秦龍燕, 羅英亮, 劉俊, 李培霆, 蒙富雪， 曾家順, 李龍*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 風濕免疫科， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 醫(yī)學(xué)實驗中心， 貴州 都勻 558000)

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以外周多關(guān)節(jié)受累為主的、對稱性、侵襲性、持續(xù)進展性炎癥為特征的自身免疫性疾病，患者逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨及骨的破壞、導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能喪失，致殘率高[1-2]，所以早發(fā)現(xiàn)、早診斷及早治療顯得尤為重要。研究表明類風濕因子(rheumatoid factor，RF)與抗環(huán)瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)抗體對RA診斷敏感度和特異度較高，已被臨床廣泛應(yīng)用[3-4]。但是早期RA首發(fā)癥狀可以僅僅是單純關(guān)節(jié)炎，但血清RF和抗CCP抗體沒有改變，因此漏診及誤診率較高[5]。程序性死亡受體1(programmed cell death-1，PD-1)及其程序性死亡配體1(programmed cell death-1 ligand 1，PD-L1)是新近發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白B7/分化抗原28(cluster of differentiation 28，CD28)家族成員，其可溶性形式[可溶性PD-1(soluble PD-1，sPD-1)]可通過與細胞膜表面PD-L1特異性結(jié)合后阻斷PD-1/PD-L1通路負性信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致T細胞活性增強，引起免疫調(diào)控失衡，從而導(dǎo)致RA[6]?？扇苄猿绦蛐运劳雠潴w1(soluble programmed cell death-1 ligand 1，sPD-L1)可與細胞表面的PD-1結(jié)合，產(chǎn)生負性信號，抑制T細胞活化增殖[7]。sPD-1、sPD-L1作為負性協(xié)同信號分子，可以引起T細胞激活和擴增、引起機體免疫紊亂導(dǎo)致RA[8]。有研究表明，sPD-1、sPD-L1在RA患者血清中升高[9]，但是其升高對RA的診斷價值及與疾病活動程度是否相關(guān)尚未有報道。為了提高RA診斷率，本研究探討了sPD-1、sPD-L1在診斷RA方面的價值及與疾病活動度的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果匯報如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018年12月—2019年12月RA患者100例，RA診斷符合2010年美國類風濕學(xué)會(American College of Rheumatology，ACR)/歐洲抗風濕聯(lián)盟(The European League Against Rheumatism，EULAR)標準[3]，排除系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合癥及重癥肌無力等其他自身免疫性疾病，排除并發(fā)感染、惡性腫瘤、心腦血管疾病等其他系統(tǒng)疾病或全身衰竭者及其他可能影響生存質(zhì)量的疾病的患者。根據(jù)RA疾病活動評分(disease activity score 28-3，DAS28-3)[10]將100例RA患者分為緩解期組(n=50，DAS28-3<2.6分)和活動期組(n=50，DAS28-3≥2.6分)，緩解期組RA患者男16例、女34例，年齡28～64歲、平均(48.2±8.4)歲；活動期組組RA患者男14例、女36例，年齡27～91歲、平均(53.4±13.7)歲。同時選取體檢中心健康體檢者50例作為正常對照組，男17例、女33例，年齡24～84歲、平均(49.4±18.7)歲。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準(2018H001)及被檢者知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1血樣采集 分別采集2組RA患者入院次日、正常對照組受檢者體檢當日空腹外周靜脈血各8 mL，取2 mL注入EDTA抗凝管、2 mL注入枸櫞酸鈉抗凝血沉管及4 mL注入分離膠促凝管中，將促凝管中樣本以3 000 r/min離心20 min，收集血清1～2 mL。

1.2.2酶聯(lián)免疫法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清sPD-1及sPD-L1表達 使用sPD-1和sPD-L1酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海江萊)，設(shè)置標準品孔和樣本孔及空白孔，取標準品50 μL依次加入微孔，樣本孔中加待測樣本50 μL，空白孔加樣本稀釋液50 μL；空白孔、標準品孔和樣本孔中加辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的檢測抗體100 μL/孔，封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫箱(上海助藍)溫育60 min；自動洗板機(山東博科)洗板，加洗滌液350 μL/孔，靜置1 min，重復(fù)洗板5次；先加底物A(含過氧化氫) 50 μL/孔，再加底物B(含3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine,TMB )50 μL/孔 ，37 ℃避光孵育15 min；加終止液50 μL/孔終止反應(yīng)，30 min內(nèi)進行比色，以空白孔調(diào)零，酶標儀(北京天石)450 nm 波長依序測量各孔的吸光度(optical delnsity，OD)。

1.2.3全自動血液細胞分析儀(深圳邁瑞)檢測白細胞(white blood cell，WBC) 將3組受試者全血試管放入儀器，計數(shù)界面選擇自動全血模式進行WBC計數(shù)。

1.2.4全自動血沉分析儀(意大利Diedde,Ves-matic 20)檢測血沉(erythrocyte sedimentation rate，ESR) 3組受試者采血后將血沉管中全血上下顛倒混勻7～10次,使枸櫞酸鈉抗凝劑與血液充分混勻，將血沉管放入儀器中測得血沉值。

1.2.5全自動生化分析儀(美國貝克曼庫爾特，AU5800)檢測類風濕因子(rheumatoid factor，RF)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)、血清肌酐(serum creatinine，SCr)、C反應(yīng)蛋白(c-reactive protein，CRP) 將3組受試者血清樣本放入儀器中，選擇免疫散射比濁法測定RF，采用速率法檢測ALT、AST及SCr，采用比濁沉淀法檢測CRP。

1.2.6全自動電化學(xué)發(fā)光分析儀(德國羅氏，e601型)檢測血清抗環(huán)瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)抗體 采用電化學(xué)發(fā)光法檢測3組受試者血清CCP抗體。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般資料分析

結(jié)果顯示，正常對照組、緩解期組及活動期組受試者的性別、年齡、WBC、ALT、AST及SCr等指標比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組受檢者一般資料Tab.1 General information of all groups

2.2 血清sPD-1和sPD-L1水平

結(jié)果顯示，活動期組受試者血清sPD-1水平分別高于緩解期組和正常對照組，且緩解期組受試者高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；3組受試者血清sPD-L1水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組受檢者血清sPD-1和sPD-L1水平[M(P25～P75)]Tab.2 Levels of serum sPD-1 and sPD-L1 in all groups[M(P25～P75)]

2.3 RA患者血清sPD-1與ESR、CRP、DAS28-3的相關(guān)性

散點圖結(jié)果顯示，RA患者血清sPD-1與ESR、CRP、DAS28-3呈線性關(guān)系；Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，RA患者血清sPD-1與ESR(r=0.743，P<0.001)、CRP(r=0.672，P<0.001)、DAS28-3評分(r=0.946，P<0.001)均呈正相關(guān)。見圖1。

圖1 RA患者血清sPD-1與ESR、CRP、DAS28-3的相關(guān)性Fig.1 Correlation between sPD-1 and ESR, CRP, DAS28-3 in RA patients

2.4 RA患者血清sPD-L1與ESR、CRP、DAS28-3的相關(guān)性

散點圖結(jié)果顯示，RA患者血清sPD-L1與ESR、CRP、DAS28-3無線性相關(guān)。見圖2。

圖2 RA患者血清sPD-L1與血沉ESR、CRP、DAS28-3的相關(guān)性Fig.2 Correlation between sPD-L1 and ESR, CRP, DAS28-3 in RA patients

2.5 抗CCP抗體、RF及sPD-1對RA的診斷價值

ROC曲線結(jié)果顯示，抗CCP抗體、RF及sPD-1對RA診斷價值以sPD-1的AUC最大，即診斷價值最優(yōu)，最佳截斷值為305.56 μg/L；RF、sPD-1分別與抗CCP抗體的AUC比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見表3和圖3。

圖3 抗 CCP 抗體、RF及sPD-1診斷RA的ROC曲線Fig.3 ROC curve of anti-CCP antibody, RF, and sPD-1 in the diagnosis of RA

表3 抗CCP抗體、RF、sPD-1對RA的診斷價值Tab.3 Analysis of the diagnostic value of anti-CCP antibodies, RF, sPD-1 for RA

2.6 抗CCP抗體、RF及sPD-1對RA病情活動度的預(yù)測價值

ROC曲線結(jié)果顯示，抗CCP抗體、RF及sPD-1預(yù)測RA病情活動度的AUC分別為0.952、0.854及0.974，其中sPD-1對RA疾病活動度預(yù)測價值最大，最佳截斷值為370.75 μg/L；抗CCP抗體、sPD-1分別與RF的AUC比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4和圖4。

圖4 抗CCP抗體、RF及sPD-1預(yù)測RA病情活動度的ROC曲線Fig.4 ROC curve of anti-CCP antibody, RF, and sPD-1 on predicting RA disease activity

表4 抗CCP抗體、RF、sPD-1對RA病情活動度的預(yù)測價值Tab.4 Predictive value of anti-CCP antibodies, RF, and sPD-1 on RA disease activity

3 討論

RA是一種慢性自身免疫性疾病，全球患病率為0.18%～1.07%，我國患病率為0.4%，是我國最為常見的風濕病之一[11-12]。RA不僅侵犯外周關(guān)節(jié)最終使關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞、畸形及功能喪失，而且也可導(dǎo)致心肺、神經(jīng)及血液系統(tǒng)等組織器官受累[13-15]。目前，診斷RA是結(jié)合臨床表現(xiàn)、類風濕因子、抗CCP抗體及影像學(xué)等多項指標綜合判斷[16]。磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)可以觀察到早期的RA關(guān)節(jié)改變，但由于MRI成本較高、常規(guī)使用受到限制，成本相對較低的血清學(xué)檢測因此得到廣泛應(yīng)用[17]。RF、抗CCP抗體雖然有助于RA的診斷，但臨床上往往存在很多RF及抗CCP抗體陰性但明確診斷為RA的患者，且二者對RA疾病活動度沒有很好的判斷作用，觀察病情活動還需要結(jié)合28個關(guān)節(jié)疼痛、腫脹情況及血沉等指標計算疾病活動評分(disease activity score 28，DAS28)作為評估指標，過程較為復(fù)雜[10]。所以尋找新的、可靠的實驗室檢測指標來補充RA血清學(xué)診斷很有必要。因此本研究旨在探討血清sPD-1、sPD-L1水平是否可作為RA的輔助診斷指標以及其與RA疾病活動度的相關(guān)性。

負性協(xié)同信號分子可以抑制細胞的活化和增殖，sPD-1、sPD-L1作為天然存在的膜型PD-1/PD-L1的調(diào)節(jié)因子，可參與調(diào)節(jié)機體病理、生理狀態(tài)下的復(fù)雜免疫反應(yīng)[18-20]。有研究證實，sPD-1、sPD-L1是反映RA疾病活性的有用標志物[21]。先前的一些研究表明，RA患者的血清sPD-1表達水平升高可能與患者腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平增加相關(guān)，且sPD-1作為PD-1的可溶性形態(tài)，被認為是PD-1/PD-L1通路的拮抗劑，可以功能性阻斷并抑制膜結(jié)合的PD1對T細胞活化的免疫調(diào)節(jié)作用，減弱PD-1途徑，并通過限制T細胞受體的誘導(dǎo)，抑制PD-1的活化從而導(dǎo)致疾病惡化[9,22]。本研究中RA患者血清sPD-1比正常對照組升高(P<0.05)，說明血清sPD-1在RA患病機制中起到了一定的作用，可能是幫助RA疾病診斷的指標或免疫治療的生物標志物及靶點。此外，活動期組RA患者血清sPD-1水平高于緩解期組(P<0.05)，提示其可能與病情的活動、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸有關(guān)；同時其與ESR、CRP、DAS28-3評分等RA病情活動相關(guān)指標均呈正相關(guān)，表明血清sPD-1對RA患者的疾病活動程度有一定的預(yù)測價值，進一步提示了sPD-1可作為預(yù)測疾病發(fā)展的參考指標。另一方面，有研究表明：sPD-1、sPD-L1是一對作用相反的調(diào)節(jié)因子，可通過動態(tài)平衡參與機體免疫調(diào)控[23]。嚴琦[24]研究發(fā)現(xiàn)sPD-L1可與膜型sPD-1結(jié)合，使細胞周期停留在G0/G1期，產(chǎn)生負性信號，抑制細胞增殖活化。本研究中，3組受試者血清sPD-L1水平無差異，且sPD-L1與ESR、CRP、DAS28-3評分均無相關(guān)性，這與嚴琦[24]研究結(jié)果一致，但與Yanxia等[9]結(jié)果不一致，可能是RA患者血清sPD-L1的低水平表達不足以激活PD-1/PD-L1抑制信號通路，使T細胞過度活化、細胞因子產(chǎn)生，自我耐受破壞，最終致免疫疾病的發(fā)生；也可能是與研究樣本量較小有關(guān)。

目前大部分實驗室對抗CCP抗體、RF應(yīng)用較多，這2個指標被廣泛應(yīng)用于RA的診斷，且有明確的診斷界值[25]。然而仍有部分早期患病人群和疑診患者抗CCP抗體和RF均為陰性，根據(jù)本研究結(jié)果推測，sPD-1的檢測可以補充RA血清學(xué)診斷學(xué)的不足。通過對RA病例的血清sPD-1水平分析，證實了sPD-1在疾病診斷中的應(yīng)用價值。ROC曲線結(jié)果表明，sPD-1的AUC高于抗CCP抗體及RF，對RA診斷價值最優(yōu)，且當血清sPD-1>305.56 μg/L時，患者發(fā)生RA的可能性較高，這個結(jié)果為臨床醫(yī)生提供一個新的參考指標。因此再進一步探測sPD-1與疾病活動度的預(yù)測價值，本研究結(jié)果顯示抗CCP抗體、RF、sPD-1預(yù)測RA病情活動程度時，sPD-1預(yù)測RA病情活動程度時AUC最大，表明sPD-1對評估RA患者病情緩解或是活動的預(yù)測價值優(yōu)于抗CCP抗體及RF，同時ROC曲線顯示，當sPD-1>370.75 μg/L,時，疾病活動的可能性較大，可讓臨床醫(yī)生為患者制定合理化治療方案提供依據(jù)。

本研究表明，抗CCP抗體、RF、sPD-1診斷RA的ROC曲線對比時，RF與sPD-1的AUC比較、差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但是sPD-1的特異度高于RF，綜合來說sPD-1診斷價值效果可能優(yōu)于RF；當sPD-1用于預(yù)測疾病活動程度時，抗CCP抗體與sPD-1的AUC比較、差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，考慮到sPD-1的AUC最大，且sPD-1、抗CCP抗體的靈敏度和特異度差異不大，由此推測檢測血清sPD-1用于預(yù)測疾病活動程度是可行的。故綜合診斷和疾病活動度兩個方面考慮，檢測血清sPD-1幫助診斷RA與預(yù)測疾病活動程度的綜合價值優(yōu)于抗CCP抗體及RF。但本研究樣本量有限，未來還需要做進一步研究來驗證這一發(fā)現(xiàn)，也需要一個特定的臨界值幫助決定治療方案，這有助于早期血清抗CCP抗體及RF陰性的患者發(fā)現(xiàn)并評估病情。

綜上所述，血清sPD-1水平在RA患者中升高，且與疾病活動指標相關(guān)，在診斷及預(yù)測RA疾病活動度時有一定的價值。因此，sPD-1可作為一種新的RA血清學(xué)輔助診斷指標及預(yù)測病情活動的評估指標，從而為臨床醫(yī)生決定是否對早期血清學(xué)陰性的RA患者進行抗風濕治療提供幫助，但血清sPD-L1能否作為評估RA患者病情變化的指標有待于進一步研究。