張梓涵，李 麗，張文鋒，張艷超，陳慧玲，石 明，2，*

(1．廣東醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，東莞市環(huán)境醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 東莞523808；2．廣東醫(yī)科大學(xué)寮步醫(yī)院，廣東 東莞523400)

隨著鹵代阻燃劑在全球范圍內(nèi)被逐步禁用，有機(jī)磷阻燃劑(organophosphorus flame retardants，OPFRs)因其價(jià)格低、品種多、阻燃效果好等優(yōu)點(diǎn)，被應(yīng)用于建筑材料、家具、紡織用品、電子產(chǎn)品等行業(yè)，并廣泛存在于生態(tài)環(huán)境中。磷酸三苯酯(triphenyl phosphate，TPHP)是一種典型的芳香基OPFRs，在各類工業(yè)產(chǎn)品中被廣泛用作增塑劑和阻燃劑。但是，TPHP具有較高的揮發(fā)性和親脂性，在生產(chǎn)和使用過(guò)程中容易從材料中通過(guò)揮發(fā)、滲出等方式釋放，并持久存在于環(huán)境中。由于TPHP難降解，在環(huán)境中存留時(shí)間較長(zhǎng)，在生物體內(nèi)具有富集效應(yīng)，對(duì)人體健康和環(huán)境安全具有較大威脅，其毒性研究受到了人們的廣泛關(guān)注。

免疫系統(tǒng)作為機(jī)體執(zhí)行免疫應(yīng)答及免疫功能的重要系統(tǒng)，參與協(xié)助各系統(tǒng)發(fā)揮正常的生理功能，對(duì)外源性化學(xué)物較敏感。TPHP可引起某些免疫細(xì)胞的損傷，誘導(dǎo)過(guò)敏性接觸性超敏反應(yīng)，但目前對(duì)其引發(fā)的具體免疫毒性作用及機(jī)制尚未見報(bào)道。巨噬細(xì)胞是構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分之一，具有趨化性運(yùn)動(dòng)、吞噬、分泌和抗原呈遞等功能，在巨噬細(xì)胞吞噬過(guò)程中，最為顯著的特點(diǎn)是在吞噬體周圍出現(xiàn)絲狀肌動(dòng)蛋白F-actin的局部快速積聚與相關(guān)蛋白在吞噬體周圍分布。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是巨噬細(xì)胞的表面模式識(shí)別受體之一，被激活后可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子，啟動(dòng)巨噬細(xì)胞的免疫防御功能和吞噬功能。TLR4的激活能夠引起磷脂酰肌醇-3-激 酶(PI3K)-絲/蘇 氨 酸 激 酶(serine/threonine kinase，Akt)-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)軸的激活，其中PI3K/Akt信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞活化、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞存活和凋亡中發(fā)揮著中心作用。

因此，本研究以小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7為研究對(duì)象，通過(guò)檢測(cè)TPHP對(duì)巨噬細(xì)胞的存活率、細(xì)胞毒性和吞噬功能的影響，探討TPHP暴露對(duì)免疫系統(tǒng)的毒性作用和潛在機(jī)制，為TPHP暴露對(duì)免疫系統(tǒng)影響和毒性風(fēng)險(xiǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、CCK-8試劑均購(gòu)自Gibco公司；乳酸脫氫酶釋放檢測(cè)試劑盒(CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)購(gòu)自Promega公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA)購(gòu) 自Sigma公 司；TLR4、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；ECL發(fā)光液購(gòu)自ThermoFisher Scientific公司；Phagocytosis Assay Kit(IgG-FITC)購(gòu)自Cayman公司。

1.2 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7為廣東醫(yī)科大學(xué)閆沖教授惠贈(zèng)。在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、CO體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。定時(shí)觀察培養(yǎng)基顏色和細(xì)胞狀態(tài)，及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基和傳代培養(yǎng)。將細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁狀態(tài)，于普通光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝細(xì)胞的形態(tài)和偽足。

1.3 CCK-8比色法檢測(cè)TPHP對(duì)Raw264.7細(xì)胞活性的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raw264.7細(xì)胞，按照每孔5×10個(gè)細(xì)胞加入到96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度(12.5、25、50、100、200、400 μmol/L)的TPHP溶液處理細(xì)胞。對(duì)照組每孔加入等體積的DMEM培養(yǎng)液。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48或72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑并在37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3 h。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度

D

(450)。按如下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：

1.4 乳酸脫氫酶釋放法檢測(cè)細(xì)胞毒性

將Raw264.7細(xì)胞以5×10/孔加入到96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度(12.5、25、50、100、200、400 μmol/L)的TPHP溶液處理細(xì)胞，對(duì)照組每孔加入等體積的培養(yǎng)液，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)最大釋放量組則在加CytoTox 96試劑前45 min加入10 μL的10×裂解液。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h或72 h后，將所有待測(cè)孔的50 μL上清液轉(zhuǎn)移至新的96孔板中，再加入50 μL CytoTox 96Reagent檢測(cè)液，室溫避光孵育30 min后，每孔加入50 μL終止液，使用酶標(biāo)儀讀取490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值

D

(490)。LDH釋放率用如下公式計(jì)算：

1.5 熒光微球法測(cè)定Raw264.7細(xì)胞吞噬功能

將Raw264.7細(xì)胞均勻接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度(0、12.5、25和50 μmol/L)的TPHP繼續(xù)孵育24 h，加入FITC標(biāo)記的熒光微球(用含5% BSA的TBST緩沖液按1∶500稀釋)，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，期間每隔30 min振動(dòng)培養(yǎng)板。棄去培養(yǎng)基，用1 mL預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞后，加入0.2%臺(tái)盼藍(lán)淬滅吸附在細(xì)胞表面的熒光，再用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量吞噬熒光微球陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目及比例。

1.6 Western blot檢測(cè)各蛋白的表達(dá)

不同濃度(0、12.5、25和50 μmol/L)TPHP處理Raw264.7細(xì)胞24 h后，用PBS洗滌細(xì)胞2次，再加入細(xì)胞裂解混合液(細(xì)胞裂解液、磷酸酶抑制劑、PMSF的體積比為100∶1∶1)，冰上裂解30 min后刮取細(xì)胞，超聲充分破碎，4℃、12 000 r/min離心10 min，吸取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，加入5×上樣緩沖液，100℃煮沸5 min制備蛋白樣品。各組取30 μg的蛋白于5%的濃縮膠、8%的分離膠進(jìn)行電泳，電壓調(diào)至80 V，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠，更換100 V電壓。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5% BSA室溫封閉PVDF膜2 h后，分別加入mTOR、p-mTOR、TLR4、Akt、p-Akt和βactin抗體，4℃孵育過(guò)夜。次日用TBST洗膜3次，每次10 min。加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗孵育1 h后，用TBST洗膜3次。最后加入ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影。使用ImageJ軟件分析各條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用

x

ˉ±

s

表示。兩組間比較采用

t

檢驗(yàn)，3組及以上采用單因素方差分析，率的比較采用

χ

檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，

P

＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TPHP對(duì)Raw264.7細(xì)胞活性的影響

CCK-8比色法檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。當(dāng)TPHP作用24 h時(shí)，200和400 μmol/L的TPHP對(duì)細(xì)胞活力的抑制率超過(guò)50%，而12.5、25、50 μmol/L的TPHP未引起明顯的細(xì)胞毒性作用(圖1A)。當(dāng)作用時(shí)間達(dá)到48 h，50 μmol/L及以上濃度的TPHP可顯著抑制細(xì)胞的存活率(

P

＜0.05，圖1B)。當(dāng)作用時(shí)間達(dá)到72 h，即使最低濃度的TPHP(12.5 μmol/L)也可引起巨噬細(xì)胞存活率明顯下降(

P

＜0.05，圖1C)。TPHP對(duì)Raw264.7細(xì)胞的毒性作用呈劑量依賴性(

r

=0.960，

P

＜0.05)和時(shí)間依賴性(

r

=0.980，

P

＜0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明隨著TPHP濃度和作用時(shí)間的增加，Raw264.7細(xì)胞的存活率逐漸降低。

圖1 不同濃度的TPHP處理Raw264.7細(xì)胞不同時(shí)間的細(xì)胞存活率比較

2.2 TPHP對(duì)Raw264.7細(xì)胞LDH釋放的影響

正常狀態(tài)下，LDH存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞膜的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的完整性被破壞后，LDH會(huì)穿過(guò)不完整的細(xì)胞膜滲漏到培養(yǎng)液中，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的LDH活性，可以反映細(xì)胞的損傷程度。LDH釋放率檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。與對(duì)照組相比，50～400 μmol/L組Raw264.7細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH水平均明顯升高(

P

＜0.05)。從作用時(shí)間來(lái)看，TPHP作用72 h后，即使是25 μmol/L的TPHP也會(huì)導(dǎo)致Raw264.7細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH水平升高(

P

＜0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明TPHP對(duì)Raw264.7細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性。

圖2 不同濃度的TPHP處理Raw264.7細(xì)胞不同時(shí)間的LDH釋放率比較

2.3 TPHP引起Raw264.7細(xì)胞形態(tài)改變

采用普通光學(xué)顯微鏡觀察TPHP處理Raw264.7細(xì)胞24 h后的形態(tài)變化，結(jié)果如圖3所示。對(duì)照組細(xì)胞呈規(guī)則圓形，體積小，貼壁緊密，生長(zhǎng)狀態(tài)良好(圖3A)。低濃度(25 μmol/L)TPHP處理后，細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組相比無(wú)明顯的差異，說(shuō)明低濃度TPHP對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)損害較小，這與CCK-8檢測(cè)結(jié)果一致(圖3B)。當(dāng)TPHP細(xì)胞濃度達(dá)到100 μmol/L，有較多細(xì)胞的細(xì)胞膜向外延伸呈不規(guī)則形，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，伸出較多偽足(圖3C)。以最大濃度(400 μmol/L)TPHP處理后，大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞膜向外延伸呈不規(guī)則形，有大量偽足(圖3D)，說(shuō)明高濃度的TPHP暴露會(huì)引起Raw264.7細(xì)胞發(fā)生分化。

圖3 不同濃度TPHP處理Raw264.7細(xì)胞24 h后的細(xì)胞形態(tài)變化(×40)

2.4 TPHP能夠增強(qiáng)Raw264.7細(xì)胞吞噬作用

當(dāng)TPHP的濃度≤50 μmol/L時(shí)對(duì)Raw264.7細(xì)胞的毒性較小，同時(shí)考慮染毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)對(duì)細(xì)胞造成非毒性傷害，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏倚，故選擇TPHP濃度為50 μmol/L、染毒時(shí)間為24 h進(jìn)行后續(xù)巨噬細(xì)胞吞噬作用及相關(guān)蛋白表達(dá)水平的測(cè)定。巨噬細(xì)胞的吞噬作用在維持非特異性免疫的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。本研究采用熒光微球法測(cè)定巨噬細(xì)胞的吞噬能力，結(jié)果如圖4所示。與對(duì)照組相比，當(dāng)TPHP濃度為25和50 μmol/L時(shí)，F(xiàn)ITC-A細(xì)胞的比例顯著增加，說(shuō)明較高濃度的TPHP能夠增強(qiáng)Raw264.7細(xì)胞的吞噬作用。

圖4 熒光微球法檢測(cè)不同濃度TPHP處理Raw264.7細(xì)胞24 h后的吞噬能力

2.5 TPHP促進(jìn)TLR4的表達(dá)及Akt、mTOR的磷酸化

TLR4是Toll樣受體家族的成員，表達(dá)于巨噬細(xì)胞膜上，在巨噬細(xì)胞發(fā)揮先天免疫激活中起重要作用。Western blot檢測(cè)結(jié)果見圖5，顯示隨著TPHP濃度的升高，TLR4的表達(dá)水平亦升高，與對(duì)照組相比，12.5～50 μmol/L TPHP處理組TLR4的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05或

P

＜0.01)，說(shuō)明不同濃度的TPHP均能夠激活巨噬細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)。為了進(jìn)一步研究TPHP對(duì)巨噬細(xì)胞活性和功能的影響，本研究還檢測(cè)了TPHP處理24 h后Akt和mTOR的表達(dá)情況，結(jié)果顯示TPHP可以促進(jìn)Akt和mTOR的磷酸化(

P

＜0.05)。以上結(jié)果表明TPHP可引起免疫相關(guān)蛋白的變化。

圖5 不同濃度的TPHP對(duì)Raw264.7細(xì)胞mTOR、TLR4和Akt蛋白表達(dá)的影響

3 討論

本研究以Raw264.7細(xì)胞作為研究對(duì)象，分析不同濃度TPHP在不同作用時(shí)間下的細(xì)胞毒性，通過(guò)普通光學(xué)顯微鏡觀察，借助流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球的能力，結(jié)合Western blot驗(yàn)證TLR4蛋白表達(dá)水平和Akt和mTOR的磷酸化水平。結(jié)果表明，TPHP對(duì)Raw264.7細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)細(xì)胞伸出偽足，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能，同時(shí)引起上述蛋白表達(dá)升高或觸發(fā)磷酸化水平。

由于TPHP通常以添加劑的形式存在于終產(chǎn)品中，很容易被釋放到自然界中。TPHP較難被降解，最終可通過(guò)空氣、水等媒介進(jìn)入人體，并在人體內(nèi)蓄積，產(chǎn)生潛在毒性作用。目前在室內(nèi)空氣、灰塵、土壤、污水處理廠排放液等環(huán)境介質(zhì)中均已檢測(cè)到了TPHP。研究顯示，TPHP的暴露會(huì)對(duì)浮游生物、魚類、底棲生物等造成傷害，如能夠抑制斜生柵藻和小球藻的生長(zhǎng)，導(dǎo)致稀有鮈鯽肝臟組織病理學(xué)變化、血腦屏障被破壞，使斑馬魚發(fā)育畸形、視力受損并干擾游泳行為等。環(huán)境介質(zhì)中的TPHP可通過(guò)呼吸、飲食、皮膚等進(jìn)入機(jī)體，在人或動(dòng)物體內(nèi)蓄積，并對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)、肝臟、腎臟、生殖系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)造成極大的威脅。陳敏等采用氣相色譜測(cè)定了TPHP通過(guò)尾靜脈暴露昆明小鼠后的組織分布，發(fā)現(xiàn)TPHP主要蓄積在小鼠脾臟、肝臟和腎臟中。研究顯示，TPHP對(duì)機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)具有毒性效應(yīng)。

巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，具有免疫防疫、免疫監(jiān)視、免疫調(diào)節(jié)、抗原呈遞等功能，在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和抵御微生物入侵過(guò)程中發(fā)揮重要作用。由于巨噬細(xì)胞已經(jīng)成功建系，體外傳代培養(yǎng)方法均已成熟，因此本研究選擇Raw264.7細(xì)胞系作為研究對(duì)象，探討TPHP對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性作用。本研究結(jié)果顯示，隨著TPHP暴露濃度和作用時(shí)間的增加，TPHP呈現(xiàn)明顯的毒性作用(

P

＜0.05)。當(dāng)作用時(shí)間為24 h時(shí)，較低濃度(12.5、25和50 μmol/L)的TPHP無(wú)明顯細(xì)胞毒性，但是當(dāng)作用時(shí)間達(dá)到72 h時(shí)，低濃度的TPHP也會(huì)顯著影響細(xì)胞的存活率。An等的研究發(fā)現(xiàn)高濃度(150和200 μmol/L)的TPHP可導(dǎo)致A549細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞的存活率降低，而低于100 μmol/L的TPHP則對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響。Canbaz等發(fā)現(xiàn)濃度高于50 μmol/L的TPHP對(duì)小鼠骨髓來(lái)源的樹突狀細(xì)胞具有明顯細(xì)胞毒性。以上研究與我們的檢測(cè)結(jié)果基本一致。

吞噬能力是反映巨噬細(xì)胞免疫防御能力的一個(gè)重要指標(biāo)。我們測(cè)定了較低濃度(12.5、25和50 μmol/L)的TPHP作用24 h對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)25和50 μmol/L的TPHP能增強(qiáng)Raw264.7細(xì)胞的吞噬功能。TLR4是巨噬細(xì)胞膜上大量表達(dá)的模式識(shí)別受體，其異常激活后會(huì)引發(fā)巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，從而激活固有和獲得性免疫系統(tǒng)來(lái)清除異物。本研究檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)TPHP能夠促進(jìn)細(xì)胞膜表面TLR4的表達(dá)。TLR4可以通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和運(yùn)動(dòng)。PI3K是細(xì)胞內(nèi)的重要信號(hào)傳導(dǎo)分子，激活后的PI3K可以作為第二信使激活A(yù)kt，活化的Akt可以調(diào)節(jié)下游的效應(yīng)因子mTOR，進(jìn)而影響固有免疫細(xì)胞的生存、遷移和分泌相關(guān)炎癥因子。在免疫細(xì)胞中，mTOR調(diào)節(jié)新陳代謝以決定細(xì)胞的活性、增殖和效應(yīng)功能。本研究顯示TPHP可促進(jìn)Raw264.7巨噬細(xì)胞Akt和mTOR的磷酸化，說(shuō)明TPHP能夠通過(guò)TLR4/Akt/mTOR信號(hào)通路影響巨噬細(xì)胞的功能。研究顯示，PI3K/Akt信號(hào)通路能夠進(jìn)一步激活下游的mTOR，而mTOR是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的作用，能夠影響固有免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞等的增殖、遷移和效應(yīng)功能。Lee等的研究結(jié)果指出，TLR4-mTORC1調(diào)控膜脂質(zhì)筏和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架之間的聚合與解聚，介導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬作用。但是，本研究?jī)H檢測(cè)了TPHP對(duì)巨噬細(xì)胞Raw264.7的細(xì)胞毒性、吞噬功能以及TLR4、Akt和mTOR蛋白的表達(dá)，并未驗(yàn)證相關(guān)信號(hào)通路的作用。因此，在后續(xù)研究中將會(huì)使用阻斷劑來(lái)檢測(cè)TPHP是否通過(guò)影響TLR4/Akt/mTOR信號(hào)通路進(jìn)而影響巨噬細(xì)胞的吞噬作用等功能。

綜上所述，本研究采用不同濃度TPHP處理巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TPHP可抑制巨噬細(xì)胞的活力、損傷細(xì)胞膜的完整性，還可引起TLR4蛋白表達(dá)水平升高，Akt和mTOR磷酸化水平升高，通過(guò)TLR4、Akt和mTOR蛋白調(diào)控巨噬細(xì)胞的功能，為進(jìn)一步研究TPHP誘導(dǎo)Raw264.7巨噬細(xì)胞功能改變的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為OPFRs的污染防控提供了基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)。