李 博，李改瑞，趙 偉，彭曉琳，*，趙 丹，彭 績

(1．深圳市南山區(qū)慢性病防治院腫瘤傷害與營養(yǎng)科，廣東 深圳518054；2．海南省疾病預(yù)防控制中心，海南 ?？?70203；3．深圳市慢性病防治中心腫瘤防治科，廣東 深圳518020)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是全球最常見的惡性腫瘤之一，雖然近年來其篩查手段已有了很大的進(jìn)步，但是我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率依然居高不下。結(jié)直腸癌具有患病率高、癌前病變(如息肉、腺瘤)界定明確，且發(fā)展到癌變需要較長(10～15年)時間等特點，這為在出現(xiàn)臨床癥狀之前的早期干預(yù)提供了極好的機(jī)會。目前結(jié)直腸鏡取材標(biāo)本的病理學(xué)檢查還是診斷結(jié)直腸癌的金標(biāo)準(zhǔn)，由于其成本高、并發(fā)癥發(fā)生率高和手術(shù)的侵入性，使受試者的依從性普遍較低。糞便隱血試驗因其成本較低，檢測方便、快捷，目前較廣泛地應(yīng)用于結(jié)直腸癌的早篩早診，然而，其明顯不足的是對癌前病變(如息肉和腺瘤)及早期結(jié)直腸癌的篩查靈敏度較低。針對糞便樣本開發(fā)結(jié)直腸癌早期篩查分子標(biāo)志物是目前結(jié)直腸癌無創(chuàng)早篩研究領(lǐng)域的一個熱點。但目前這種檢測整體存在價格較高的問題，僅適用于特殊人群，篩查成本效益比偏低，其中樣本前期采集、處理、保存需要大量的運(yùn)輸成本及人力成本?；诖?，本研究配制了一種適用于結(jié)直腸癌大樣本人群篩查可以常溫運(yùn)輸保存的糞便樣本保存液，并對其保存糞便樣本中人源DNA完整性及抑制微生物增殖的效果進(jìn)行了評估。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

StepOne Plus熒光實時定量PCR儀、NanoDrop One超微量分光光度計、Qubit 4熒光計和糞便樣本保存 液RNAlaterSolution，均 購 于Thermo Fisher Scientific公司，糞便樣本基因組DNA提取試劑盒購于深圳市南科征途有限公司，dsDNA HS(高靈敏度)檢測試劑盒購于Invitrogen公司。

1.2 自制糞便保存液的組分及制作

自制糞便樣本保存液主要包括：細(xì)胞緩沖組分、離子螯合DNA穩(wěn)定組分和微生物防增殖組分等。其中細(xì)胞緩沖組分為三羥甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane，Tris]、氯化鈉(sodium chloride)，離子螯合DNA穩(wěn)定組分為乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，微生物防增殖組分為硫酸銨(ammonium sulfate)及水組成。

首先制備三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液；其次制備乙二胺四乙酸溶液；再次制備氯化鈉溶液；最后將硫酸銨溶于水中加入三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液、乙二胺四乙酸溶液、氯化鈉溶液混合后，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值得到成品(各組分濃度等相關(guān)技術(shù)細(xì)節(jié)正處于專利申請中，故不作詳細(xì)描述)。

1.3 糞便樣本的采集與處理

1.3.1 糞便樣本的保存和分組

1個健康受試者的新鮮糞便樣本均分為4份。實驗組采用自制保存液與人糞便樣本1∶1體積混勻，1份室溫放置3 d，1份室溫放置7 d。對照組采集糞便樣本直接置于空管中，1份室溫放置1 h內(nèi)，1份室溫放置3 d。

1.3.2 不同凍融條件下自制糞便樣本保存液效果比較

3個健康志愿者(A/B/C)的新鮮便樣，用自制保存液與人糞便樣本1∶1體積混勻后，分別均分為5份，進(jìn)行如下處理：①室溫保存1 d、-80℃凍存6 d；②室溫保存2 d、-80℃凍存5 d；③室溫保存3 d、-80℃凍存5 d；④-80℃凍存7 d；⑤為對照組，室溫保存7 d。

1.3.3 自制保存液與RNAlater的效果比較

1個健康志愿者的新鮮便樣均分成6份，1份采集糞便樣本直接置于便樣采集空管，1份糞便樣本與RNAlater按1∶1體積混勻，其余4份糞便樣本與自制保存液1∶1體積混勻。置于保存液中的5份樣本均室溫放置7 d。

1.3.4 自制保存液用于保存結(jié)直腸癌早篩人群糞便樣本

隊列一：收集社區(qū)結(jié)直腸癌早篩人群新鮮糞便樣本434份，2～8℃冷鏈運(yùn)輸并分裝，當(dāng)天置于-80℃低溫冰箱保存。隊列二：采用自制保存液收集社區(qū)結(jié)直腸癌早篩人群新鮮糞便樣本501例，常溫運(yùn)輸，3 d內(nèi)轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。

1.4 糞便樣本核酸保存質(zhì)量檢測

1.4.1 糞便DNA提取

按照糞便樣本基因組DNA提取試劑盒說明書中的操作步驟，抽提糞便中腸道細(xì)胞的DNA樣本，體積約50 mL。

1.4.2 糞便DNA定性檢測

采用瓊脂糖凝膠電泳法，上樣量5 mL。

1.4.3 糞便DNA濃度檢測

使用Qubit/Nanodrop分光光度計，檢測提取出的DNA濃度及純度。

1.4.4 人源

β-globin

基因DNA拷貝數(shù)檢測

針對1.3.1所述不同處理條件下保存的糞便DNA，采用實時熒光定量PCR(qPCR)方法，對人源

β-globin

基因DNA拷貝數(shù)進(jìn)行檢測，并根據(jù)Δ

C

值(Δ

C

=

C

-

C

)，推測糞便DNA的變化情況。

1.4.5 人源

ACTB

基因DNA拷貝數(shù)檢測

針對糞便樣本提取的DNA，采用qPCR方法，對人源

ACTB

基因拷貝數(shù)進(jìn)行檢測，并根據(jù)

C

值，推測糞便DNA的總量，以

C

＜40為標(biāo)準(zhǔn)判為合格樣本。

2 結(jié)果

2.1 自制保存液糞便樣本DNA質(zhì)量保存效果測試

同等糞便樣本，在無自制保存液室溫放置3 d后，DNA發(fā)生明顯降解，條帶變模糊，Qubit濃度明顯增加，qPCR結(jié)果顯示

C

值較對照組增加2.5個循環(huán)。同等糞便樣本在自制保存液室溫放置7 d后，條帶與室溫放置3 d及新鮮便樣相比，條帶相似，且qPCR結(jié)果顯示Δ

C

≤0.2。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1，DNA濃度及

C

值變化情況見表1。

圖1 4等份新鮮糞便樣本在有無保存液及置室溫不同時間條件下瓊脂糖凝膠電泳分析

表1 4等份新鮮糞便樣本在有無保存液及置室溫不同時間條件下人源DNA的濃度及C t值變化情況

2.2 不同凍融條件對自制保存液保存糞便樣本DNA效果比較

不同凍融條件對自制保存液保存的糞便樣本DNA完整性良好，各組條帶無明顯異常，濃度無明顯差異，qPCR結(jié)果顯示Δ

C

值變化小于1。A、B、C 3個樣本經(jīng)不同凍融條件瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2，DNA濃度及

C

值變化情況見表2。

圖2 3組5等份便樣不同處理條件下瓊脂糖凝膠電泳分析

表2 3組5等份糞便樣本在不同處理條件下人源DNA濃度及Ct值變化情況

2.3 自制保存液與RNAlater對糞便樣本DNA保存效果比較

自制保存液保存糞便樣本7 d后DNA條帶清晰單一，優(yōu)于RNAlater；qPCR結(jié)果顯示自制保存液相較于新鮮糞便樣本對照Δ

C

值均為負(fù)值，RNAlater保存液組Δ

C

達(dá)到了1.1。兩種不同保存液對糞便樣本DNA保存完整性瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果見圖3，DNA濃度及

C

值變化情況見表3。

表3 自制保存液與RNAlater對糞便樣本人源DNA濃度及Ct值變化情況比較

圖3 自制保存液與RNAlater處理后的糞便樣本DNA瓊脂糖凝膠電泳分析

2.4 自制保存液用于結(jié)直腸癌早篩人群糞便樣本DNA保存的效果比較

將自制糞便樣本保存液應(yīng)用于實際結(jié)直腸癌早篩人群，與未使用保存液進(jìn)行保存的樣本比較，qPCR檢測結(jié)果顯示，從結(jié)直腸癌篩查人群中收集的新鮮糞便樣本的合格率為39%，而采用自制樣本保存液的樣本合格率可達(dá)71%。

3 討論

結(jié)直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，GLOBOCAN 2020估計全球結(jié)直腸癌新發(fā)病例和死亡病例分別為193.16萬和93.52萬，分別位于所有惡性腫瘤的第3位和第2位。我國最新腫瘤登記年報數(shù)據(jù)顯示，2015年我國結(jié)直腸癌新發(fā)病例38.8萬，死亡病例18.7萬，其發(fā)病和死亡數(shù)目分別位列我國惡性腫瘤的第3位和第5位。結(jié)直腸癌篩查是目前公認(rèn)的減少結(jié)直腸癌發(fā)病的有效手段，美國近20年來結(jié)直腸癌發(fā)病率的下降主要得益于篩查工作的廣泛開展，從1976年到2014年，美國結(jié)直腸癌的病死率從28.6/10萬下降到14.1/10萬。我國部分地區(qū)雖已啟動大規(guī)模人群篩查，但結(jié)直腸癌發(fā)病率及病死率還在持續(xù)上升，結(jié)直腸癌防控工作任重道遠(yuǎn)，市場規(guī)模較大。

結(jié)直腸癌各篩查指南普遍將FIT、結(jié)腸鏡檢查作為一線篩查手段，而FIT-fecal DNA等分子學(xué)檢測作為二線或三線篩查手段，主要原因還在于價格過高，成本效益比較低，不易推廣等問題。近年來，“精準(zhǔn)醫(yī)療”為疾病的檢測、診斷及治療等提供了各種新的方案，研究人員也在各自領(lǐng)域?qū)ふ腋魅巳簩倩蜃V，糞便DNA檢測作為最適合大腸癌早期篩查的檢測方法之一，具有無創(chuàng)、較高靈敏度和特異度等優(yōu)點，以此作為檢測手段的產(chǎn)品也層出不窮，但如應(yīng)用于大規(guī)模篩查人群，樣本的可及性及篩查成本也必須進(jìn)行控制。糞便樣本中不僅含有微生物菌群生物學(xué)信息，也有來自人的腸道脫落細(xì)胞，癌癥患者腫瘤上皮細(xì)胞更新速度更快，糞便中人源DNA信息會更多，而糞便樣本中的核酸酶、多糖、膽酸、膽鹽等成分均會對糞便DNA的保存及后續(xù)檢測造成影響。

在醫(yī)院或體檢中心要求進(jìn)行檢驗的糞便樣本，時常因其本身收集質(zhì)量或溫度或環(huán)境雜質(zhì)等誘發(fā)的不穩(wěn)定而必須立即送檢，給病人造成了不便且對醫(yī)護(hù)人員送檢時間要求較高，也給檢測實驗室增加了運(yùn)作和及時提供結(jié)果的難度。而對于社區(qū)篩查人群，糞便樣本保存時間及保存條件必須足夠便捷，成本必須足夠低，才能保證收集樣本質(zhì)量不受影響，促使更多的人選擇該種篩查手段。因此，亟需研發(fā)一種低成本且能夠有效保持糞便樣本中人源脫落細(xì)胞基因信息的糞便保存試劑，且試劑組分必須不影響下游如PCR、測序等分子生物檢測。

而目前公開的糞便樣本保存液方法，存在兩種局限性：①為抑制糞便中微生物滋生，使用不易保存易于分解的抗生素，對糞便保存條件的要求則更為苛刻；同時抗生素試劑成本較高，連帶提升了產(chǎn)品市場價位；②使用如乙醇或氯丁醇等物質(zhì)來固化菌群結(jié)構(gòu)，但對人類基因組保存較難保證，同時醇類作為可燃物還會產(chǎn)生運(yùn)輸風(fēng)險。因此，為解決成本較低可適用于篩查、常溫保存及運(yùn)輸、有效保護(hù)糞便中的人源脫落細(xì)胞繼而穩(wěn)定細(xì)胞中的DNA不被降解、保存液各組分不會影響后續(xù)糞便樣本檢測幾個問題，我們配制了一種經(jīng)過改良的糞便樣本保存液，在該保存液中，細(xì)胞緩沖組分可以保持糞便樣本的pH值在7～10，可以有效防止脫落細(xì)胞破裂，并阻遏基因組DNA的降解；金屬離子整合劑則用于整合糞便樣本中的金屬離子，從而穩(wěn)定樣本中DNA組分，并可抑制各種核酸酶活性；而防腐劑的添加，使糞便樣本中的微生物不致過度增殖，可防止脫落細(xì)胞被微生物破壞。

該研究分別測試了自制保存液對于糞便樣本常溫保存3、7 d的保存能力，認(rèn)為新鮮便樣及在有保存液置室溫3或7 d后人源DNA降解較少，

C

值各組基本穩(wěn)定；而無保存液室溫保存7 d后DNA降解較嚴(yán)重，且DNA濃度明顯增加，提示可能主要由污染菌擴(kuò)增導(dǎo)致，也提示自制保存液的主要作用一方面是保存基因信息完整性，保證人源脫落細(xì)胞的DNA不會發(fā)生明顯降解；另一方面在于抑菌，使微生物源DNA也無顯著增殖。測試了7 d內(nèi)不同凍融條件下自制保存液的保存糞便DNA的效能，認(rèn)為在有保存液的情況下，反復(fù)凍融一次對糞便基因信息的完整性及總量無明顯影響。因此后期開展人群大樣本量糞便樣本收集時，認(rèn)為經(jīng)自制糞便保存液處理后，可在-80℃低溫條件下長期保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融，可凍融次數(shù)有待進(jìn)一步研究。另外研究還顯示自制保存液與RNAlater相比，其保存糞便基因信息及抑制微生物生長的性能要優(yōu)于RNAlater，但成本卻是只有其1/5。本研究通過對935例社區(qū)篩查人群糞便樣本的實際應(yīng)用，對比無保存液處理的新鮮便樣本434例和用自制保存液處理的新鮮樣本501例，并提取糞便樣本DNA，經(jīng)qPCR法檢測人源

ACTB

基因拷貝數(shù)后發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用自制保存液保存人群樣本的合格率(71%)高于無保存液保存的新鮮樣本合格率(39%)。經(jīng)對保存液保存的不合格樣本進(jìn)行追蹤調(diào)查，影響因素主要有兩種：①篩查對象在采集樣本前將采集管中保存液傾掉；②樣本采集部位異常引起采集樣本多為食物殘渣而少基因信息。由于篩查大樣本時，人數(shù)眾多，人員素質(zhì)參差不齊，對樣本采集要求的理解程度等的不同，對采集質(zhì)量造成一定的影響。后續(xù)應(yīng)用過程中需對采樣說明進(jìn)一步明確，同時加強(qiáng)醫(yī)務(wù)人員的培訓(xùn)以便更好地指導(dǎo)居民采樣。

綜上所述，本研究通過改良市場糞便樣本保存液的配方，模擬社區(qū)人群結(jié)直腸癌篩查過程中樣本收集時間及溫度，對其保存性能進(jìn)行一系列的測試，開發(fā)了一種可以應(yīng)用于結(jié)直腸癌篩查人群糞便樣本保存的保存液，并通過較大人群驗證，為后續(xù)經(jīng)濟(jì)、有效、便捷地進(jìn)行分子生物學(xué)檢測前的大樣本人群糞便樣本采集提供參考和依據(jù)。