張梓涵,李 麗,張文鋒,張艷超,陳慧玲,石 明,2,*
(1.廣東醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,東莞市環(huán)境醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 東莞523808;2.廣東醫(yī)科大學(xué)寮步醫(yī)院,廣東 東莞523400)
隨著鹵代阻燃劑在全球范圍內(nèi)被逐步禁用,有機(jī)磷阻燃劑(organophosphorus flame retardants,OPFRs)因其價格低、品種多、阻燃效果好等優(yōu)點(diǎn),被應(yīng)用于建筑材料、家具、紡織用品、電子產(chǎn)品等行業(yè),并廣泛存在于生態(tài)環(huán)境中。磷酸三苯酯(triphenyl phosphate,TPHP)是一種典型的芳香基OPFRs,在各類工業(yè)產(chǎn)品中被廣泛用作增塑劑和阻燃劑。但是,TPHP具有較高的揮發(fā)性和親脂性,在生產(chǎn)和使用過程中容易從材料中通過揮發(fā)、滲出等方式釋放,并持久存在于環(huán)境中。由于TPHP難降解,在環(huán)境中存留時間較長,在生物體內(nèi)具有富集效應(yīng),對人體健康和環(huán)境安全具有較大威脅,其毒性研究受到了人們的廣泛關(guān)注。
免疫系統(tǒng)作為機(jī)體執(zhí)行免疫應(yīng)答及免疫功能的重要系統(tǒng),參與協(xié)助各系統(tǒng)發(fā)揮正常的生理功能,對外源性化學(xué)物較敏感。TPHP可引起某些免疫細(xì)胞的損傷,誘導(dǎo)過敏性接觸性超敏反應(yīng),但目前對其引發(fā)的具體免疫毒性作用及機(jī)制尚未見報道。巨噬細(xì)胞是構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分之一,具有趨化性運(yùn)動、吞噬、分泌和抗原呈遞等功能,在巨噬細(xì)胞吞噬過程中,最為顯著的特點(diǎn)是在吞噬體周圍出現(xiàn)絲狀肌動蛋白F-actin的局部快速積聚與相關(guān)蛋白在吞噬體周圍分布。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)是巨噬細(xì)胞的表面模式識別受體之一,被激活后可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子,啟動巨噬細(xì)胞的免疫防御功能和吞噬功能。TLR4的激活能夠引起磷脂酰肌醇-3-激 酶(PI3K)-絲/蘇 氨 酸 激 酶(serine/threonine kinase,Akt)-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號軸的激活,其中PI3K/Akt信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞活化、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞存活和凋亡中發(fā)揮著中心作用。
因此,本研究以小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7為研究對象,通過檢測TPHP對巨噬細(xì)胞的存活率、細(xì)胞毒性和吞噬功能的影響,探討TPHP暴露對免疫系統(tǒng)的毒性作用和潛在機(jī)制,為TPHP暴露對免疫系統(tǒng)影響和毒性風(fēng)險提供參考。
DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)、CCK-8試劑均購自Gibco公司;乳酸脫氫酶釋放檢測試劑盒(CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)購自Promega公司;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司;牛血清白蛋白(BSA)購 自Sigma公 司;TLR4、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR抗體購自Cell Signaling Technology公司;ECL發(fā)光液購自ThermoFisher Scientific公司;Phagocytosis Assay Kit(IgG-FITC)購自Cayman公司。
小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7為廣東醫(yī)科大學(xué)閆沖教授惠贈。在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,于37℃、CO體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。定時觀察培養(yǎng)基顏色和細(xì)胞狀態(tài),及時更換新鮮培養(yǎng)基和傳代培養(yǎng)。將細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁狀態(tài),于普通光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝細(xì)胞的形態(tài)和偽足。
D
(450)。按如下公式計算細(xì)胞存活率:D
(490)。LDH釋放率用如下公式計算:將Raw264.7細(xì)胞均勻接種于6孔板中,待細(xì)胞貼壁后,加入不同濃度(0、12.5、25和50 μmol/L)的TPHP繼續(xù)孵育24 h,加入FITC標(biāo)記的熒光微球(用含5% BSA的TBST緩沖液按1∶500稀釋),在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h,期間每隔30 min振動培養(yǎng)板。棄去培養(yǎng)基,用1 mL預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞后,加入0.2%臺盼藍(lán)淬滅吸附在細(xì)胞表面的熒光,再用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次,采用流式細(xì)胞術(shù)測量吞噬熒光微球陽性細(xì)胞的數(shù)目及比例。
不同濃度(0、12.5、25和50 μmol/L)TPHP處理Raw264.7細(xì)胞24 h后,用PBS洗滌細(xì)胞2次,再加入細(xì)胞裂解混合液(細(xì)胞裂解液、磷酸酶抑制劑、PMSF的體積比為100∶1∶1),冰上裂解30 min后刮取細(xì)胞,超聲充分破碎,4℃、12 000 r/min離心10 min,吸取上清液,采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后,加入5×上樣緩沖液,100℃煮沸5 min制備蛋白樣品。各組取30 μg的蛋白于5%的濃縮膠、8%的分離膠進(jìn)行電泳,電壓調(diào)至80 V,當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠,更換100 V電壓。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5% BSA室溫封閉PVDF膜2 h后,分別加入mTOR、p-mTOR、TLR4、Akt、p-Akt和βactin抗體,4℃孵育過夜。次日用TBST洗膜3次,每次10 min。加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗孵育1 h后,用TBST洗膜3次。最后加入ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影。使用ImageJ軟件分析各條帶灰度值,計算目的蛋白的相對表達(dá)水平。
x
ˉ±s
表示。兩組間比較采用t
檢驗(yàn),3組及以上采用單因素方差分析,率的比較采用χ
檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,P
<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。P
<0.05,圖1B)。當(dāng)作用時間達(dá)到72 h,即使最低濃度的TPHP(12.5 μmol/L)也可引起巨噬細(xì)胞存活率明顯下降(P
<0.05,圖1C)。TPHP對Raw264.7細(xì)胞的毒性作用呈劑量依賴性(r
=0.960,P
<0.05)和時間依賴性(r
=0.980,P
<0.05)。以上結(jié)果說明隨著TPHP濃度和作用時間的增加,Raw264.7細(xì)胞的存活率逐漸降低。圖1 不同濃度的TPHP處理Raw264.7細(xì)胞不同時間的細(xì)胞存活率比較
P
<0.05)。從作用時間來看,TPHP作用72 h后,即使是25 μmol/L的TPHP也會導(dǎo)致Raw264.7細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH水平升高(P
<0.05)。以上結(jié)果說明TPHP對Raw264.7細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性。圖2 不同濃度的TPHP處理Raw264.7細(xì)胞不同時間的LDH釋放率比較
采用普通光學(xué)顯微鏡觀察TPHP處理Raw264.7細(xì)胞24 h后的形態(tài)變化,結(jié)果如圖3所示。對照組細(xì)胞呈規(guī)則圓形,體積小,貼壁緊密,生長狀態(tài)良好(圖3A)。低濃度(25 μmol/L)TPHP處理后,細(xì)胞形態(tài)與對照組相比無明顯的差異,說明低濃度TPHP對細(xì)胞結(jié)構(gòu)損害較小,這與CCK-8檢測結(jié)果一致(圖3B)。當(dāng)TPHP細(xì)胞濃度達(dá)到100 μmol/L,有較多細(xì)胞的細(xì)胞膜向外延伸呈不規(guī)則形,細(xì)胞呈長梭形,伸出較多偽足(圖3C)。以最大濃度(400 μmol/L)TPHP處理后,大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞膜向外延伸呈不規(guī)則形,有大量偽足(圖3D),說明高濃度的TPHP暴露會引起Raw264.7細(xì)胞發(fā)生分化。
圖3 不同濃度TPHP處理Raw264.7細(xì)胞24 h后的細(xì)胞形態(tài)變化(×40)
當(dāng)TPHP的濃度≤50 μmol/L時對Raw264.7細(xì)胞的毒性較小,同時考慮染毒時間過長會對細(xì)胞造成非毒性傷害,造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏倚,故選擇TPHP濃度為50 μmol/L、染毒時間為24 h進(jìn)行后續(xù)巨噬細(xì)胞吞噬作用及相關(guān)蛋白表達(dá)水平的測定。巨噬細(xì)胞的吞噬作用在維持非特異性免疫的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。本研究采用熒光微球法測定巨噬細(xì)胞的吞噬能力,結(jié)果如圖4所示。與對照組相比,當(dāng)TPHP濃度為25和50 μmol/L時,F(xiàn)ITC-A細(xì)胞的比例顯著增加,說明較高濃度的TPHP能夠增強(qiáng)Raw264.7細(xì)胞的吞噬作用。
圖4 熒光微球法檢測不同濃度TPHP處理Raw264.7細(xì)胞24 h后的吞噬能力
P
<0.05或P
<0.01),說明不同濃度的TPHP均能夠激活巨噬細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)。為了進(jìn)一步研究TPHP對巨噬細(xì)胞活性和功能的影響,本研究還檢測了TPHP處理24 h后Akt和mTOR的表達(dá)情況,結(jié)果顯示TPHP可以促進(jìn)Akt和mTOR的磷酸化(P
<0.05)。以上結(jié)果表明TPHP可引起免疫相關(guān)蛋白的變化。圖5 不同濃度的TPHP對Raw264.7細(xì)胞mTOR、TLR4和Akt蛋白表達(dá)的影響
本研究以Raw264.7細(xì)胞作為研究對象,分析不同濃度TPHP在不同作用時間下的細(xì)胞毒性,通過普通光學(xué)顯微鏡觀察,借助流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球的能力,結(jié)合Western blot驗(yàn)證TLR4蛋白表達(dá)水平和Akt和mTOR的磷酸化水平。結(jié)果表明,TPHP對Raw264.7細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性,誘導(dǎo)細(xì)胞伸出偽足,增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能,同時引起上述蛋白表達(dá)升高或觸發(fā)磷酸化水平。
由于TPHP通常以添加劑的形式存在于終產(chǎn)品中,很容易被釋放到自然界中。TPHP較難被降解,最終可通過空氣、水等媒介進(jìn)入人體,并在人體內(nèi)蓄積,產(chǎn)生潛在毒性作用。目前在室內(nèi)空氣、灰塵、土壤、污水處理廠排放液等環(huán)境介質(zhì)中均已檢測到了TPHP。研究顯示,TPHP的暴露會對浮游生物、魚類、底棲生物等造成傷害,如能夠抑制斜生柵藻和小球藻的生長,導(dǎo)致稀有鮈鯽肝臟組織病理學(xué)變化、血腦屏障被破壞,使斑馬魚發(fā)育畸形、視力受損并干擾游泳行為等。環(huán)境介質(zhì)中的TPHP可通過呼吸、飲食、皮膚等進(jìn)入機(jī)體,在人或動物體內(nèi)蓄積,并對內(nèi)分泌系統(tǒng)、肝臟、腎臟、生殖系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)造成極大的威脅。陳敏等采用氣相色譜測定了TPHP通過尾靜脈暴露昆明小鼠后的組織分布,發(fā)現(xiàn)TPHP主要蓄積在小鼠脾臟、肝臟和腎臟中。研究顯示,TPHP對機(jī)體多個系統(tǒng)具有毒性效應(yīng)。
巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞,具有免疫防疫、免疫監(jiān)視、免疫調(diào)節(jié)、抗原呈遞等功能,在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和抵御微生物入侵過程中發(fā)揮重要作用。由于巨噬細(xì)胞已經(jīng)成功建系,體外傳代培養(yǎng)方法均已成熟,因此本研究選擇Raw264.7細(xì)胞系作為研究對象,探討TPHP對巨噬細(xì)胞的毒性作用。本研究結(jié)果顯示,隨著TPHP暴露濃度和作用時間的增加,TPHP呈現(xiàn)明顯的毒性作用(P
<0.05)。當(dāng)作用時間為24 h時,較低濃度(12.5、25和50 μmol/L)的TPHP無明顯細(xì)胞毒性,但是當(dāng)作用時間達(dá)到72 h時,低濃度的TPHP也會顯著影響細(xì)胞的存活率。An等的研究發(fā)現(xiàn)高濃度(150和200 μmol/L)的TPHP可導(dǎo)致A549細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞的存活率降低,而低于100 μmol/L的TPHP則對細(xì)胞存活率無明顯影響。Canbaz等發(fā)現(xiàn)濃度高于50 μmol/L的TPHP對小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞具有明顯細(xì)胞毒性。以上研究與我們的檢測結(jié)果基本一致。吞噬能力是反映巨噬細(xì)胞免疫防御能力的一個重要指標(biāo)。我們測定了較低濃度(12.5、25和50 μmol/L)的TPHP作用24 h對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)25和50 μmol/L的TPHP能增強(qiáng)Raw264.7細(xì)胞的吞噬功能。TLR4是巨噬細(xì)胞膜上大量表達(dá)的模式識別受體,其異常激活后會引發(fā)巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì),從而激活固有和獲得性免疫系統(tǒng)來清除異物。本研究檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)TPHP能夠促進(jìn)細(xì)胞膜表面TLR4的表達(dá)。TLR4可以通過PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng),參與細(xì)胞的生長、增殖、分化和運(yùn)動。PI3K是細(xì)胞內(nèi)的重要信號傳導(dǎo)分子,激活后的PI3K可以作為第二信使激活A(yù)kt,活化的Akt可以調(diào)節(jié)下游的效應(yīng)因子mTOR,進(jìn)而影響固有免疫細(xì)胞的生存、遷移和分泌相關(guān)炎癥因子。在免疫細(xì)胞中,mTOR調(diào)節(jié)新陳代謝以決定細(xì)胞的活性、增殖和效應(yīng)功能。本研究顯示TPHP可促進(jìn)Raw264.7巨噬細(xì)胞Akt和mTOR的磷酸化,說明TPHP能夠通過TLR4/Akt/mTOR信號通路影響巨噬細(xì)胞的功能。研究顯示,PI3K/Akt信號通路能夠進(jìn)一步激活下游的mTOR,而mTOR是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,在維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的作用,能夠影響固有免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞等的增殖、遷移和效應(yīng)功能。Lee等的研究結(jié)果指出,TLR4-mTORC1調(diào)控膜脂質(zhì)筏和肌動蛋白細(xì)胞骨架之間的聚合與解聚,介導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬作用。但是,本研究僅檢測了TPHP對巨噬細(xì)胞Raw264.7的細(xì)胞毒性、吞噬功能以及TLR4、Akt和mTOR蛋白的表達(dá),并未驗(yàn)證相關(guān)信號通路的作用。因此,在后續(xù)研究中將會使用阻斷劑來檢測TPHP是否通過影響TLR4/Akt/mTOR信號通路進(jìn)而影響巨噬細(xì)胞的吞噬作用等功能。
綜上所述,本研究采用不同濃度TPHP處理巨噬細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)TPHP可抑制巨噬細(xì)胞的活力、損傷細(xì)胞膜的完整性,還可引起TLR4蛋白表達(dá)水平升高,Akt和mTOR磷酸化水平升高,通過TLR4、Akt和mTOR蛋白調(diào)控巨噬細(xì)胞的功能,為進(jìn)一步研究TPHP誘導(dǎo)Raw264.7巨噬細(xì)胞功能改變的機(jī)制奠定了基礎(chǔ),也為OPFRs的污染防控提供了基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)。