張世民，趙瑞君*

(1．彭澤縣人民醫(yī)院普外科，江西 彭澤332700；2．南昌市第三醫(yī)院乳腺疾病診療中心，江西 南昌330009)

2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示乳腺癌發(fā)病率居全球癌癥之首，同時(shí)其病死率也位居女性惡性腫瘤死亡率之首。盡管近年來乳腺癌在診斷、手術(shù)、化療、放療等方面都取得了較大的進(jìn)展，但仍有部分患者由于發(fā)生放化療耐藥和轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致預(yù)后不良。因此，尋找乳腺癌的治療靶點(diǎn)和預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物對(duì)乳腺癌患者的預(yù)后判斷具有重要意義。

蛋白酪氨酸磷酸酶受體J(protein tyrosine phosphatase receptor J，PTPRJ)是一種具有抑癌功能的蛋白酪氨酸磷酸酶，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、侵襲、遷移、血管生成、細(xì)胞黏附等過程中發(fā)揮著重要作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，其在乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、宮頸癌、淋巴癌和胃癌等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)。蛋白酪氨酸磷酸酶和蛋白酪氨酸激酶互為拮抗物通過控制蛋白磷酸化修飾維持機(jī)體正常生理狀態(tài)。在乳腺癌組織中，PTPRJ表達(dá)缺失，PTPRJ通過激活雞肉瘤病毒基因(sarcoma gene，Src)酪氨酸激酶信號(hào)通路進(jìn)而影響乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，但是PTPRJ蛋白水平與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系還未見報(bào)道。本研究通過免疫組化方法分析PTPRJ在乳腺癌中的表達(dá)情況，通過多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析PTPRJ與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，揭示PTPRJ在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，為乳腺癌患者的診斷和預(yù)后提供新的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2001年7月—2012年1月于南昌市第三醫(yī)院收治的198例原發(fā)乳腺癌患者，同時(shí)獲取配對(duì)癌旁正常組織(距離癌組織＞5 cm)作為對(duì)照。所有患者均經(jīng)手術(shù)切除并經(jīng)組織病理檢查確診為乳腺癌，臨床、病理資料及隨訪資料均完整。所有患者均為女性，年齡26～76歲，中位年齡50歲。腫瘤直徑≤2 cm的患者93例，＞2 cm的患者105例；有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者85例，無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者113例；根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)乳腺癌分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期+Ⅱ期的患者107例，Ⅲ+Ⅳ期的患者91例；雌激素受體(estrogen receptor，ER)陽性的患者130例，ER陰性的患者68例；孕激素受體(progesterone receptor，PR)陽性的患者128例，PR陰性的患者70例；人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)陽性的患者138例，HER2陰性的患者60例。

1.2 免疫組織化學(xué)

兔抗人PTPRJ多克隆抗體購自Abcam公司。免疫組織化學(xué)染色采用SP二步法，SP試劑盒購自福州邁新公司。將患者的乳腺腫瘤組織標(biāo)本，經(jīng)4%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚切片后脫蠟水化、抗原修復(fù)、PBS沖洗、3% HO阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，血清封閉，一抗(1∶200)稀釋4℃過夜，二抗室溫孵育1 h，DAB顯色、蘇木精復(fù)染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，已知陽性胃癌組織作為陽性對(duì)照。

1.3 免疫組化結(jié)果判定

乳腺癌細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕褐色顆粒染色為PTPRJ陽性表達(dá)。毎例切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡(×400)視野，按照陽性腫瘤細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比及細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)判。對(duì)陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分：無陽性染色細(xì)胞計(jì)0分，≤10%計(jì)1分，10%～50%(含)計(jì)2分，50%～75%(含)計(jì)3分，＞75%計(jì)4分。對(duì)細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩者得分相乘得到總分?jǐn)?shù)：即0～12分，其中0～2分為PTPRJ低表達(dá)，≥3分為PTPRJ高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。PTPRJ蛋白表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系采用

χ

檢驗(yàn)?？偵娣治霾捎肒aplan-Meier曲線法，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)，使用單因素和多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析PTPRJ和臨床病理指標(biāo)對(duì)患者預(yù)后的影響。

P

＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTPRJ在癌旁正常乳腺和乳腺癌組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示PTPRJ主要陽性表達(dá)部位為腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(圖1)。在198例乳腺癌組織中，106例(53.5%)為PTPRJ低表達(dá)，92例(46.5%)為PTPRJ高表達(dá)(表1)。癌旁正常乳腺組織中PTPRJ表達(dá)陽性率顯著高于乳腺癌組織(

χ

=9.021，

P

=0.003)。

表1 PTPRJ在乳腺癌和癌旁正常乳腺組織中的表達(dá)比較(n=198)

圖1 PTPRJ在癌旁正常乳腺和乳腺癌組織中的表達(dá)情況(SP，×400)

2.2 PTPRJ表達(dá)與乳腺癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

結(jié)果發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的PTPRJ陽性表達(dá)率明顯低于無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者(

P

=0.014)；TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期組的PTPRJ陽性表達(dá)率明顯低于TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期組患者(

P

=0.003)；ER陽性組的PTPRJ陽性表達(dá)率明顯高于ER陰性組患者(

P

=0.048)；PTPRJ表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、PR狀態(tài)和HER2表達(dá)無明顯相關(guān)關(guān)系(表2)。

表2 PTPRJ表達(dá)與乳腺癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.3 PTPRJ表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

本組全部198例患者中，隨訪時(shí)間為6～216個(gè)月，平均隨訪時(shí)間為173個(gè)月，隨訪期內(nèi)死亡56例。使用Kaplan-Meier方法評(píng)估PTPRJ表達(dá)對(duì)乳腺癌患者總生存的影響。分析表明，與PTPRJ高表達(dá)組相比，PTPRJ低表達(dá)組患者的總生存時(shí)間更短(

P

=0.002，Log-rank檢驗(yàn)，

χ

=9.670)(圖2)。PTPRJ高表達(dá)組患者的5年和10年總生存率分別為95.6%和87.2%，而低表達(dá)組患者總生存率分別為80.0%和66.2%。

圖2 PTPRJ表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.4 影響乳腺癌患者總生存的預(yù)后分析

使用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)乳腺癌患者的年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期、ER、PR、HER2以及PTPRJ表達(dá)情況分別進(jìn)行單因素分析，結(jié)果顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、ER、PR狀態(tài)以及PTPRJ表達(dá)與患者總生存密切相關(guān)(

P

＜0.05)，見表3。將單因素分析中有意義的因素再進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示TNM分期(

P

=0.005)和PTPRJ表達(dá)(

P

=0.012)是影響患者總生存的獨(dú)立預(yù)后因素，見表4。

表3 乳腺癌患者總生存相關(guān)因素的單因素分析

表4 乳腺癌患者總生存相關(guān)因素的多因素分析

3 討論

乳腺癌是嚴(yán)重威脅我國(guó)女性健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升，且呈年輕化趨勢(shì)，受到人們的廣泛關(guān)注。近年來，關(guān)于乳腺癌的基礎(chǔ)與臨床研究不斷加深，乳腺癌患者的5年生存率已經(jīng)取得明顯提高，但仍有一部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)就已經(jīng)到了晚期，從而導(dǎo)致預(yù)后不良。因此，迫切需要尋找影響乳腺癌進(jìn)展的分子標(biāo)志物，從而改善乳腺癌的預(yù)后。

目前多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)PTPRJ在一系列癌癥中表達(dá)失調(diào)，但是它在癌癥中的作用仍然有爭(zhēng)議。Smart等對(duì)2例正常乳腺組織和27例乳腺癌組織進(jìn)行小樣本免疫組織化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)PTPRJ在乳腺癌中表達(dá)缺失，其表達(dá)低于正常乳腺，進(jìn)一步通過生物信息學(xué)挖掘?qū)?59例乳腺腫瘤的PTPRJ DNA拷貝數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)

PTPRJ

基因組缺失與乳腺癌分子表型無關(guān)，PTPRJ表達(dá)和患者總生存率之間也無顯著相關(guān)性，而隨著隨訪時(shí)間延長(zhǎng)到20年以上，在另外一個(gè)數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)PTPRJ表達(dá)較高的患者總生存率更高。而本研究分析了PTPRJ在198例配對(duì)癌旁正常乳腺和乳腺癌組織的蛋白表達(dá)情況，在正常乳腺組織中PTPRJ表達(dá)陽性率顯著高于乳腺癌組織(

χ

=9.021，

P

=0.003)。通過分析PTPRJ蛋白表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PTPRJ表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和ER狀態(tài)有關(guān)，而與患者年齡、腫瘤大小、PR狀態(tài)和HER2表達(dá)無顯著相關(guān)，提示PTPRJ表達(dá)缺失和乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。大量研究表明，PTPRJ通過去磷酸化受體酪氨酸激酶MAPK、MET、SRC、EGFR和AKT激酶等下游蛋白來負(fù)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，PTPRJ升高與多種人類癌癥的細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化和遷移活性降低有關(guān)。而另外一些研究發(fā)現(xiàn)PTPRJ可以調(diào)節(jié)血小板活化、細(xì)胞黏附和血管生成等多種生物學(xué)功能。我們第一次針對(duì)PTPRJ的蛋白水平進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與PTPRJ高表達(dá)組相比，PTPRJ低表達(dá)組患者的總生存時(shí)間更短(

P

=0.002，

χ

=9.670)。進(jìn)一步通過多因素分析發(fā)現(xiàn)TNM分期和PTPRJ表達(dá)是影響患者總生存的獨(dú)立預(yù)后因素(表4)。這提示PTPRJ低表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后不良密切相關(guān)。與本研究結(jié)果不一致的是，Spring等通過生物信息方法挖掘發(fā)現(xiàn)，相比正常乳腺組織，PTPRJ mRNA在浸潤(rùn)性乳腺癌組織中高表達(dá)。分析原因可能是由于PTPRJ存在翻譯后調(diào)控，導(dǎo)致蛋白被抑制或者降解所致，具體的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步探索。

綜上所述，PTPRJ在乳腺癌組織中低表達(dá)，發(fā)揮抑癌基因的功能，與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移相關(guān)，并可能成為預(yù)測(cè)乳腺癌預(yù)后的一項(xiàng)重要指標(biāo)。后續(xù)本研究將從體內(nèi)和體外對(duì)PTPRJ蛋白表達(dá)與不同分子亞型乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及蛋白降解等分子機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探討，尋找PTPRJ影響乳腺癌轉(zhuǎn)移的直接底物以及相關(guān)信號(hào)通路，為闡明抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制提供新的思路。