎn)化規(guī)律，并對(duì)其可能存在的急性和慢性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，以期為我國(guó)柑橘質(zhì)量安全生產(chǎn)、監(jiān)測(cè)和消費(fèi)引導(dǎo)提供重要的技術(shù)支撐和切實(shí)參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

丙溴磷標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)、聯(lián)苯菊酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.5%)、毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)、TCP標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；乙腈、甲醇(色譜純)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；乙酸銨(色譜純)，德國(guó)Honeywell-Fluka公司；乙二胺基-N-丙基(primary secondary amine，PSA)，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；石墨化炭黑(graphitized carbon black,GCB)，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；無水硫酸鎂、氯化鈉(分析純)，江蘇強(qiáng)盛化工有限公司。試驗(yàn)用丙溴磷(50%乳油，青島中達(dá)農(nóng)業(yè)科技有限公司)、聯(lián)苯菊酯(25 g/L乳油，南寧泰達(dá)豐生物科技有限公司)、毒死蜱(40%乳油，浙江新農(nóng)化工股份有限公司)，購(gòu)于當(dāng)?shù)剞r(nóng)資商店。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-30AD超高效液相色譜儀，日本Shimadzu公司；QTRAPTM 6500三重四極桿線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜儀，美國(guó)AB SCIEX質(zhì)譜系統(tǒng)公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；超純水系統(tǒng)Milli-Q AdvantageA10，美國(guó)Millipore公司；CL31/CL31R多用途離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher公司；CK 2000型高通量組織研磨儀，北京Thmorgan生物科技有限公司。

1.3 田間試驗(yàn)與樣品采集

供試柑橘品種為溫州蜜柑，于2019年8～10月在重慶市歇馬鎮(zhèn)柑桔研究所柑橘試驗(yàn)園內(nèi)(海拔222.8 m，緯度29°76′63 N，經(jīng)度106°39′16 E)進(jìn)行。采用噴霧法對(duì)柑橘樹進(jìn)行農(nóng)藥噴施，其中，消解轉(zhuǎn)化動(dòng)態(tài)試驗(yàn)以所選農(nóng)藥最高推薦劑量的1.5倍液(丙溴磷375 mg a.i./kg、聯(lián)苯菊酯47 mg a.i./kg、毒死蜱750 mg a.i./kg，a.i.表示有效成分)為施藥劑量噴藥1次，并分別于噴藥后0(2 h)、1、3、7、14、21、28、35、45和60 d按隨機(jī)法進(jìn)行果實(shí)樣品采集；最終殘留量試驗(yàn)按良好農(nóng)業(yè)規(guī)范，以所選農(nóng)藥的最高推薦劑量(丙溴磷250 mg a.i./kg、聯(lián)苯菊酯31 mg a.i./kg、毒死蜱500 mg a.i./kg)進(jìn)行噴施，丙溴磷2次、毒死蜱2次、聯(lián)苯菊酯1次，并分別于各自的安全間隔期(pre-harvest interval，PHI)、安全間隔期前1周、安全間隔期后1周各采樣1次。丙溴磷和毒死蜱的PHI為28 d，聯(lián)苯菊酯為21 d。以4株柑橘樹為1個(gè)試驗(yàn)小區(qū)，每個(gè)處理重復(fù)3次，以清水噴施為對(duì)照。每個(gè)處理采樣不少于2 kg，樣品采集標(biāo)號(hào)后，置于加冰保溫盒中運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。用勻漿機(jī)對(duì)樣品進(jìn)行勻漿，于-20 ℃冷凍保存，待測(cè)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品前處理

采用本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化驗(yàn)證的QuEChERS方法：稱取柑橘果實(shí)樣品5.00 g于25 mL離心管中，加入10.00 mL乙腈，垂直振蕩提取10 min，加入2.00 g無水硫酸鎂和0.50 g氯化鈉，垂直振蕩1 min后，10 000 r/min離心5 min。移取1.50 mL上清液加入裝有25 mg GCB的4 mL離心管中，渦旋1 min，以4 000 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，上機(jī)檢測(cè)。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

分別準(zhǔn)確稱取約10.0 mg農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容。取相應(yīng)量的單標(biāo)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，用乙腈配制成10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液，于-20 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆?。使用時(shí)，為消除基質(zhì)效應(yīng)，將標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液按照1.4.1方法處理后的柑橘提取液溶液稀釋至質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20、50、100和200 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃條件下保存。

1.4.3 色譜條件

色譜柱：ACE Excel 2 C18(100 mm×2.1 mm，2 μm)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：2.0 μL；流速：0.4 mL/min；流動(dòng)相A：5 mmol/L乙酸銨水溶液；流動(dòng)相B：甲醇。梯度洗脫程序：0～5 min，10% B；5～8 min，90% B；8～10 min，10% B。

1.4.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)；掃描方式：丙溴磷、聯(lián)苯菊酯和毒死蜱為正離子掃描，TCP為負(fù)離子掃描；監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)；離子源溫度：450 ℃；電壓5 500 V(ESI +)/-4 500 V(ESI-)；霧化氣壓力：344.7 kPa；氣簾氣壓力：241.3 kPa。MRM 質(zhì)譜參數(shù)見表 1。

表1 所選農(nóng)藥的質(zhì)譜條件參數(shù)Table 1 UPLC-MS/MS parameters for the selected pesticides

1.4.5 方法學(xué)考察

取柑橘空白樣品，添加3個(gè)或以上濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)，每個(gè)濃度做5次平行，以滿足農(nóng)藥殘留分析回收率要求的最低添加濃度為方法定量限(limit of quantity，LOQ)。

1.5 膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

農(nóng)藥殘留膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估即對(duì)經(jīng)膳食途徑攝入人體內(nèi)的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行定量評(píng)價(jià)，通常使用食物消費(fèi)數(shù)據(jù)和化學(xué)物濃度檢測(cè)數(shù)據(jù)，結(jié)合人體體重?cái)?shù)據(jù)，獲得膳食暴露量的估計(jì)，再與國(guó)際公認(rèn)的毒性參考劑量進(jìn)行比較，評(píng)估目標(biāo)化合物對(duì)人體健康的潛在風(fēng)險(xiǎn)。慢性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)按公式(1)、公式(2)進(jìn)行計(jì)算[16]，急性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)按公式(3)、公式(4)進(jìn)行計(jì)算[17]，暴露風(fēng)險(xiǎn)值HQ<1時(shí)，健康風(fēng)險(xiǎn)在可接受范圍內(nèi)；而HQ>1時(shí)，存在不可接受的健康風(fēng)險(xiǎn)。

(1)

(2)

式中：HQChronic為慢性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)；EDI為每日估計(jì)攝入量(mg/kg bw)；ADI為每日允許攝入量(mg/kgbw)，源自WHO數(shù)據(jù)庫(kù)[18]；DC為農(nóng)藥殘留檢出濃度(mg/kg)；FC為柑橘的人均消費(fèi)量(kg)；BW為人群平均體重(kg bw)。不同人群體重與柑橘消費(fèi)數(shù)據(jù)來源于WHO統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[19]。

(3)

(4)

式中：HQAcute為急性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)；ESTI為短期估計(jì)攝入量(mg/kg bw)；ARfD為急性參考劑量(mg/kg)，源自WHO數(shù)據(jù)庫(kù)[18]；LP為柑橘日消費(fèi)大份餐(kg)；HR為柑橘中檢出的最高農(nóng)藥殘留濃度(mg/kg bw)；v為變異因子；BW為人群平均體重(kg bw)。柑橘日消費(fèi)大份餐和變異因子數(shù)據(jù)來源于WHO統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法驗(yàn)證結(jié)果

用柑橘果實(shí)空白樣品提取液逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，以農(nóng)藥質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。做4個(gè)濃度水平的添加回收實(shí)驗(yàn)，添加水平為2～1 000 μg/kg，每個(gè)添加濃度重復(fù)5次，其定量限、相關(guān)系數(shù)、添加回收率等結(jié)果見表2。結(jié)果表明，在1～200 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，所選農(nóng)藥的線性良好(r2>0.99)，LOQs在2～10 μg/kg。在4個(gè)加標(biāo)水平下，所選農(nóng)藥的回收率為80%～108%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)為0.43%～9.76%，該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，可滿足所選農(nóng)藥殘留檢測(cè)分析要求[20]。所選農(nóng)藥的UPLC-MS/MS色譜圖見圖1。

表2 試驗(yàn)農(nóng)藥的LOQ、相關(guān)系數(shù)(r2)、回收率和RSDsTable 2 The LOQs, correlation coefficient (r2), recoveries and RSDs for the experimental pesticides

2.2 柑橘生長(zhǎng)發(fā)育過程中試驗(yàn)農(nóng)藥的殘留消解變化

監(jiān)測(cè)了丙溴磷、聯(lián)苯菊酯、毒死蜱及其代謝物TCP在柑橘生長(zhǎng)發(fā)育過程中的殘留消解動(dòng)態(tài)變化，如圖2所示。施藥后2 h，測(cè)得的丙溴磷、聯(lián)苯菊酯、毒死蜱和TCP原始?xì)埩袅糠謩e為402.87、91.54、593.27和3.23 μg/kg。施藥14 d內(nèi)，丙溴磷、聯(lián)苯菊酯、毒死蜱的殘留量快速消解，14 d時(shí)消解率分別達(dá)到62.8%、66.0%和89.4%，均降至各自的最大殘留限量(maximum residue limit，MRL)值以下[21]，但與其他農(nóng)藥相比，3種農(nóng)藥在柑橘中的消解速度慢，較難降解[22-24]。之后，三者殘留量呈穩(wěn)定消解趨勢(shì)，施藥60 d時(shí)消解率為80.7%～95.5%。TCP殘留量呈先升后降趨勢(shì)，施藥14 d時(shí)達(dá)到原始?xì)埩魸舛鹊?.62倍，可能是毒死蜱進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化增加了TCP的殘留量；14 d后TCP的殘留量快速消解，表明TCP在柑橘體內(nèi)積累至一定濃度后開始降解代謝[25]，到60 d時(shí)殘留濃度為3.69 μg/kg，與施藥14 d時(shí)的最高濃度相比，消解率為68.4%?？梢?，TCP在柑橘中的消解速度比毒死蜱更低。

2.3 柑橘中試驗(yàn)農(nóng)藥殘留的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全評(píng)估的重

要組成部分，也是衡量產(chǎn)品安全性的手段之一。柑橘果實(shí)是典型的非呼吸躍變型水果，其果皮和果肉的成熟度往往不同步。溫州蜜柑是寬皮柑橘的主要品種，在我國(guó)果實(shí)一般9月中下旬成熟，在完熟期之前，溫州蜜柑果實(shí)在綠熟期和轉(zhuǎn)色期就可能被采摘食用[26-27]，使用高風(fēng)險(xiǎn)農(nóng)藥是否會(huì)對(duì)消費(fèi)者產(chǎn)生健康風(fēng)險(xiǎn)需進(jìn)行評(píng)價(jià)。本研究分析了3種常用殺蟲劑在溫州蜜柑中按照良好農(nóng)業(yè)規(guī)范施用后，安全間隔期及其前后各1周采樣對(duì)我國(guó)消費(fèi)者的膳食風(fēng)險(xiǎn)水平。由表3和表4可知，慢性和急性暴露風(fēng)險(xiǎn)值隨安全間隔期延長(zhǎng)而降低，慢性暴露風(fēng)險(xiǎn)表現(xiàn)為毒死蜱>丙溴磷>聯(lián)苯菊酯，分布范圍在0.000 8～0.002 3，急性暴露風(fēng)險(xiǎn)表現(xiàn)為聯(lián)苯菊酯>毒死蜱>丙溴磷，分布范圍在0.000 1～0.004 5，均遠(yuǎn)低于安全界限1。因此，按照良好農(nóng)業(yè)規(guī)范在溫州蜜柑上施用丙溴磷、聯(lián)苯菊酯和毒死蜱農(nóng)藥后，在安全間隔期前1周至后1周期間內(nèi)，溫州蜜柑中丙溴磷、聯(lián)苯菊酯和毒死蜱的殘留濃度對(duì)人體健康的急性或慢性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)均在可接受范圍內(nèi)，與前人研究的水果中農(nóng)藥殘留相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果基本一致[4,17,24,28]。

表3 試驗(yàn)農(nóng)藥對(duì)我國(guó)消費(fèi)者的慢性膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估Table 3 The chronic dietary risk assessment of the selected pesticides for Chinese consumers

表4 試驗(yàn)農(nóng)藥對(duì)我國(guó)消費(fèi)者的急性膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估Table 4 The acute dietary risk assessment of the selected pesticides for Chinese consumers

3 結(jié)論

柑橘樣品經(jīng)QuEChERS方法處理后，采用UPLC-MS/MS技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明該方法操作簡(jiǎn)單，具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，可滿足試驗(yàn)農(nóng)藥殘留檢測(cè)分析要求。在柑橘生長(zhǎng)發(fā)育過程中，丙溴磷、聯(lián)苯菊酯、毒死蜱呈先快速消解后緩慢穩(wěn)定消解的趨勢(shì)，而TCP殘留量先升高后下降，消解速度較慢，安全間隔期及其前后1周的殘留濃度均在各自的MRL值以下。按照良好農(nóng)業(yè)規(guī)范在溫州蜜柑上施用丙溴磷、聯(lián)苯菊酯和毒死蜱后，溫州蜜柑中丙溴磷、聯(lián)苯菊酯和毒死蜱的殘留濃度對(duì)人體健康的急性或慢性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)均在可接受范圍內(nèi)。