李 梅，蘇加坤，尹晶晶，徐 達(dá)，秦秀軍，安 全，蔡繼寶，*

(1．中國輻射防護(hù)研究院藥物毒理與放射損傷藥物山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原030006；2．江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，江西 南昌330096)

世界衛(wèi)生組織指出，心血管疾病(cardiovascular disease，CVDs)已經(jīng)成為威脅人類健康的重大疾病之一。吸煙是CVDs的可預(yù)防危險(xiǎn)因素之一，是獨(dú)立于年齡、高血脂、糖尿病、高血壓等高危因素以外的心腦血管危險(xiǎn)因素。當(dāng)下比較肯定的是吸煙對血管的影響，例如血管內(nèi)皮功能失調(diào)、促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生以及發(fā)展等。但有關(guān)吸煙對心臟影響的研究較少，且大多僅局限于吸煙的急性效應(yīng)。長期吸煙能夠引起心臟形態(tài)學(xué)和功能學(xué)的改變，使心臟發(fā)生重塑。本文旨在研究煙氣暴露對心臟基因表達(dá)譜的影響，從而證明其對心臟結(jié)構(gòu)與功能的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級雄性SD大鼠6只，9～10周齡，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。生產(chǎn)許可證號SCXK-(京)2016-0006，質(zhì)量合格證號11400700300671。大鼠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中，使用許可證號SYXK(晉)2013-0002。

1.2 卷煙和主要儀器

0號卷煙，由江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，每支含煙堿1.0 mg，焦油10.0 mg，一氧化碳10.0 mg。

HRH-WBE3986型動(dòng)物全身煙氣暴露系統(tǒng)，購自北京慧榮和科技有限公司；Agilent Rat基因芯片，購自上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司；NanoDrop ND-2000，購自Thermo Scientific公司。

1.3 動(dòng)物分組及處理

將大鼠隨機(jī)分為對照組和煙氣暴露組，每組3只。對照組不進(jìn)行干預(yù)；煙氣暴露組將大鼠放置于動(dòng)物全身煙氣暴露系統(tǒng)的煙腔內(nèi)進(jìn)行主流煙氣暴露，煙氣濃度控制在(1 100±110)mg/m，每天1次，每次60 min，30 d后剖殺，取對照組及煙氣暴露組心臟進(jìn)行檢測分析。

1.4 芯片篩選

提取心臟總RNA，定量并檢測RNA完整性。參照芯片標(biāo)準(zhǔn)操作，進(jìn)行樣本標(biāo)記、芯片雜交及洗脫。首先，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)一步合成用Cyanine-3-CTP(Cy3)標(biāo)記的cRNA。將標(biāo)記好的cRNA與芯片雜交，洗脫，然后利用Agilent Scanner G2505C掃描得到原始圖像。以上操作均由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Feature Extraction軟件處理原始圖像，提取原始數(shù)據(jù)。利用Genespring軟件對提取的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。利用倍數(shù)變化(fold change，F(xiàn)C)值篩選差異基因，要求上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值≥2.0且

P

≤0.05作為篩選的標(biāo)準(zhǔn)。在篩選差異基因前，先進(jìn)行探針過濾，用于比較的每組樣本中至少有一組100%標(biāo)記為P(probe-name)的探針號留下進(jìn)行后續(xù)分析。對于有生物學(xué)重復(fù)的分析，利用

T

檢驗(yàn)得到的差異顯著性

P

值和標(biāo)準(zhǔn)化信號的FC值進(jìn)行篩選，標(biāo)準(zhǔn)為FC≥2.0且

P

≤0.05。對于無生物學(xué)重復(fù)的分析，僅利用FC值進(jìn)行篩選，標(biāo)準(zhǔn)為FC≥2.0。在設(shè)生物學(xué)重復(fù)的情況下(即使用統(tǒng)計(jì)分析法分析差異表達(dá))得出火山圖，利用火山圖展示差異表達(dá)情況。對篩選出的差異基因進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫富集分析，以判定差異基因主要影響的生物學(xué)功能或者信號通路。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因情況

吸煙組篩選出差異表達(dá)2倍以上的基因共86個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)基因60個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因26個(gè)。散點(diǎn)圖中除藍(lán)色表示下調(diào)差異基因外，其他顏色散點(diǎn)均為上調(diào)差異表達(dá)基因，見圖1。聚類分析結(jié)果見圖2。色階表示基因表達(dá)量從相對低(藍(lán))到相對高(紅)變化，行名為探針名稱，列為樣本名稱，連線表示樣品兩兩之間的距離，構(gòu)成距離矩陣，合并距離最近的兩類為一新類，計(jì)算新類與當(dāng)前各類的距離，再合并計(jì)算，直至有一類為止。聚在同一個(gè)簇中的基因可能具有相似的生物學(xué)功能。

圖1 吸煙組大鼠心臟組織差異表達(dá)基因篩選散點(diǎn)圖

圖2 差異表達(dá)基因聚類分析結(jié)果

2.2 差異表達(dá)基因GO富集分析

根據(jù)GO分析對基因的注釋，對煙氣暴露組篩選出的86個(gè)差異表達(dá)2倍以上的基因采用生物學(xué)過程、細(xì)胞組分及分子功能進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，86個(gè)差異表達(dá)基因富集于292種生物學(xué)過程，72種細(xì)胞組分和96類分子功能，其中差異顯著的生物學(xué)過程112種，細(xì)胞組分11種，分子功能22類。圖3～圖5顯示了生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能3類富集分析差異顯著性前20位條目。分子功能分析表明，差異表達(dá)基因主要涉及促分裂原活化蛋白激酶結(jié)合、鎂離子結(jié)合、脫甲基化酶活性、乙醇結(jié)合、蛋白磷酸酶調(diào)節(jié)劑活性、趨 化 因 子(C-C基 元)受 體2(recombinant chemokine C-C-motif receptor 2，CCR2)結(jié)合、煙酸脫氫酶(nicotinic acid dehydrogenase，NAD)活性、免疫組化結(jié)合、催化活性、信號素受體結(jié)合、磷脂-5-磷酸結(jié)合、黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD)結(jié)合、小泛素相關(guān)修飾物(small ubiquitin-like modifier，SUMO)轉(zhuǎn)移酶活性(圖3)。細(xì)胞組分分析表明，差異表達(dá)基因主要涉及α-βT細(xì)胞受體復(fù)合物、凝聚染色體外型、染色質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)、偏心異染色質(zhì)、T細(xì)胞受體復(fù)合物(圖4)。生物學(xué)過程分析表明，差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞外滲的正調(diào)節(jié)、Wnt信號通路、平面細(xì)胞急性通路的正調(diào)節(jié)等(圖5)。

圖3 煙氣暴露30 d后差異表達(dá)基因的主要分子功能分析

圖4 煙氣暴露30 d后差異表達(dá)基因的主要細(xì)胞組分分析

圖5 煙氣暴露30 d后差異表達(dá)基因的主要生物學(xué)過程分析

2.3 差異表達(dá)基因KEGG富集分析

對30 d煙氣暴露組差異表達(dá)2倍以上的86個(gè)基因進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果顯示，差異表達(dá)2倍以上基因涉及61條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中差異顯著的通路有9條(

P

＜0.05)。差異顯著性排前10位的通路見圖6，主要包括絡(luò)氨酸代謝、細(xì)胞色素P450對異種生物學(xué)的代謝作用、類固醇激素生物合成、視黃醇代謝、造血細(xì)胞譜系、心肌炎、化學(xué)致癌、恰加斯病(美洲錐蟲病)及非同源尾部鏈接。

圖6 吸煙組大鼠心臟組織差異基因KEGG富集分析結(jié)果

3 討論

吸煙嚴(yán)重影響著人民群眾的健康，世界衛(wèi)生組織最新報(bào)告顯示，2019年全球約有13億人吸煙，每年有490萬人因吸煙而死亡，東南亞就占了110萬，中國目前煙民有3億多，其中年齡超過29歲的至少有1億人因吸煙而付出生命代價(jià)。吸煙與多種心血管疾病的發(fā)生均有密切關(guān)系，其原因主要是因?yàn)闊煵萑紵龝r(shí)可釋放多種有毒有害化學(xué)物質(zhì)，如尼古丁、酚類、醇類、醛類、焦油、CO、CO衍生的自由基、烷烴、多環(huán)芳烴等。這些有毒有害氣體中，尼古丁和CO對心血管的影響最為重要，但其對心臟系統(tǒng)的損害機(jī)制尚不明確。有研究表明吸一支煙后可快速引起左心室舒張功能減弱。

本研究采用動(dòng)物全身動(dòng)態(tài)暴露系統(tǒng)將SD大鼠連續(xù)染毒30 d，取大鼠心臟，應(yīng)用基因芯片技術(shù)進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選，探討煙氣暴露造成的差異表達(dá)基因可能的損傷機(jī)制。應(yīng)用GO富集分析對差異表達(dá)2倍以上的86個(gè)基因進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，染毒30 d基因表達(dá)的改變涉及到多種分子功能、細(xì)胞組分及生物學(xué)過程，主要包括促分裂原活化蛋白激酶結(jié)合、鎂離子結(jié)合、脫甲基化酶活性、細(xì)胞受體復(fù)合物、染色體、染色質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外滲正調(diào)節(jié)、信號通路等。篩選出了促分裂原活化蛋白激酶，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，細(xì)胞周期調(diào)控等相關(guān)差異基因。有關(guān)這些基因的序列分析及功能預(yù)測已有許多研究報(bào)道，如Castardeli等研究發(fā)現(xiàn)煙氣暴露4個(gè)月的大鼠，與對照組相比較左心房(LA)、左心室(LV)、左心室體積指數(shù)(LVMI)均增大，左室短軸縮短率(FS)與心室射血分?jǐn)?shù)(EF)降低，同時(shí)也引起心臟形態(tài)學(xué)及收縮功能的改變。大鼠長期暴露在煙氣環(huán)境下能夠使去甲腎上腺素(NE)及促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)增加。而MAPKs在心力衰竭、細(xì)胞肥大、心肌再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，其主導(dǎo)心肌細(xì)胞的存活和生長，MAPKs的活化預(yù)示煙氣暴露對心臟功能的毒性損傷效應(yīng)。心臟形態(tài)及功能的改變可由心肌損傷及負(fù)荷改變引起。心腔大小和LVMI的變化表明心臟形態(tài)學(xué)的改變，提示了患者心臟的重塑。心室功能降低是導(dǎo)致心臟重塑的一個(gè)重要原因，心室功能降低之初為了維持心臟功能，細(xì)胞代償性增生，其后由于細(xì)胞生物化學(xué)、結(jié)構(gòu)、基因等改變導(dǎo)致失代償，心室功能進(jìn)行性降低，從而形成心臟重塑。

KEGG富集分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要包括絡(luò)氨酸代謝、細(xì)胞色素P450代謝、類固醇激素生物合成、視黃醇代謝、造血細(xì)胞譜系、心肌炎、化學(xué)致癌性等生物學(xué)通路。細(xì)胞色素P-450存在于心臟和冠脈循環(huán)中。吸食煙草和可卡因能誘導(dǎo)參與心肌梗死的細(xì)胞色素P-450，易增加心肌梗死發(fā)生率。有研究顯示，缺血再灌注過程中選擇性抑制細(xì)胞色素P-450，將是治療心肌梗死的一條較有前景的途徑。

本次研究發(fā)現(xiàn)蛋白激酶活化、細(xì)胞色素P-450差異表達(dá)顯著，因此提示吸煙對心臟具有危害。煙氣對心臟造成的影響是一個(gè)較復(fù)雜的過程，經(jīng)常暴露在煙氣環(huán)境下可加重心臟形態(tài)學(xué)改變、功能學(xué)改變的發(fā)生，使心臟功能下降，誘發(fā)心臟重塑，增加心血管疾病的發(fā)病率及病死率。心臟重塑是心力衰竭發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素，臨床主要表現(xiàn)為心臟功能減退、心腔擴(kuò)大、心肌變薄或肥厚等。目前國內(nèi)外對吸煙的慢性長期效應(yīng)研究相對較少，吸煙對心臟影響的作用機(jī)制還需深入研究。

綜上，本研究以煙氣暴露30 d大鼠為對象，研究了煙氣暴露30 d大鼠心臟基因表達(dá)譜的變化，篩選出了差異表達(dá)基因。這些基因涉及細(xì)胞周期、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)生物學(xué)通路，這些通路的變化是相互影響及相互作用的結(jié)果。此次篩選出的結(jié)果將為進(jìn)一步篩選吸煙差異基因以及研究吸煙損傷機(jī)制提供依據(jù)。