王蘋 趙明娟 崔鴻博

(北京市懷柔區(qū)動物疫病預防控制中心 101400）

1%雞紅細胞懸液是采用血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗檢測新城疫病毒、禽流感病毒、禽腺病毒Ⅲ群（減蛋綜合征病毒）、傳染性支氣管炎病毒等病原微生物血凝抑制抗體的重要試劑[1]，紅細胞的凝集狀態(tài)直接影響試驗結果的判定，不同條件下、不同濃度、不同保存方法都會影響試驗結果的準確性[2-4]。因此，準確配制及合理保存紅細胞懸液是保證試驗結果準確的一項重要環(huán)節(jié)。在基層實驗室，送檢的每份雞血清樣品一般需檢測新城疫、禽流感病毒H7亞型、禽流感病毒H5亞型（Re-11 株）、禽流感病毒H5亞型（Re-12 株）4 種抗體效價，每份水禽血清樣品也需檢測禽流感病毒H7亞型、禽流感病毒H5亞型（Re-11 株）、禽流感病毒H5亞型（Re-12 株）3種抗體效價。由于檢測種類多，檢測樣品數(shù)量大，不可能一天完成，但如果每次試驗都重新制備1%紅細胞懸液會增加工作量，因此，實驗室檢測人員一般都選擇一次制備足夠一批次檢測試驗所需量的1%紅細胞懸液，于4℃保存，分批次使用。筆者通過試驗觀察1%紅細胞懸液在4℃環(huán)境下保存時間對新城疫及禽流感血凝抑制試驗抗原效價的影響，確定了最佳保存時間，僅為廣大基層實驗室檢測人員提供參考。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗設計

采用自制1%雞紅細胞懸液，分別測定雞新城疫血凝抑制試驗抗原、禽流感病毒H7亞型血凝抑制試驗抗原、禽流感病毒H5亞型（Re-11 株）血凝抑制試驗抗原、禽流感病毒H5亞型（Re-12 株）血凝抑制試驗抗原4 種抗原效價，每種抗原每次試驗設4 個重復，分別記錄1%雞紅細胞懸液在4℃環(huán)境下保存1、2、3、4、5、6、7d 時測定的4 種抗原效價，每種抗原用PBS 稀釋后分裝成小份，于-20℃保存，每次試驗取一份檢測其效價。

1.2 試驗儀器設備

12 道多道移液器（5～50μl），單道移液器（5～50μl），一次性吸頭，冷藏柜（4℃）、微量振蕩器、90。一次性微量反應板、一次性加樣槽。

1.3 試驗試劑

新城疫血凝抑制試驗抗原（哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司，生產批號：20180824），禽流感病毒H7亞型血凝抑制試驗抗原（哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司，生產批號：2019006），禽流感病毒H5亞型（Re-11 株）血凝抑制試驗抗原（哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司，生產批號：2019006），禽流感病毒H5亞型（Re-12 株）血凝抑制試驗抗原（哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司，生產批號：2019006），1×PBS緩沖液 (pH7.2～7.4，0.01mol/L)（HyClone，產品有效期至：2020 年8 月），紅細胞保存液（Solarbio，生產批號：20190328），1%雞紅細胞懸液（自制）。

1.4 試驗方法

1.4.1 1%紅細胞懸液制備

（1）于50ml 潔凈的無菌帶蓋離心管中加入約7ml 阿氏液，用5mL 一次性無菌注射器從翅靜脈處采集3～10 周齡SPF 雞(最少兩只) 血約5ml，與阿氏液于離心管中輕輕混合均勻。

（2）加入3～4 倍體積的PBS 混勻，以1800r/min 離 心8min，棄上清液和沉淀紅細胞上層的白細胞薄膜，重復以上過程，反復洗滌3 次(洗凈血漿和白細胞)。

（3）最后吸取1 倍體積(ml) 的紅細胞，加入99 倍體積(ml) 的PBS，均勻混合，分裝于50ml 三角瓶中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 血凝（HA）試驗操作步驟

（1）取90。一次性微量反應板，用微量移液器在1～12 孔均加入0.025ml PBS，換吸頭。

（2）吸取0.025ml 病毒懸液加入第1 孔，吹打3～5 次充分混勻。

（3）從第1 孔吸取0.025ml 混勻后的病毒液加入第2 孔，混勻后吸取0.025ml 加入第3 孔，如此進行對倍稀釋至第11孔，從第11 孔吸取0.025ml 棄之，設第12 孔為PBS 對照。

（4）每孔再加入0.025ml PBS。

（5）每孔再加入0.025ml 體積分數(shù)為1%雞紅細胞懸液。

（6）震蕩均勻，在室溫20～25℃下靜置約40min，PBS 對照孔的紅細胞呈明顯的紐扣狀沉到孔底時判定結果。

（7）結果判定：將板傾斜，觀察紅細胞有無呈淚滴狀流淌。完全血凝（不流淌）的抗原或病毒最高稀釋倍數(shù)代表一個血凝單位（HAU）。

1.4.3 回歸試驗操作步驟[5]

（1）取90。一次性微量反應板，用微量移液器在1～4 孔均加入0.025ml PBS，換吸頭。

（2）吸取0.025ml 配制好的4HAU 病毒懸液加入第1 孔，吹打3～5 次充分混勻。

（3）從第1 孔吸取0.025ml 混勻后的病毒液加入第2 孔，混勻后吸取0.025ml 加入第3 孔，如此進行對倍稀釋至第4 孔，從第4 孔吸取0.025ml 棄之。

（4）每孔再加入0.025ml 體積分數(shù)為1%雞紅細胞懸液。

（5）輕輕均勻，在室溫20～25℃下靜置約40min 后觀察結果。

（6）結果判定：將板傾斜，觀察紅細胞有無呈淚滴狀流淌。第1 孔、第2 孔完全血凝（不流淌）則抗原配制正確，否則應重新測定抗原血凝效價。

2 試驗結果與分析

2.1 試驗結果

測定的效價分別用回歸試驗檢測，顯示結果準確，查看附表。

附表 1%紅細胞懸液在4℃保存1～7d 時血凝試驗檢測抗原效價結果

2.2 結果分析

試驗結果顯示，1%紅細胞懸液在4℃保存第6 天開始出現(xiàn)溶血，靜置后的上清液由無色透明狀出現(xiàn)淺粉紅色，測定各種血凝抑制試驗抗原的效價開始下降。因此，在開展血凝和血凝抑制試驗時，為保證試驗結果準確可靠，1%雞紅細胞懸液在4℃最多可保存5d，過期則不能使用。

3 討論

3.1 紅細胞懸液保存時間

由試驗結果可知，制備好的紅細胞懸液在4℃環(huán)境下保存5d 時，測得的抗原效價基本一致，不影響使用效果；第6 天抗原效價開始下降，說明紅細胞懸液開始溶血，濃度開始下降，不能繼續(xù)使用。

3.2 影響試驗結果的因素

血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗是新城疫和高致病性禽流感診斷技術之一[6,7]，4 單位病毒配制的準確性、抗原反復凍融次數(shù)、稀釋液pH、被檢血清狀態(tài)、1%紅細胞懸液配制方法、試驗耗材、儀器設備、環(huán)境溫度、檢測人員操作手法等因素都會對試驗結果造成影響[8]，因此，整個試驗的每個環(huán)節(jié)都應嚴格按照操作標準進行，盡量減少試驗誤差。

3.3 紅細胞懸液配制過程中的注意事項

采集的血液與阿氏液混合時應將血液沿離心管壁緩慢注入，不能直接垂直打入；在洗滌紅細胞過程中，離心機轉速不要超過2000r/min，每次混勻操作動作要輕，避免劇烈震蕩，否則易造成紅細胞的破裂，造成溶血。

3.4 紅細胞懸液保存注意事項

制備好的1%紅細胞懸液于4℃保存時，最好分裝成小份，每份僅供一次試驗使用，避免反復冷藏及回溫，減少紅細胞破裂，延長保存時間。