魏艷玲， 黃景利, 李志強(qiáng)， 閆雪花， 張林西， 趙汗青

(1.河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院 病理科, 河北 張家口 075100; 2.內(nèi)蒙古赤峰市婦產(chǎn)醫(yī)院 病理科, 內(nèi)蒙古 赤峰 024000; 3.河北北方學(xué)院 病理教研室， 河北 張家口 075000)

妊娠期高血壓主要表現(xiàn)高血壓、蛋白尿及浮腫等臨床癥狀，嚴(yán)重威脅孕婦和胎兒的健康[1]。研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期高血壓主要引起胎盤組織缺血、缺氧，導(dǎo)致機(jī)體的炎癥和血管內(nèi)皮功能障[2]。胎盤可溶性血管內(nèi)皮生長因子-1(soluble fms-like tyrosine kinase-1，sFIt-1)、胎盤生長因子(placental growth factor，PLGF)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是影響胎盤血管形成的關(guān)鍵蛋白[3-4]。杞菊地黃丸方是由菊花、山茱萸、山藥、澤瀉、茯苓、熟地黃、枸杞和丹皮組成的復(fù)方制劑[5]，研究表明，杞菊地黃丸方能夠有效降低血壓、改善患者胰島素抵抗，增加機(jī)體免疫功能[6]。在妊娠期高血壓患者中，相對(duì)于常規(guī)治療組，合并添加杞菊地黃丸方治療組能夠有效降低患者血壓并改善患者腎功能[7]，但是有關(guān)杞菊地黃丸方對(duì)妊娠期高血壓患者的的分子機(jī)制尚不完全清楚[8]。因此，本研究通過構(gòu)建妊娠高血壓大鼠，探究杞菊地黃丸方對(duì)妊娠高血壓大鼠胎盤血管形成的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購買于中國科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所[許可證號(hào)SCXK(京)2019-0010]，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲水，晝夜交替光照，溫度維持在20～25 ℃，相對(duì)濕度60%～70%。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 注射用亞硝基左旋精氨酸甲酯(N’-Nitro-L-arginine-methyl ester hydrochloride，L-NAME)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(廣州銳博公司)，杞菊地黃丸方配方制劑(廣東一方制藥有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒(江蘇碧云天公司)，sFIt-1一抗(美國Abcam公司)，PlGF一抗(美國Cell Signaling Technology公司)，VEGF一抗(武漢博士德公司)，HRP標(biāo)記的鼠二抗、兔二抗(江蘇碧云天公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國MD SpectraMax M3)，PCR儀器(賽默飛世爾科技公司)，顯影儀(賽默飛世爾科技公司)；一抗和二抗稀釋液(江蘇碧云天公司)。

1.2 研究方法

1.2.1動(dòng)物造模 制備受孕大鼠：將實(shí)驗(yàn)SD大鼠按照雌雄比例為1 ∶2合籠，于第2 天檢查雌性SD大鼠陰道栓明確為孕鼠，若不能明確則采用陰道涂片顯微鏡下觀察是否有精子，判定雌性SD大鼠是否妊娠。妊娠期高血壓大鼠模型建立：將受孕SD雌性大鼠隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組、模型組及杞菊地黃丸方藥物干預(yù)組(杞菊地黃丸方組)，每組各10只，模型組和杞菊地黃丸方組大鼠于受孕第13天時(shí)皮下注射L-NAME[125 mg(/kg·d)]，1次/d，共3 d]，構(gòu)建妊娠高血壓模型；對(duì)照組皮下注射等量的生理鹽水。3組大鼠于受孕第10、15 及19 天時(shí)測量血壓并進(jìn)行24 h尿蛋白檢測，第15 天大鼠血壓較之前升高>20 mmHg、且尿蛋白陽性則表明造模成功。

1.2.2藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)及標(biāo)本 造模成功后杞菊地黃丸方組大鼠于第16～20天進(jìn)行杞菊地黃丸方灌胃處理，杞菊地黃丸方配方組成：熟地黃24 g、茯苓9 g、枸杞9 g、山藥12 g、菊花9 g、澤瀉9 g、丹皮9 g、山茱萸12 g，加熱煮沸、充分溶解，每付藥均統(tǒng)一配置為168 mL。最后按照人與大鼠體積表面面積56 ∶1進(jìn)行給藥處理，灌胃劑量5 mL/d、2次/d，給藥5 d。于第21天時(shí)采用戊巴比妥鈉(10 g/L)腹腔麻醉孕鼠，并行剖宮產(chǎn)術(shù)，取出子宮和胎盤，將胎盤采用生理鹽水沖洗干凈后放置液氮罐內(nèi)保存，備用。

1.2.3sFIt-1、PLGF及VEGFmRNA表達(dá)水平 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，Trizol裂解法提取大鼠胎盤組織RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA，以cDNA為模板，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測3組大鼠sFIt-1、PLGF及VEGFmRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)引物均有廣州銳博公司設(shè)計(jì)合成反應(yīng)體系和條件參考文獻(xiàn)[3-4]。

1.2.4sFIt-1、PlGF及VEGF 蛋白表達(dá)水平 采用蛋白質(zhì)免疫印跡(Wstern blot)法取大鼠胎盤組織剪碎，并使用PBS潤洗1～2次，離心得組織沉淀物，加細(xì)胞組織裂解液(1 ∶5)冰上裂解1 h；高速離心機(jī)4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集胎盤組織上清液，采用BCA法蛋白質(zhì)濃度定量檢測；進(jìn)行凝膠電泳(80 V、30 min后轉(zhuǎn)為120 V)60 min(此時(shí)溴酚藍(lán)指示電泳至凝膠最底層)，取出進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，依據(jù)蛋白質(zhì)指示marker和目的蛋白分子量大小進(jìn)行切膠，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜時(shí)長約為2 h；采用5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，孵育對(duì)應(yīng)一抗sFIt-1(1 ∶1 000)，PlGF(1 ∶1 000)和VEGF(1 ∶1 000)4 ℃過夜；按照1 ∶5 000稀釋比例，室溫條件下孵育對(duì)應(yīng)的二抗約1 h；搖床搖晃加入TPBS洗滌3次，5 min/次，加入顯影液，顯影并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 杞菊地黃丸方對(duì)妊娠期大鼠血壓影響

結(jié)果顯示，妊娠第10 天時(shí)，3組大鼠收縮壓、舒張壓比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；妊娠第15 天時(shí)，模型組和杞菊地黃丸方組大鼠收縮壓、舒張壓均較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)；妊娠第19天時(shí)，杞菊地黃丸方組大鼠收縮壓、舒張壓均較模型組降低(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 各組妊娠期大鼠不同時(shí)點(diǎn)的血壓變化Tab.1 Changes of blood pressure of pregnant rats in each

2.2 杞菊地黃丸方對(duì)妊娠期大鼠24 h尿蛋白的影響

結(jié)果顯示，妊娠娠第10 天時(shí)，3組大鼠24 h尿蛋白含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；妊娠第15 天時(shí)，模型組和杞菊地黃丸方組大鼠24 h尿蛋白含量均較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)；妊娠第19天時(shí)，杞菊地黃丸方組大鼠24 h尿蛋白含量較模型組降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組妊娠期大鼠不同時(shí)點(diǎn)的24 h尿蛋白含量變化Tab.2 Comparison of 24 h urinary protein content of rats in each

2.3 杞菊地黃丸方對(duì)妊娠期大鼠sFIt-1、PLGF及VEGF mRNA表達(dá)水平的影響

結(jié)果顯示，妊娠第21天時(shí)，與對(duì)照組比較，模型組大鼠胎盤組織sFIt-1 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，PLGF和VEGFmRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，杞菊地黃丸方組大鼠胎盤組織sFIt-1 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，PLGF和VEGFmRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。見表3。

表3 各組妊娠期大鼠胎盤組織sFIt-1、PLGF和VEGF mRNA表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of sFIt-1, PLGF, and VEGF mRNA in placental tissue of rats in each

2.4 杞菊地黃丸方對(duì)妊娠期大鼠sFIt-1、PLGF和VEGF蛋白表達(dá)水平的影響

結(jié)果顯示，妊娠第21天時(shí)，與對(duì)照組比較，模型組大鼠胎盤組織sFIt-1蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，PLGF和VEGF蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，杞菊地黃丸方組大鼠大鼠胎盤組織sFIt-1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)，PLGF和VEGF蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。見表4和圖1。

圖1 各組大鼠胎盤組織sFIt-1、PLGF和VEGF蛋白表達(dá)Fig.1 Expression of sFIt-1, PLGF, and VEGF in placenta of rats in each group

表4 各組大鼠胎盤組織sFIt-1、PLGF和VEGF蛋白表達(dá)水平Tab.4 Expression level of sFIt-1, PLGF, and VEGF in placenta of rats in each group

3 討論

杞菊地黃丸方最初出自《醫(yī)級(jí)寶鑒》，原方為丸劑，多用于治療肝腎精血不足；該方包含多味中藥，具有多種功效，其中枸杞子具有甘平滋補(bǔ)肝腎精血，山藥補(bǔ)益脾陰而固精，熟地黃滋腎補(bǔ)精，山茱萸溫養(yǎng)肝腎精血，茯苓味淡平滲脾濕，菊花味苦微寒清膽明目，澤瀉甘寒泄腎濕濁，牡丹皮辛苦涼泄肝火[9-10]。張兆康等[11]研究證實(shí)杞菊地黃顆粒能夠抑制慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，從而改善大鼠視網(wǎng)膜病變。孫俊雄[12]研究發(fā)現(xiàn)杞菊地黃丸方聯(lián)合拉貝洛爾片能夠有效降低妊娠期高血壓孕婦血壓。因此，本研究初步通過構(gòu)建妊娠期高血壓大鼠探究杞菊地黃丸方對(duì)其血壓和24 h尿蛋白的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血壓在第15 天和19 天時(shí)升高，同時(shí)伴隨24 h尿蛋白含量增加。與模型組比較，給予杞菊地黃丸方藥物干預(yù)能夠有效降低大鼠血壓以及24 h尿蛋白含量。提示杞菊地黃丸方對(duì)妊娠期高血壓大鼠具有一定的治療效果。

內(nèi)皮細(xì)胞的功能異常是多種血管并發(fā)癥的病理學(xué)基礎(chǔ)。研究證實(shí)，妊娠期高血壓患者血管內(nèi)皮功能會(huì)發(fā)生明顯的病變，導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性血管舒張和收縮功能的異常[13]。sFIt-1是一種分泌型二聚體糖蛋白，屬于VEGF蛋白家族成員之一。其與內(nèi)皮細(xì)胞表面受體FIT-1結(jié)合能夠有效抑制VEGF信號(hào)相關(guān)通路，導(dǎo)致血管生成障礙并影響血管的通透性和完整性[14]。sFIt-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞、胎盤滋養(yǎng)層及平滑肌等多種細(xì)胞中高表達(dá)；能夠抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和分化。sFIt-1水平升高會(huì)導(dǎo)致血管生成異常，促使滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲不足，最終引起胎盤氧化應(yīng)激，進(jìn)一步促使sFIt-1分泌增加，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，誘導(dǎo)妊娠期高血壓形成[15-16]。PLGF同樣是血管內(nèi)皮生長因子家族蛋白成員之一，與受體結(jié)合能夠激活受體自我磷酸化，并通過相應(yīng)的酪氨酸蛋白激酶途徑將信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞漿，發(fā)揮特有的生物學(xué)效應(yīng)[17-18]。研究表明，PLGF能夠誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞生長[19]。另外，PLGF還可以刺激早期妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞增殖。在妊娠期高血壓疾病患者中，PLGF的表達(dá)顯著降低，其機(jī)制可能與胎盤著床深淺相關(guān)[20]。滋養(yǎng)層細(xì)胞受損和母體血管轉(zhuǎn)換異常是導(dǎo)致胎盤血管生成減少的主要因素，其可引發(fā)胎盤缺氧、滋養(yǎng)層細(xì)胞功能異常以及內(nèi)皮細(xì)胞增殖障礙等與妊娠期高血壓疾病的發(fā)生在發(fā)展密切相關(guān)[21-22]。以往研究均表明sFIt-1、PLGF和VEGF在妊娠期高血壓疾病患者中發(fā)揮重要作用。本研究通過妊娠大鼠第16～20天灌胃杞菊地黃丸方，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組大鼠比較，模型組大鼠胎盤組織sFIt-1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高，PLGF和VEGF mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低。與模型組大鼠比較，杞菊地黃丸方組大鼠胎盤組織sFIt-1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，PLGF和VEGF mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高。以上研究結(jié)果初步證實(shí)杞菊地黃丸方可能通過影響sFIt-1/PLGF水平及胎盤血管生成改善妊娠期高血壓大鼠血管病變。

綜上所述，本研究明確了杞菊地黃丸方對(duì)妊娠期高血壓大鼠的治療效果，其作用機(jī)制可能涉及sFIt-1/PLGF水平和胎盤血管生成。但是本研究也存在一定的局限性，未對(duì)杞菊地黃丸方不同給藥劑量進(jìn)行研究。因此，在后續(xù)研究中將分析不同給藥劑量的藥理學(xué)作用，進(jìn)而為臨床杞菊地黃丸方治療妊娠期高血壓提供有效劑量參考。