黃曉華，牛永東，石剛剛，*

(1．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，廣東汕頭515041；2．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東汕頭515041)

宮頸癌是世界范圍內(nèi)第三大常見的惡性腫瘤，在女性病死率中排名第四。近年來，我國宮頸癌的病死率呈上升趨勢，2003—2013年發(fā)病率也穩(wěn)步上升。研究表明，HPV可以通過抑制p53和Rb等關(guān)鍵蛋白來促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。

核受體是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，含有48個成員。法尼醇X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)是核受體超家族中的成員，它最初是由Seol與Forman等在1995年發(fā)現(xiàn)的。FXR可以被膽汁酸激活，F(xiàn)XR激動劑如GW4064、CA、LCA、CDCA也可激活FXR表達(dá)。FXR在肝、腎、腎上腺等組織中高表達(dá)，在宮頸組織、脂肪組織和心臟組織中也有表達(dá)。FXR與視黃醇X受體(retinoid X receptor，RXR)形成異源二聚體，結(jié)合到靶基因的啟動子如小異源二聚體伴侶(short heterodimer partner，SHP)上。除了肝臟再生和炎癥的作用之外，F(xiàn)XR還調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌、胰腺癌和胃癌的發(fā)生和增殖。FXR在未交配兔和孕兔所有類型的卵泡、卵巢間質(zhì)均有表達(dá)。FXR的表達(dá)與雌激素受體表達(dá)呈線性關(guān)系。在雌激素陽性的腫瘤當(dāng)中，F(xiàn)XR與增殖標(biāo)記Ki-67表達(dá)密切相關(guān)。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與雌激素密切相關(guān)，目前FXR在女性生殖組織中的作用仍不清楚，尤其是對宮頸癌的發(fā)生有無影響尚未見報道。本文采用FXR激動劑GW4064作用宮頸癌CaSki細(xì)胞，觀察FXR激活對宮頸癌細(xì)胞增殖的影響，并探討其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

宮頸癌細(xì)胞株CaSki購自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。本研究使用的主要試劑有：DMEM培養(yǎng)基(Life)；胎牛血清(Biowest)；Trizol試劑盒、Primer Script逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑(TaKaRa)；四甲基噻唑藍(lán)(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)、FXR激 動劑GW4064(Sigma)；兔抗人FXR、鼠抗人p53(Santa)；鼠抗人β-actin(Zsbio)；HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗小鼠IgG(Boster)；Annexin V，F(xiàn)ITC凋亡檢測試劑盒(東仁)。

本研究使用的主要儀器有：二氧化碳恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Panasonic)；超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；倒置相差顯微鏡(Nikon)；多功能酶標(biāo)儀(Spectra Max)；BD accuritm C6流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

CaSki細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、飽和濕度、CO體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中，每隔兩天更換一次培養(yǎng)基。GW4064是公認(rèn)的FXR激動劑，實驗設(shè)DMSO(1 μL/mL)對照組及GW4064作用組。每組實驗重復(fù)3次。

1.2.2

RNA提取和實時熒光定量PCR

細(xì)胞貼壁后加入10 μmol/L的GW4064作用24 h，用Trizol試劑盒提取RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實時熒光定量PCR檢測FXR mRNA水平。βactin作為內(nèi)參。實驗重復(fù)3次。采用2法計算FXR的表達(dá)量。按照表1配制PCR反應(yīng)混合液。將混合液混勻后離心，置于ABI 7500熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。95℃、30 s；95℃、5 s，60℃、34 s，40個循環(huán)。引物序列如表2所示。

表1 PCR反應(yīng)混合液的配制

表2 PCR引物序列

1.2.3 Western blot

采 用Western blot檢 測FXR及p53的蛋白水平。細(xì)胞貼壁后加入10 μmol/L的GW4064作用48 h，PBS洗滌后加入RIPA裂解液，放置在冰上裂解30 min，期間每隔5 min振蕩1次。取裂解液4℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清液采用煮沸法變性后置-20℃保存。用10%的SDSPAGE電泳分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)恒壓100 V、75 min轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上，將NC膜放入封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST)中，室溫下封閉60 min，然后滴加一抗4℃孵育過夜。次日TBST洗滌后，滴加二抗室溫孵育1 h后曝光。蛋白條帶用灰度值量化表示。β-actin作為陽性對照。

1.2.4

MTT法檢測細(xì)胞存活率

將CaSki細(xì)胞分別置于96孔板中，每孔3 000個細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞貼壁后，加入DMSO或GW4064至培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h。棄去培養(yǎng)基后每孔加入不含血清的DMEM(內(nèi)含10 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液)，37℃孵育4 h，棄去培養(yǎng)基后每孔加入150 μL DMSO并振蕩10 min。用多功能酶標(biāo)儀在490 nm處讀取吸光度值

D

(490)。

1.2.5 細(xì)胞凋亡率檢測

將細(xì)胞接種于60 mm平皿中，加入DMSO或GW4064至培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72和96 h。采用胰酶消化法將細(xì)胞收集到EP管中，制成1×10個/mL的細(xì)胞懸液；PBS洗滌后，將100 μL預(yù)先配好的1×Annexin V結(jié)合液加入細(xì)胞沉淀中，加入5 μL Annexin V、FITC以及5 μL PI溶液，避光在室溫中孵育15 min，加入1×Annexin V結(jié)合液400 μL；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，發(fā)光波長(Ex)為488 nm，激發(fā)波長(Em)為530 nm。

1.3 統(tǒng)計分析

實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用

x

ˉ±

s

表示，計量資料的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 GW4064作用CaSki細(xì)胞后的FXR mRNA及蛋白表達(dá)水平

將DMSO及GW4064分別加入CaSki細(xì)胞培養(yǎng)基當(dāng)中，分別于24和48 h提取mRNA和蛋白，檢測FXR mRNA及蛋白表達(dá)水平。在CaSki細(xì)胞中，GW4064作用組FXR mRNA及蛋白水平均較DMSO組明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1，

P

＜0.05)。

圖1 GW4064對CaSki細(xì)胞FXR mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

2.2 GW4064對CaSki細(xì)胞增殖的影響

CaSki細(xì)胞用GW4064處理24、48、72 h，通過MTT法檢測細(xì)胞存活率，GW4064組較對照組均明顯下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2，

P

＜0.05)，提示GW4064激活FXR后可抑制CaSki細(xì)胞的增殖。

圖2 GW4064對CaSki細(xì)胞增殖的影響

2.3 GW4064作用后CaSki細(xì)胞的凋亡率

流式細(xì)胞術(shù)檢測GW4064對CaSki細(xì)胞凋亡的影響(圖3，

P

＜0.05)。與對照組相比，GW4064作用組CaSki細(xì)胞的早期及晚期凋亡率均增加；隨著時間推移，早期凋亡率減少，而晚期凋亡率增加。這表明，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是FXR發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測GW4064作用后CaSki細(xì)胞的凋亡率

2.4 GW4064作用后CaSki細(xì)胞p53蛋白的表達(dá)水平

通過Western blot檢測GW4064作用CaSki細(xì)胞48 h后p53蛋白的表達(dá)水平。與DMSO組相比，GW4064作用組CaSki細(xì)胞中p53蛋白的表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖4，

P

＜0.05)。

圖4 GW4064對p53蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

核受體家族與多種癌癥發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如肝癌、胰腺癌和胃癌等。我們前期的研究表明，與癌旁正常組織相比，孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)在宮頸癌組織中低表達(dá)，用PXR激動劑利福平及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達(dá)PXR可在體內(nèi)及體外抑制宮頸癌細(xì)胞株的增殖。而PXR表達(dá)受到FXR受體調(diào)節(jié)，用膽酸或FXR激動劑GW4064喂養(yǎng)小鼠可造成強(qiáng)大的PXR誘導(dǎo)。在本研究中，F(xiàn)XR激動劑可在細(xì)胞水平抑制宮頸癌細(xì)胞株的增殖，證明激活FXR可在體外發(fā)揮抑制宮頸癌增殖的效應(yīng)。

FXR通過調(diào)節(jié)腫瘤生長因子的表達(dá)和凋亡來影響癌細(xì)胞的增殖。在乳腺癌、睪丸癌、結(jié)腸癌等不同的腫瘤細(xì)胞株中，F(xiàn)XR激活均可引起細(xì)胞凋亡。FXR活化可通過激活某些信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而影響腫瘤細(xì)胞增殖。FXR激活誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡，可能與p53誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。

p53

基因存在于染色體17p上，作為腫瘤抑制基因，控制細(xì)胞進(jìn)入S期，p53在細(xì)胞增殖中起著重要的作用。p53突變抑制細(xì)胞增殖活性，與腫瘤增殖有關(guān)。p53腫瘤抑制因子在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、DNA修復(fù)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用。本研究應(yīng)用GW4064激活FXR，可以增加p53的蛋白表達(dá)水平，提示FXR激活至少部分通過增加p53表達(dá)對細(xì)胞凋亡發(fā)揮效應(yīng)。

綜上所述，F(xiàn)XR對CaSki細(xì)胞株發(fā)揮促凋亡、抗腫瘤生成的作用。說明FXR在宮頸癌發(fā)生中起重要調(diào)控作用，有可能成為宮頸癌治療的潛在靶點。