杜洪， 夏英， 金泳， 韋四喜,， 夏萬松， 李紅羽， 袁婷， 黃海*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床檢驗中心， 貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院， 貴州 貴陽 550004； 3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 檢驗科， 貴州 貴陽 550001)

胃癌(gastric cancer, GC)是全球高發(fā)腫瘤之一，2020年全球癌癥統(tǒng)計報告顯示GC發(fā)病率為5.6%、排第5位，死亡率為7.7%、排第4位[1]。我國GC發(fā)病率居亞洲首位，也是我國僅次肺癌的第2大高發(fā)腫瘤[2-4]。GC的侵襲和遷移往往伴隨著患者病情的惡化，同時也是GC患者生存率低、預(yù)后較差的主要原因之一[5-6]。因此，尋找介導(dǎo)GC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，并確定其作為新的預(yù)后生物標志物或治療靶點成為當務(wù)之急。α肌動蛋白4(actinin alpha 4，ACTN4)定位于人染色19q13.2，基因跨度38647649～38731589，可通過與絲狀肌動蛋白(actin-filament，F(xiàn)-actin)相互作用從而維持細胞骨架的完整性并調(diào)控細胞運動[7]。有研究報道，ACTN4與肺癌、乳腺癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8-13]，認為ACTN4可通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化而促進GC細胞的轉(zhuǎn)移，有促癌作用[14]，但機制尚不清楚。因此，本研究通過生物信息學(xué)分析GC中ACTN4基因的表達和意義，并對ACTN4進行GC細胞系及組織驗證，檢測ACTN4敲低對GC細胞遷移的影響，為研究ACTN4在GC發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移中的作用和機制提供線索，現(xiàn)將結(jié)果匯報如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞系和組織來源 GC細胞系A(chǔ)GS、MKN45、HGC-27、MGC803及正常胃黏膜細胞系GES-1購自中國科學(xué)院細胞庫，293T細胞由上海交通大學(xué)金衛(wèi)林教授實驗室惠贈。選取胃腸外科手術(shù)20例GC患者GC組織，同時取相鄰癌組織間隔5 cm以上癌旁組織作為對照；患者男13例、女7例，年齡38～85歲、平均(61.15±13.43)歲；組織標本均有唯一識別標記，留存于液氮中；本研究獲得醫(yī)院倫理道德委員會授權(quán)批準(2020倫審第106號)。

1.1.2主要試劑和儀器 UNlQ-10 柱式Trizol總RNA抽提試劑盒(上海生工生物)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒和TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus,日本Takara)，聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒和高效蛋白裂解液(radio immunoprecipitation assay，RIPA；北京索萊寶)，慢病毒包裝質(zhì)粒(中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院贈予)；LightCycler480熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀(瑞士羅氏)，凝膠成像分析儀(美國BIO-RAD)，臺式冷凍離心機和普通PCR儀(美國Thermo Fisher)，倒置顯微鏡(日本NIKON)。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養(yǎng) GC細胞系A(chǔ)GS、MKN45、HGC-27、MGC-803及正常胃黏膜細胞系GES-1細胞系生長于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，293T生長于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素抗生素的DMEM培養(yǎng)基中，細胞系置于含5%CO2、37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2生物信息學(xué)分析 亞拉巴馬大學(xué)癌癥數(shù)據(jù)庫(university of alabama cancer database，UALCAN)網(wǎng)站[15]分析癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫ACTN4相關(guān)基因的差異表達，同時數(shù)據(jù)庫分析ACTN4與GC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分期之間的相關(guān)性。

1.2.3RNA的提取及定量PCR UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取細胞和組織總RNA，并使用Nanodrop 2000進行定量及純度測定，所提取RNA保存于-80 ℃。cDNA第一鏈合成用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，保存于-20 ℃。TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)用于定量分析，熒光定量PCR儀反應(yīng)擴增，以HPRT基因為內(nèi)參，ACTN4基因擴增引物為ACTN4-F:5′-TGGAGGTCATATCAGGGGAGC-3′，ACTN4-R:5′-GAGACCAGCTTGACGCCTTT-3′， 采用熒光定量PCR技術(shù)(real-time quantitative PCR，qRT-PCR) 檢測正常胃黏膜細胞系GES-1，GC細胞系A(chǔ)GS、MKN45、HGC-27、MGC803及20對GC組織和癌旁組織中ACTN4基因的表達量。

1.2.4ACTN4慢病毒敲低模型的構(gòu)建 將公司合成的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)質(zhì)粒、慢病毒包裝質(zhì)粒進行擴增。準備293T細胞，包病毒前1天更換新鮮無雙抗的培養(yǎng)基，配制轉(zhuǎn)染體系：opti-MEM 1.2 mL中加目的基因的質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒摩爾比為1 ∶1，psPAS2 ∶Pmd2.G ∶shRNA plasmid為2(10 μg) ∶1(5 μg) ∶2(10 μg)制備質(zhì)粒混合液，opti 1.2 mL中按1 ∶6 的比例加PEI 150 μL，靜置20 min。將上述混合液加無抗培養(yǎng)基5 mL，6～8 h后換液，加培養(yǎng)基10 mL；于轉(zhuǎn)染24、36、48及72 h各收1次病毒，0.45 μm濾頭過濾；GC AGS細胞鋪6孔板密度為60%～80%，設(shè)置非感染組和感染組，非感染組細胞加polybrene 2 μL、感染組細胞加病毒和polybrene 2 μL，24 h換液，細胞篩選、培養(yǎng)24 h，更換新鮮培養(yǎng)基，36 h加嘌呤霉素篩選；非感染組細胞全部被嘌呤霉素殺死則判斷慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建成功。

1.2.5劃痕實驗 先用marker筆于6孔板背后做好標記，細胞按5×105個/孔接種使其均勻分布，5%CO2、37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)24 h，待細胞長滿后用10 μL槍頭垂直于直尺，于6孔板孔內(nèi)劃2條垂直相交劃痕；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗細胞3次，去除懸浮細胞，加入含有1%血清培養(yǎng)基；置于5%CO2、37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于0、24及36 h采用倒置顯微鏡觀察、拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析

課題組前期通過TCGA數(shù)據(jù)庫進行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)ACTN4在GC中高表達，ACTN4高表達與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分期相關(guān)；同時Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析顯示ACTN4增高提示患者預(yù)后不良(P<0.05)，綜合分析提示在GC中腫瘤細胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期與ACTN4表達相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 ACTN4 mRNA和蛋白的表達

結(jié)果顯示，AGS細胞系中ACTN4 mRNA的表達量明顯高于GES-1細胞系，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；與GES-1細胞系相比，AGS細胞系中ACTN4蛋白表達量上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；qRT-PCR檢測結(jié)果表明，20例GC組織中ACTN4 mRNA表達量較癌旁組織高表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 敲低ACTN4后對AGS細胞遷移的影響

運用shRNA慢病毒干擾技術(shù)構(gòu)建AGS細胞系A(chǔ)CTN4基因低表達細胞模型，Western blot檢測ACTN4蛋白表達，結(jié)果顯示sh-KD1組和sh-KD2組AGS細胞ACTN4蛋白表達水平分別低于sh-NC組(P<0.05)；劃痕實驗表明sh-KD1組和sh-KD2組AGS細胞24、36 h細胞劃痕愈合率均分別較sh-NC組降低(P<0.05或P<0.01)。

3 討論

ACTN4基因定位于染色體19q13.2，在腫瘤的轉(zhuǎn)移中扮演著重要的角色[16]，課題組前期通過對公共數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果顯示，ACTN4基因在GC中高表達。數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示ACTN4基因高表達與腫瘤組織的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，顯示其與GC細胞的轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，生物信息學(xué)分析結(jié)果與已報道文獻大致相符[16]。此外，通過對TCGA數(shù)據(jù)庫進行進一步生物信息學(xué)分析顯示ACTN4在腫瘤組織中的高表達與分期呈正相關(guān)，但是不同分期之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在生存預(yù)后分析中，結(jié)果顯示ACTN4高表達與預(yù)后呈負相關(guān)，表明ACTN4高表達可能提示患者預(yù)后不良。

注：A為TCGA數(shù)據(jù)庫中ACTN4在GC組織和正常組織中的表達，B為Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析中ACTN4基因與GC患者生存預(yù)后的關(guān)系，C、D為TCGA數(shù)據(jù)庫分析ACTN4表達與GC分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系；與正常組織或Normal組比較，(1)P<0.001，(2)P<0.05。圖1 ACTN4生物信息學(xué)分析Fig.1 Bioinformatics analysis of ACTN4

注：A、B分別為GC組織和GC細胞系中ACTN4 mRNA水平定量結(jié)果，C和D分別GC細胞系中ACTN4蛋白表達和定量結(jié)果；(1)與癌旁組織比較，P<0.05；與GES-1細胞比較，(2)P<0.001，(3)P<0.05。圖2 GC細胞系、GC組織及癌旁組織中ACTN4 mRNA和蛋白的表達Fig.2 Expression of ACTN4 mRNA and protein in gastric cancer cell lines and tissues

注：A、B分別為ACTN4蛋白表達和定量結(jié)果，C、D分別為細胞劃痕愈合面積和劃痕愈合率結(jié)果；與同時點sh-NC組比較，(1)P<0.01，(2)P<0.05。圖3 敲低ACTN4后對AGS細胞遷移的影響Fig.3 Effect of ACTN4 knockdown in migration of AGS cells

通過qRT-PCR對腫瘤GC細胞系和GC組織ACTN4 mRNA和蛋白表達情況進行檢測，結(jié)果佐證ACTN4在GC中表達失調(diào)，與生物信息學(xué)分析結(jié)果相契合。ACTN4基因的表達失調(diào)往往預(yù)示著一些腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生和病情的惡化，有研究顯示ACTN4參與腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)過程，進一步顯示其與腫瘤侵襲遷移的關(guān)系[14,17-20]。腫瘤細胞EMT過程能夠促進細胞的侵襲、遷移行為，而腫瘤細胞侵襲和遷移往往提示患者病情較重、預(yù)后較差。EMT是指細胞由上皮細胞向間質(zhì)細胞過渡的一個生物學(xué)行為和狀態(tài)，主要表現(xiàn)為細胞形態(tài)由上皮樣多邊形向間質(zhì)細胞樣長梭形過渡，細胞間粘附連接破壞，上皮標志物E鈣黏蛋白表達下調(diào)，間質(zhì)細胞標志物N鈣黏蛋白、波形蛋白及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子鋅指E-box結(jié)合同源框1、Snail等表達上調(diào)，且EMT主要報道由Wnt/β-catenin等信號通路參與調(diào)節(jié)，進而促進細胞變形運動[10,21-25]。因此腫瘤細胞EMT被認為是腫瘤重要的生物學(xué)行為，是癌細胞轉(zhuǎn)移的前置狀態(tài)。本研究體外敲低ACTN4基因構(gòu)建了AGS細胞系A(chǔ)CTN4敲低模型，并采用劃痕實驗對該模型遷移能力進行檢測，結(jié)果顯示敲低ACTN4后AGS細胞遷移能力減弱(P<0.05)。雖然研究中未檢測EMT相關(guān)指標的表達變化，但是在敲低ACTN4后細胞遷移能力減弱，變形運動能力減低則有力佐證了ACTN4促進GCAGS細胞的轉(zhuǎn)移。

結(jié)合生物信息學(xué)大數(shù)據(jù)預(yù)測結(jié)果分析表明，ACTN4在GC細胞系A(chǔ)GS中高表達，ACTN4高表達能夠促進AGS細胞系的遷移，與GC患者的生存預(yù)后呈負相關(guān)關(guān)系。本研究主要優(yōu)勢在于通過生物信息學(xué)分析預(yù)測，并結(jié)合組織和細胞模型驗證以及構(gòu)建慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系對GC中ACTN4基因的功能進行探索，但也存在一些不足，如未深入探索ACTN4的功能機制。