魏 英，王靳琎，黃慧敏，陳琴華

0 引言

肝癌是世界上第五大常見(jiàn)癌癥，嚴(yán)重威脅著人類健康，5年生存率較低 (約15%，偏遠(yuǎn)地區(qū)僅為2%)[1]。手術(shù)是原發(fā)性肝癌的首選治療方法，但80%～90%的患者確診時(shí)已發(fā)生廣泛的肝內(nèi)和肝外轉(zhuǎn)移，錯(cuò)過(guò)手術(shù)時(shí)機(jī)。放化療可有效提高局部控制率，改善遠(yuǎn)期生存率。

羥基喜樹(shù)堿(Hydroxy camptothecin，HCPT)是一種廣譜的抗腫瘤藥，是從喜樹(shù)的皮、果實(shí)中提取得到的一類色氨酸-萜烯生物堿，屬于細(xì)胞周期特異性藥物，主要作用于DNA合成期(S期)，對(duì)原發(fā)性肝癌具有治療作用[2-4]。HCPT為水不溶和脂難溶性藥物，很難通過(guò)生物膜進(jìn)入組織和細(xì)胞，半衰期非常短，而且藥物穩(wěn)定性非常差，分子內(nèi)部的內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)容易在中性和堿性條件下開(kāi)環(huán)，降低藥物活性，不易發(fā)揮長(zhǎng)效抗腫瘤作用[5-6]。課題組根據(jù)前藥原理，在HCPT的10位引入戊二酸基團(tuán)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行適當(dāng)修飾，得到羥基喜樹(shù)堿戊二酸單酯(Hydroxy camptothecin glutaric acid monoester，HCPT-GCM)偶合物(見(jiàn)圖1)，并申請(qǐng)了專利，專利號(hào)為：201610692633.2。HCPT-GCM的水溶性(20.17 μg/ml)遠(yuǎn)大于HCPT(4.64 μg/ml)。本研究以HCPT為對(duì)照，觀察細(xì)胞對(duì)HCPT和HCPT-GCM的攝取情況；不同濃度的HCPT-GCM作用于肝癌H22細(xì)胞株，初步探討HCPT-GCM對(duì)肝癌細(xì)胞株增殖抑制作用，現(xiàn)報(bào)到如下。

圖1 HCPT-GCM的結(jié)構(gòu)(在HCPT的10位引入戊二酸基團(tuán))

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及試劑 人肝癌細(xì)胞株H22 購(gòu)于武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心，羥基喜樹(shù)堿購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，HCPT-GCM由課題組合成，胎牛血清、細(xì)胞計(jì)數(shù)Kit-8試劑盒購(gòu)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Biotek公司，生物安全柜購(gòu)于中國(guó)Heal Force公司，CO2培養(yǎng)箱購(gòu)于法國(guó)Thermo公司，熒光顯微鏡購(gòu)于德國(guó)Carl zeiss AG公司，高效液相色譜儀(Agilent 1260 InfinityⅡ)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的RPMI-l640培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株H22，當(dāng)細(xì)胞覆蓋80%～90%瓶底后,用0.25%的胰酶-EDTA消化傳代，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 50.0 μM的HCPT-GCM、HCPT分別作用于H22細(xì)胞0.5、4 h后。1份用冷PBS溶液清洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS溶液清洗3次，PI染色15 min，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞對(duì)2種藥物的攝取情況；羥基喜樹(shù)堿被細(xì)胞攝取后，在360 nm的激發(fā)光波的作用下發(fā)射出440 nm的光波，熒光顯微鏡下可觀察到藍(lán)紫色熒光顆粒[7]；PI 被細(xì)胞攝取后，460～550 nm光波激發(fā)后,顯微鏡下可觀察到紅色熒光，通過(guò)比較細(xì)胞內(nèi)紫藍(lán)色熒光顆粒的多少,直觀判斷細(xì)胞對(duì)2種藥物的攝取情況。另1份用冷的PBS 溶液清洗3次，每孔加入1 ml細(xì)胞裂解液，室溫裂解1 h，收集溶液加入20 μl磷酸緩沖液；12 000 r/m離心10 min，取20 μl上清液注入高效液相色譜儀(HPLC)測(cè)定藥物濃度，計(jì)算細(xì)胞對(duì)藥物的攝取情況。

1.5 MTT試驗(yàn) 體外常規(guī)培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株H22，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/ml，96孔板中培養(yǎng)24 h后，每孔分別加入含不同濃度(0、0.125、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μM)的HCPT-GCM及HCPT的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行孔，作用48 h后，細(xì)胞計(jì)數(shù)Kit-8試劑盒490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值OD，計(jì)算HCPT-GCM及HCPT對(duì)人肝癌細(xì)胞株H22的增殖抑制率。

1.6 細(xì)胞周期試驗(yàn) 體外常規(guī)培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株H22，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/ml，6孔板中培養(yǎng)24 h后，每孔分別加入含不同濃度(0、1.0、2.5、5.0 μM)的HCPT-GCM的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔，作用24 h后，按照說(shuō)明書(shū)收集細(xì)胞，75%冷乙醇固定，冷PBS清洗細(xì)胞，PI染色，流式細(xì)胞儀分析周期。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞對(duì)藥物的攝取情況 50.0 μM的HCPT-GCM和HCPT分別作用于H22細(xì)胞0、0.5、4 h后，熒光顯微鏡下顯示,HCPT-GCM處理組細(xì)胞內(nèi)藍(lán)紫色熒光顆粒較HCPT處理組多(見(jiàn)圖2)，表明HCPT-GCM更易通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。HPLC法結(jié)果也顯示,HCPT-GCM處理組細(xì)胞內(nèi)藥物濃度較HCPT處理組高，HCPT-GCM更易進(jìn)入細(xì)胞(見(jiàn)圖3)。

圖2 肝癌H22細(xì)胞對(duì)HCPT-GCM和HCPT的攝取情況(×200)

圖3 肝癌H22細(xì)胞對(duì)HCPT-GCM和HCPT的攝取情況(HPLC法)

2.2 藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用 不同濃度的HCPT-GCM及HCPT分別作用于H22細(xì)胞48h后，各濃度的2種藥物對(duì)H22細(xì)胞增殖均有一定的抑制作用，藥物濃度小于5.0 μM時(shí)，隨著藥物濃度的增加對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率增強(qiáng)，大于5.0 μM時(shí)，隨著藥物濃度的增加對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用改變不明顯；藥物濃度為0.5、1.0、2.5、5.0 μM時(shí)，HCPT-GCM對(duì)H22細(xì)胞的增殖抑制作用較HCPT強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。以上結(jié)果表明，2種藥物對(duì)肝癌細(xì)胞株H22均有明顯的增殖抑制作用，且HCPT-GCM的抑制作用更強(qiáng)。

表1 HCPT-GCM對(duì)肝癌H22細(xì)胞增殖的抑制作用

2.3 HCPT-GCM對(duì)H22細(xì)胞周期的作用 0、1.0、2.5、5.0 μM的HCPT-GCM作用于H22細(xì)胞24 h后，PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。與對(duì)照組相比較，1.0、2.5、5.0 μM的HCPT-GCM組細(xì)胞G2/M期顯著減少，S期顯著增加，細(xì)胞周期阻滯在S期(圖4，表2)。

圖4 HCPT-GCM對(duì)肝癌H22細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

表2 HCPT-GCM對(duì)肝癌H22細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

3 討論

羥基喜樹(shù)堿是一種細(xì)胞周期特異性抗腫瘤藥，通過(guò)抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I，對(duì)多種腫瘤具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性[8-9]。研究證明，HCPT對(duì)原發(fā)性肝癌具有治療的作用[10-11]。但HCPT為水不溶和脂難溶性藥物，半衰期非常短，分布半衰期為5 min左右，消除半衰期為30 min，難以通過(guò)生物膜進(jìn)入組織和細(xì)胞，不易發(fā)揮長(zhǎng)效抗腫瘤作用[12]；HCPT包含細(xì)胞毒作用的內(nèi)酯環(huán)，水溶性極差，一般將其制成水溶性鈉鹽針劑；當(dāng)pH<5時(shí)，以羥基內(nèi)酯環(huán)的結(jié)構(gòu)存在，在較高pH環(huán)境下，迅速水解成羧酸形結(jié)構(gòu)，喪失活性[13-16]。為達(dá)到治療目的，實(shí)際用量遠(yuǎn)超理論用量，使得藥物胃腸道反應(yīng)、腎毒性和骨髓抑制等毒副作用較大[17-19]。因此，對(duì)HCPT進(jìn)行局部修飾、有效提高水溶性、克服轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中失效等問(wèn)題具有重要意義。HCPT-GCM偶合物是在HCPT的10位引入戊二酸基團(tuán)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行適當(dāng)修飾得到的，目前對(duì)HCPT-GCM的研究尚處在起始階段。

喜樹(shù)堿被細(xì)胞攝取后，在360 nm的激發(fā)光波的作用發(fā)射出440 nm的光波，熒光顯微鏡下可觀察到藍(lán)紫色的熒光[7]。本課題組應(yīng)用喜樹(shù)堿的這一特點(diǎn)做了細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，50.0 μM的HCPT-GCM和HCPT分別作用于肝癌H22細(xì)胞0.5、4 h后，H22細(xì)胞在2個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)HCPT-GCM的吞噬作用均較HCPT強(qiáng)，證明HCPT-GCM更易通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；同時(shí)，HPLC法藥物濃度測(cè)定進(jìn)一步證明HCPT-GCM較HCPT更易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。這與前期專利申請(qǐng)的研究結(jié)果相符，HCPT-GCM的溶解度遠(yuǎn)大于HCPT。

MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示，0.5、1.0、2.5、5.0 μM的HCPT-GCM和HCPT分別作用于肝癌細(xì)胞株H22 48 h后，HCPT-GCM對(duì)H22細(xì)胞的增殖抑制作用較HCPT強(qiáng)，表明HCPT-GCM對(duì)肝癌細(xì)胞株H22具有更強(qiáng)的體外抑制作用。當(dāng)濃度大于5.0 μM時(shí)，隨著藥物濃度的增加對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用增加不明顯，表明，HCPT-GCM最佳作用濃度小于5.0 μM。

羥基喜樹(shù)堿是細(xì)胞周期特異性抗腫瘤藥，根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)細(xì)胞增殖抑制率較好的藥物濃度(1.0、2.5、5.0 μM)的HCPT-GCM作用于H22肝癌細(xì)胞株24 h，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，細(xì)胞G2期減少，S期顯著增加，細(xì)胞阻滯在S期，表明，HCPT-GCM使H22細(xì)胞周期停止于S期，干擾了細(xì)胞DNA的復(fù)制，從而抑制了細(xì)胞的增殖。

綜上所述，HCPT-GCM較HCPT更易通過(guò)細(xì)胞膜，且HCPT-GCM對(duì)肝癌細(xì)胞株H22的增殖抑制作用較HCPT強(qiáng)；HCPT-GCM作用于細(xì)胞周期，使細(xì)胞周期停止于S期，干擾DNA的復(fù)制是其抑制細(xì)胞增殖的作用機(jī)制之一。HCPT-GCM作為一個(gè)專利藥，其穩(wěn)定性、體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)、組織分布、生物安全性、體內(nèi)外抗肝癌活性及其原理等相關(guān)問(wèn)題，課題組后期將做進(jìn)一步的研究報(bào)道。