趙晶瑩，吳玉斌

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院小兒腎臟風(fēng)濕免疫科，沈陽 110004）

近年來，急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）和慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。研究［1］表明AKI是CKD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。AKI后腎臟不良修復(fù)會(huì)導(dǎo)致進(jìn)行性腎纖維化和CKD。由AKI發(fā)展而來的CKD稱為AKI-CKD轉(zhuǎn)變［1-2］。研究［3-5］表明，AKI后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，血清肌酐可以回歸到基線水平，但腎內(nèi)細(xì)胞炎癥反應(yīng)仍持續(xù)存在，導(dǎo)致腎纖維化和長(zhǎng)期腎功能不全。在這過程中，缺氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足、ATP消耗、活性氧產(chǎn)生和Ca2+穩(wěn)態(tài)破壞可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。

槐耳是一種生長(zhǎng)在槐樹樹干上的淺褐色傘菌類真菌，作為中藥已有1 500余年歷史。研究［6］顯示槐耳提取物治療的不良反應(yīng)很少。已有研究［7-8］表明槐耳對(duì)腎臟損傷有保護(hù)作用。然而槐耳在AKI-CKD轉(zhuǎn)變中的作用及其與ERS的關(guān)系研究鮮有報(bào)道。本研究采用缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）建造AKI-CKD小鼠模型，探討槐耳對(duì)AKI-CKD轉(zhuǎn)變的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品及分組

72只雄性6～8周齡C57BL/6小鼠購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物有限公司，動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，溫度為（25±2）℃，濕度50%～70%，晝夜節(jié)律12 h光照/12 h黑暗，正常飲食?；倍嘤蓡|蓋天力藥業(yè)有限公司提供。將小鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)（Sham）組、IRI組和槐耳治療（IRI+Huaier）組，每組24只。

1.2 模型制備與給藥

IRI組進(jìn)行缺血再灌注手術(shù)，小鼠戊巴比妥（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后固定在手術(shù)臺(tái)上，局部皮膚脫毛，無菌下行腹部正中切口，找到腎動(dòng)脈，利用非創(chuàng)傷性微血管夾，夾閉雙側(cè)腎蒂30 min；Sham組只開腹；在腎缺血期間暫時(shí)關(guān)腹，去除微血管夾后確定腎動(dòng)脈再灌注成功后分層縫合關(guān)閉腹腔。IRI+Huaier組操作同IRI組，手術(shù)后3 d開始槐耳浸膏［6 g/（kg·d）］灌胃，持續(xù)至術(shù)后28 d。

1.3 方法

1.3.1 腎功能檢測(cè)：各組小鼠分別于造模后24 h、3 d、7 d、14 d、28 d尾靜脈采血，常溫靜置2 h，4 ℃離心10 min，分離血清，留取標(biāo)本后-20 ℃保存。采用脲酶UV法檢測(cè)血肌酐水平。

1.3.2 ELISA檢測(cè)：血清中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（neutrophil gelatinaseassociated lipocalin，NGAL）水平測(cè)定按照ELISA試劑盒（SEB388Mu，武漢Uscnk公司）說明書操作進(jìn)行。

1.3.3 腎組織形態(tài)學(xué)觀察：于造模后28 d處死各組小鼠，剖腹取腎，用10%多聚甲醛固定，制作石蠟切片（片厚3 μm），HE染色，復(fù)染，脫水、透明后用中性樹膠封片，光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變。腎組織中膠原形成情況檢測(cè)：各組小鼠于造模后28 d處死，剖腹取腎，10%多聚甲醛固定，制作石蠟切片（片厚3 μm），Masson染色觀察腎臟膠原形成、腎臟纖維化程度，計(jì)算各組腎小管損傷評(píng)分和間質(zhì)纖維化百分比［9］。

1.3.4 Western blotting檢測(cè)ERS相關(guān)分子GRP78、CHOP表達(dá)：提取造模后28 d腎組織蛋白，加入上樣緩沖液后依次上樣，并加入Marker蛋白，電泳起始電壓為80 V，當(dāng)溴酚蘭移動(dòng)到分離膠時(shí)改為120 V電壓，當(dāng)溴酚蘭跑出膠面時(shí)關(guān)閉電源終止電泳。電泳結(jié)束后，將分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，進(jìn)行一抗（GRP78、CHOP 抗體）孵育，隨后進(jìn)行二抗孵育，洗膜，配制ECL底物發(fā)光液，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)C300進(jìn)行顯色發(fā)光，采用Image J軟件分析蛋白質(zhì)條帶的光密度值。

1.3.5 TUNEL實(shí)驗(yàn)：組織切片脫蠟至水后滴加0.1%Triton X-100（0.1%檸檬酸鈉鹽配置）50 μL，室溫放置8 min。PBS漂洗3次，5 min/次。配制TUNEL反應(yīng)液：Enzyme solution及Label Solution按1 ∶9配 制，滴 加TUNEL反應(yīng)液（50 μL）。保濕、避光、37 ℃孵育60 min。PBS漂洗，滴加DAPI至完全覆蓋組織，避光復(fù)染5 min。PBS漂洗，滴加熒光淬滅劑封片。顯微鏡下觀察染色效果并拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠AKI后腎纖維化模型構(gòu)建

結(jié)果顯示，術(shù)后IRI組各時(shí)間點(diǎn)肌酐水平均較Sham組升高（P＜ 0.05）。小鼠在IRI術(shù)后24 h血肌酐明顯升高，達(dá)到最高峰，術(shù)后第3天肌酐水平下降，第7天肌酐迅速下降，第28天肌酐顯著下降，腎功能明顯恢復(fù)。說明小鼠AKI后腎纖維化模型成功構(gòu)建。IRI+Huaier組術(shù)后7 d和28 d肌酐水平均較IRI組下降，腎功能較IRI組恢復(fù)明顯（P＜ 0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠術(shù)后各時(shí)間血清肌酐水平比較Fig.1 Comparison of serum creatinine levels after surgery among the three groups

2.2 各組腎組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

HE染色結(jié)果：光鏡下可見Sham組小鼠腎小管基底膜完整，小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；IRI組腎小管彌漫性擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞腫脹變性、壞死，部分萎縮、刷狀緣消失，間質(zhì)可見彌漫單核細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)纖維化；IRI+Huaier組小鼠腎間質(zhì)纖維化程度明顯減輕，腎小管上皮細(xì)胞無萎縮和代償性肥大，未見間質(zhì)水腫。Masson染色結(jié)果：與Sham組比較，IRI組膠原纖維增多，腎間質(zhì)增寬，間質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)成分增多，表現(xiàn)為多灶狀纖維化；IRI+Huaier組腎臟纖維化程度低于IRI組，但仍高于Sham組。術(shù)后28 d IRI組腎臟損傷及纖維化程度較Sham組升高（P＜ 0.01），而IRI+Huaier組較IRI組腎臟損傷及纖維化程度減輕（P＜ 0.01）。IRI組術(shù)后28 d NGAL水平較Sham組明顯上調(diào)（P＜ 0.001）；而IRI+Huaier組NGAL水平較IRI組明顯降低（P＜ 0.001），見圖2。

圖2 3組腎損傷和纖維化程度比較Fig.2 Degree of renal injury and fibrosis in each group

2.3 Western blotting檢測(cè)各組小鼠腎組織GRP78、CHOP 蛋白的表達(dá)

結(jié)果顯示，IRI組GRP78、CHOP表達(dá)與Sham組比較明顯增加（P＜ 0.01），IRI+Huaier組GRP78表達(dá)與IRI組比較顯著下降（P＜ 0.05）。見圖3。

圖3 Western blotting檢測(cè)各組GRP78、CHOP蛋白的表達(dá)Fig.3 GRP78 and CHOP protein expression in the kidneys by Western blotting

2.4 TUNEL法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡結(jié)果

Annexin V/PI雙染色顯示，Sham組、IRI組、IRI+Huaier組凋亡細(xì)胞百分比分別為（1.32±0.36）%、（12.34±1.99）%、（8.16±1.60）%，與Sham組比較，IRI組凋亡細(xì)胞明顯增加（P＜ 0.001）；與IRI組比較，IRI+Huaier組凋亡細(xì)胞明顯減少（P＜ 0.001），見圖4。

圖4 TUNEL法測(cè)定各組細(xì)胞凋亡情況比較×400Fig.4 Apoptosis was determined among the three groups by TUNEL assay ×400

3 討論

本研究以IRI后小鼠作為AKI動(dòng)物模型來研究槐耳對(duì)AKI-CKD作用。造模采用常用的雙側(cè)腎臟缺血再灌注模型，結(jié)果顯示，IRI后腎功能隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸恢復(fù)，術(shù)后28 d時(shí)血肌酐接近正常值，但HE、Masson染色結(jié)果和血清NGAL水平升高說明腎臟損傷及間質(zhì)纖維化仍十分明顯。IRI+Huaier組血肌酐水平較IRI組下降，說明槐耳可保護(hù)AKI后腎功能；28 d時(shí)HE、Masson染色結(jié)果顯示腎臟損傷及纖維化程度較IRI組減輕，說明槐耳可以減輕AKI后腎損傷及纖維化程度。

最近，研究［10］指出腎臟近曲小管的ERS在IRI損傷導(dǎo)致的AKI后腎纖維化過程中持續(xù)存在，參與腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展，持續(xù)的ERS可引發(fā)凋亡［11］，GRP78表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，是ERS的標(biāo)志性蛋白之一，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂時(shí)，非折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)堆積，致使GRP78與PERK、ATF6、IRE1分離，GRP78表達(dá)增高是 ERS 發(fā)生和存在的標(biāo)志［12］，CHOP主要表達(dá)于細(xì)胞核，是轉(zhuǎn)錄因子家族 C/EBP的成員之一，在正常生理情況下表達(dá)極低，而當(dāng)發(fā)生過度的ERS時(shí)其表達(dá)顯著被誘導(dǎo)，調(diào)控下游細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)［13］。XU等［14］在UUO模型中發(fā)現(xiàn)ERS活化并能促進(jìn)腎臟纖維化。

研究［15］顯示，槐耳通過刺激細(xì)胞因子釋放和產(chǎn)生活性氧、一氧化氮來調(diào)節(jié)先天免疫，潛在的不良反應(yīng)是惡心和嘔吐。槐耳浸膏對(duì)順鉑誘導(dǎo)的小鼠AKI具有保護(hù)作用，可能機(jī)制是通過抑制腎小管上皮細(xì)胞炎癥、凋亡發(fā)生而實(shí)現(xiàn)［7］?；辫近S（槐耳為主要成分）可通過抑制ESR，抑制足細(xì)胞GRP78 和CHOP表達(dá)，保護(hù)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷，降低細(xì)胞凋亡［8］。目前尚無槐耳在AKI-CKD轉(zhuǎn)變過程中的作用及機(jī)制研究。參照既往藥物干預(yù)AKI-CKD轉(zhuǎn)變的相關(guān)研究［16］，本研究發(fā)現(xiàn)IRI組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)分子GRP78和CHOP表達(dá)較Sham組明顯升高，提示AKICKD進(jìn)展過程中，ERS參與腎臟纖維化損傷的過程，與SHU等［17］研究結(jié)果一致。此外，本研究結(jié)果顯示槐耳治療顯著減少了細(xì)胞凋亡，保護(hù)了IRI誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞，推測(cè)這種保護(hù)作用是通過抑制ERS和凋亡介導(dǎo)的。FANG等［18］發(fā)現(xiàn)槐耳通過減少順鉑誘導(dǎo)的腎臟損傷和凋亡來改善腎功能，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，槐耳能夠改善AKI后腎纖維化小鼠腎功能，延緩腎損傷及腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程，其機(jī)制可能是通過抑制ERS和凋亡實(shí)現(xiàn)的。槐耳不良反應(yīng)小，對(duì)腎臟有著強(qiáng)大的保護(hù)作用，它在AKI-CKD轉(zhuǎn)變過程中的其他作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究探索，以便為腎纖維化的治療提供新的思路。