段立軍

（青島黃海制藥有限責(zé)任公司，山東 青島 266000）

維格列?。╒ildagliptin）是一種可口服給藥的二肽基肽酶Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制劑，具有選擇性、競爭性和可逆性，主要通過抑制DPP-Ⅳ的蛋白水解酶活性，增強(qiáng)胰高血糖素樣肽（GLP-1）和腸抑胃肽（GLP）的活性，發(fā)揮降血糖作用[1]。維格列汀能夠改善2型糖尿病病人的胰島素抵抗，顯著降低病人的炎癥因子水平，并通過調(diào)控結(jié)締組織生長因子（CTGF）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[2-3]。維格列汀單獨(dú)用藥可改善血糖控制，并發(fā)癥少，耐受性好；與二甲雙胍、磺脲類、噻唑烷二酮類藥物聯(lián)合應(yīng)用可增強(qiáng)療效，且不增加低血糖的風(fēng)險(xiǎn)，也不增加體重[4-5]。

維格列汀結(jié)構(gòu)中有1個(gè)手性碳原子，理論上具有2個(gè)手性異構(gòu)體，即R構(gòu)型和S構(gòu)型。維格列汀以共價(jià)鍵結(jié)合的方式來抑制DPP-Ⅳ酶的活性部位發(fā)揮作用，R構(gòu)型的異構(gòu)體因具有較大的空間位阻[6]，在一定程度上會影響維格列汀對DPP-Ⅳ酶活性的抑制效果，因此為了發(fā)揮出更好的體內(nèi)活性，應(yīng)在維格列汀或中間體中控制R型異構(gòu)體的含量。據(jù)報(bào)道，正相手性色譜柱對化合物的對映異構(gòu)體具有良好的分離效果，廣泛應(yīng)用于化合物對映異構(gòu)體含量的測定中[7-8]。本文建立了采用正相高效液相色譜法、用手性色譜柱對維格列汀中的R型異構(gòu)體進(jìn)行含量測定的色譜方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Thermo U3000 高效液相色譜儀、CHIRALPAK IE 手性色譜柱、XS205DU型電子天平。

1.2 藥品與試劑

R-維格列汀對照品（含量99.4%）、維格列?。ê?9.8%）、正己烷（色譜級）、乙醇（色譜級）、甲醇（色譜級）、二乙胺（色譜級）、三氟乙酸（色譜級）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱為CHIRALPAK IE手性色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相為正己烷-乙醇-甲醇-二乙胺-三氟乙酸（72∶24∶4∶0.05∶0.05），柱溫為35℃，流速為0.8mL·min-1，檢測波長為215nm，進(jìn)樣量為10μL。

2.2 溶液的制備

R型異構(gòu)體對照品溶液：精密稱取維格列汀R型異構(gòu)體對照品適量，加無水乙醇溶解后，配制成維格列汀R型異構(gòu)體濃度為6μg·mL-1的溶液。

系統(tǒng)適用性溶液：各取適量維格列汀對照品和R型異構(gòu)體對照品，加無水乙醇溶解并定量稀釋后，配制成濃度分別為3mg·mL-1和6μg·mL-1的混合溶液。

供試品溶液：精密稱取供試品30mg，加無水乙醇溶解并定量稀釋，配制成維格列汀濃度為3mg·mL-1的溶液。

空白溶液：取無水乙醇作為空白溶劑。

2.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

精密量取2.2中的空白溶液、系統(tǒng)適用性溶液、對照品溶液和供試品溶液各10μL，進(jìn)樣分析，色譜圖見圖1。維格列汀R型異構(gòu)體與維格列汀的分離度為5.43，大于1.5，表明系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)符合要求。

圖1 HPLC 色譜圖a.blank solvents; b.system suitability solution; c.standard solution; d.test sample; 1.R-vildagliptin; 2.vildagliptinFig 1 HPLC chromatograms

2.4 檢測限與定量限

精密稱取維格列汀R型異構(gòu)體適量，加無水乙醇稀釋后，精密量取10μL進(jìn)樣進(jìn)行測定。維格列汀R型異構(gòu)體的檢測限為0.62μg·mL-1，相當(dāng)于供試液濃度的0.01%；定量限為1.53μg·mL-1，相當(dāng)于供試液濃度的0.04%。

2.5 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)

精密稱取維格列汀R型異構(gòu)體適量，用無水乙醇溶解并稀釋成濃度分別為 1.5、5.0、8.0、10、12、15μg·mL-1的溶液。精密量取上述溶液各10μL，依次注入液相色譜儀并記錄色譜圖。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，濃度X為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：Y=11.22X-2.44（r=0.9999），說明維格列汀R型異構(gòu)體在2.0~15μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

取維格列汀原料適量，加無水乙醇溶解后，分別加入維格列汀R型異構(gòu)體貯備液適量，定量稀釋后，配制成維格列汀濃度為3mg·mL-1、以及相當(dāng)于 R 型異構(gòu)體濃度分別為 1.5（定量限）、5.0、10、15μg·mL-1的溶液。每個(gè)濃度水平取3份，分別注入液相色譜儀，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=12）Table 1 Results of recovery tests（n=12）

2.7 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一批號的供試品，在不同日期，分別由2名分析人員在2臺高效液相色譜儀上，按對映異構(gòu)體的分析方法，各平行測定6份樣品。測得的R型異構(gòu)體含量均在檢測限以下，視為未檢出，表明該方法的精密度良好。

2.8 樣品含量測定

選取3批自制的中試樣品（2005701、2005702、2005703）和原研制劑（商品名佳維樂Galvus）分別制備成樣品溶液。精密量取樣品溶液10μL，注入液相色譜儀進(jìn)行測定。R型異構(gòu)體的含量均低于檢測限，即未檢出。

3 討論

本研究采用高效液相色譜法，以直鏈淀粉-三（3,5-二氯苯基氨基甲酸酯）鍵合硅膠為填充劑，正己烷-乙醇-甲醇-二乙胺-三氟乙酸（72∶24∶4∶0.05∶0.05）為流動相，對維格列汀中的R型異構(gòu)體進(jìn)行含量測定。結(jié)果表明，本方法的專屬性強(qiáng)，靈敏度高，線性、準(zhǔn)確度和精密度良好，可有效測定維格列汀R型異構(gòu)體，為企業(yè)對維格列汀產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。