王佳敏，劉建新，孟慶賀，郝衛(wèi)東*

(北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)系，食品安全毒理學(xué)研究與評價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100191)

稀土元素(rare earth elements，REEs)是指元素周期表中ⅢB族中的17種化學(xué)元素。稀土廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)藥業(yè)等行業(yè)，是我國重要的戰(zhàn)略資源。近幾年，稀土元素在茶葉中的暴露情況受到廣泛關(guān)注。稀土微肥通常作為葉面肥使用，農(nóng)用稀土肥料主要采用較易溶解于水的稀土元素硝酸鹽類化合物，使得稀土元素進(jìn)入了各種茶葉中，農(nóng)用稀土通過茶樹的根莖等進(jìn)入葉片部分進(jìn)行富集并在葉片中殘留，致使普通人群日益頻繁地接觸到稀土元素。研究表明茶葉中稀土元素鈰(Ce)、鑭(La)、釔(Y)的平均含量相對較高。

釔在地殼中的質(zhì)量豐度約為33 mg/kg，是稀土元素中含量最豐富的元素之一。自然界40%的釔存在于中國，主要分布于中國東北、湖南、兩廣、滇川和西北。釔是第一個被發(fā)現(xiàn)的稀土金屬元素，可用于制特種玻璃和合金。常見化合物是氧化釔和鹵化釔，與其他元素化合主要呈正二價(jià)或正三價(jià)態(tài)，所形成的化合物具有高熔點(diǎn)、熱穩(wěn)定性好以及良好的發(fā)光輻射性能等特點(diǎn)。

以往關(guān)于稀土元素的神經(jīng)毒性研究，關(guān)注鑭元素較多，釔及其化合物相對較少。已有的一些研究發(fā)現(xiàn)，釔及其化合物能夠破壞血腦屏障、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞過度凋亡、改變神經(jīng)遞質(zhì)含量、損傷學(xué)習(xí)記憶能力，對神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷。本研究通過觀察硝酸釔亞慢性(90 d)暴露對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，以谷氨酸(glutamate，Glu)及N-甲基-D-冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA)蛋白表達(dá)為基礎(chǔ)探究其可能的作用機(jī)制，旨在為稀土元素釔的風(fēng)險(xiǎn)評估提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

本研究的主要試劑有：硝酸釔(Ⅲ)四水合物[Yttrium(Ⅲ)nitrate tetrahydrate，Y(NO)·4HO，純 度99.99%，上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司]，NMDA R1抗 體 和NMDA R2A抗 體(英 國Abcam公司)，NMDA R2B抗體、大鼠谷氨酸比色法測試盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)，β-actin抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(美國Cell Signaling Technology公司)，BCA蛋白檢測試劑盒(中國賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

本研究使用的實(shí)驗(yàn)儀器有：高速冷凍離心機(jī)(Sigma 3-18KS型，德國Sartorius公司)；多功能組織勻漿儀(FastPrep-24型，美國MP Biomedicals公司)；超聲細(xì)胞破碎儀(VIRSONIC 100型，美國VIRTIS公司)；垂直凝膠電泳系統(tǒng)(Mini-PROTEN Tetra cell型，美國Bio-Rad公司)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)(MINI HD9型，英國UVITEC公司)；微量分光光度計(jì)(NanoPhotometer N50 Touch型，德 國IMPLEN公 司)；正置熒光顯微鏡(BX43型，日本Olympus公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物處理

選用剛離乳(PND21)的無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級SD大 鼠，質(zhì) 量45～55 g，雌性，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部提供，動物使用許可證號：SCXK(京)2016-0010。動物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中，溫度20～25℃，相對濕度40%～70%。光照條件為12 h/12 h明暗交替循環(huán)，動物自由飲水及進(jìn)食。動物實(shí)驗(yàn)符合動物福利和北京大學(xué)動物倫理委員會相關(guān)規(guī)定并通過倫理委員會審查。

參照經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)GD-424推薦的動物神經(jīng)行為毒性評價(jià)實(shí)驗(yàn)方法。大鼠在5 d適應(yīng)期后，根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，分別為對照組(ddHO)，Y(NO)低 劑 量 組(10 mg/kg)、中 劑 量 組(40 mg/kg)和高劑量組(160 mg/kg)，每組15只。

1.4 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.4.1 曠場實(shí)驗(yàn)

將體積為100 cm(長)×100 cm(寬)×50 cm(高)的曠場裝置放置在隔音的房間內(nèi)，嚴(yán)格控制室內(nèi)溫度和通風(fēng)，選用弱光照明。實(shí)驗(yàn)者與設(shè)備保持一定距離。將動物放置于曠場中央，曠場地面被分成若干網(wǎng)格，記錄5 min內(nèi)動物的活動參數(shù)：水平運(yùn)動距離、垂直運(yùn)動距離、直立次數(shù)、梳理次數(shù)，以及動物的典型行為(如舔、咬等)的次數(shù)。分別以曠場中央和周圍來計(jì)算以上指標(biāo)，動物在中央的活動次數(shù)反映了焦慮程度，即中央活動次數(shù)越多焦慮越少。

1.4.2 高架十字迷宮

高架十字迷宮包括兩個開放臂和兩個封閉臂，四者形成十字的形狀，每個臂長47 cm，寬15 cm，兩個封閉臂有高40 cm的壁。動物置于迷宮中央，面向其中一個開放的臂。讓動物自由探索四個臂5 min，記錄動物第1次進(jìn)入任何臂的潛伏期，以動物四肢都進(jìn)入一個臂算作進(jìn)入1次。每只動物只檢測1次，如果在試驗(yàn)過程中動物跌落，則淘汰該數(shù)據(jù)。計(jì)算動物進(jìn)入開臂次數(shù)和在開臂滯留時間分別占總次數(shù)(進(jìn)入開臂和閉臂次數(shù)之和)和總時間(在開臂和閉臂滯留時間之和)的百分比，以此作為評價(jià)焦慮的指標(biāo)。

1.4.3 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)的裝置為無頂木箱，箱內(nèi)有可轉(zhuǎn)動的防滑材質(zhì)的轉(zhuǎn)棒。試驗(yàn)前1 d，將大鼠置于轉(zhuǎn)棒上以4 r/min的速度適應(yīng)60 s，直到大鼠在轉(zhuǎn)棒上60 s不跌落。測試當(dāng)天，將大鼠置于轉(zhuǎn)棒上，300 s內(nèi)轉(zhuǎn)速從4 r/min加速到40 r/min。記錄大鼠從竿上跌落的旋轉(zhuǎn)速度和潛伏期，并取3次試驗(yàn)的平均值。

1.4.4

Morris

水迷宮實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)裝置放置在安靜寬敞的房間內(nèi)，在墻壁上懸掛一些圓形、三角形等物體作為動物的視覺線索。在設(shè)備周圍拉上黑色圍簾以阻隔實(shí)驗(yàn)者和受試動物。將實(shí)驗(yàn)裝置分為4個象限，內(nèi)注入自來水，水高23 cm，水溫保持在(25.0±1.0)℃；于其中西北(NW)象限中心置一圓形平臺，直徑10 cm，位于水面下1.5～2.0 cm。實(shí)驗(yàn)包括：①定位航向?qū)嶒?yàn)：平臺置于水面下1.5～2.0 cm，將大鼠隨機(jī)地頭朝池壁，按東北(NE)、西北(NW)、東南(SE)、西南(SW)4個入水點(diǎn)輕輕放入水池中。每次試驗(yàn)中每只大鼠最多游泳90 s，讓其找到水中隱藏的平臺，記錄大鼠自入水至找到平臺四肢爬上平臺所需的時間，作為逃避潛伏期。大鼠爬上平臺后，讓其停留30 s；若入水后給定時間內(nèi)未能找到平臺或未能爬上平臺，則將時間記錄為90 s，并且將其人為放置于平臺上30 s，然后從平臺上取下休息30 s，再進(jìn)行下一次訓(xùn)練。按此方法每只動物每天訓(xùn)練4次，連續(xù)訓(xùn)練4 d。②空間探索實(shí)驗(yàn)：最后一次定位航行實(shí)驗(yàn)后24 h，撤除平臺。將動物從任一隨機(jī)象限放入水中追蹤其運(yùn)動軌跡60 s，連續(xù)測試兩次；記錄動物目標(biāo)象限(原先放置平臺的象限)的游泳時間、游泳距離、進(jìn)入目標(biāo)象限的次數(shù)，以及穿過原平臺位置的次數(shù)。

1.5 谷氨酸含量檢測

行為學(xué)檢測后，采用股動脈放血法處死動物，迅速斷頭取腦，冰上快速分離出大腦皮質(zhì)和雙側(cè)海馬，-80℃冰箱凍存待用。使用大鼠谷氨酸比色法測試盒，按照試劑盒說明書操作，檢測雌鼠大腦皮質(zhì)和海馬中谷氨酸的含量。

1.6 N-甲基-D-天冬氨酸受體蛋白表達(dá)檢測

采用Western blot法。取0.05 g海馬組織加入300 μL RIPA(臨用前按1∶100加入PMSF)，勻漿儀破碎組織，4℃14 000g離心5 min，取上清，PBS稀釋后，用BCA法測定總蛋白濃度，-80℃冰箱凍存。經(jīng)8% SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，TBST緩沖液洗滌后，一抗稀釋液孵育，4℃水平輕搖過夜。所用抗體滴度：β-actin、NMDA R2A、NMDA R2B均為1∶1 000，NMDA R1為1∶5 000。TBST洗滌后，抗兔二抗稀釋液(滴度1∶2 000)室溫下孵育2 h。ECL發(fā)光，運(yùn)用化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖片，ImageJ軟件測定條帶像素值，以β-actin為內(nèi)參蛋白，計(jì)算得到目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 大鼠腦組織病理組織學(xué)檢查

各暴露組取5只雌鼠，進(jìn)行原位灌注后斷頭取腦，4%多聚甲醛溶液中浸泡固定腦組織24 h。經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理后，對腦組織標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下對腦組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以

x

ˉ±

s

表示，采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用雙因素重復(fù)測量方差分析(two-way repeated measures ANOVA)比較定位航向?qū)嶒?yàn)的學(xué)習(xí)曲線(劑量組×訓(xùn)練天數(shù))。對于其他指標(biāo)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，各劑量組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，實(shí)驗(yàn)組與對照組間采用LSD-

t

檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，

P

＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

見表1。硝酸釔90 d暴露后，曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，各硝酸釔暴露組大鼠的水平運(yùn)動距離、直立次數(shù)、梳理次數(shù)、中央?yún)^(qū)運(yùn)動時間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＞0.05)；高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，各硝酸釔暴露組大鼠的進(jìn)入開臂次數(shù)[進(jìn)入開臂次數(shù)/(進(jìn)入開臂次數(shù)+進(jìn)入閉臂次數(shù))]、進(jìn)入開臂時間(進(jìn)入開臂時間/總時間)、開臂中運(yùn)動距離(開臂中運(yùn)動距離/總運(yùn)動距離)的百分比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＞0.05)；轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，160 mg/(kg·d)硝酸釔暴露組大鼠的在棒時間、在棒圈數(shù)、掉落速度均明顯升高(

P

＜0.05)。

表1 硝酸釔90 d暴露對雌鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響(n=10)

2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

硝酸釔90 d暴露對雌鼠定位航向?qū)嶒?yàn)結(jié)果的影響如圖1所示，隨著訓(xùn)練時間的延長，與第1天相比，對照組及各硝酸釔暴露組大鼠的逃避潛伏期與總航行距離均明顯降低(

P

＜0.05)。與對照組相比，訓(xùn)練第4天時，40、160 mg/(kg·d)硝酸釔暴露組大鼠逃避潛伏期明顯縮短(

P

＜0.05)。

圖1 硝酸釔90 d暴露對雌鼠定位航向?qū)嶒?yàn)結(jié)果的影響(n=10)

硝酸釔90 d暴露對雌鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響如表2所示，與對照組相比，40 mg/(kg·d)硝酸釔暴露組大鼠穿越平臺次數(shù)、目標(biāo)象限游泳時間、目標(biāo)象限游泳時間百分比(目標(biāo)象限游泳時間/總時間)時間明顯升高(

P

＜0.05)；160 mg/(kg·d)硝酸釔暴露組大鼠穿越平臺次數(shù)、進(jìn)入目標(biāo)象限次數(shù)、目標(biāo)象限游泳時間明顯升高(

P

＜0.05)；各硝酸釔暴露組大鼠的目標(biāo)象限游泳時間、目標(biāo)象限游泳距離、目標(biāo)象限游泳距離百分比(目標(biāo)象限游泳距離/總游泳距離)、總游泳距離、游泳平均速度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P＞

0.05)。

表2 硝酸釔90 d暴露對雌鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響(n=10)

硝酸釔90 d暴露對雌鼠空間探索實(shí)驗(yàn)各個象限結(jié)果的影響如圖2所示，與目標(biāo)象限NW象限的逃避潛伏期相比，對照組大鼠NE、SE象限的逃避潛伏期明顯高于NW象限的逃避潛伏期(

P

＜0.05)；40 mg/(kg·d)硝酸釔暴露組大鼠SW象限的逃避潛伏期明顯低于NW象限的逃避潛伏期(

P

＜0.05)；160 mg/(kg·d)硝酸釔暴露組大鼠NE、SW、SE象限的逃避潛伏期明顯低于NW象限的逃避潛伏期(

P

＜0.05)。

圖2 硝酸釔90 d暴露對雌鼠空間探索實(shí)驗(yàn)各個象限中結(jié)果的影響(n=10)

2.3 大鼠腦谷氨酸含量檢測結(jié)果

硝酸釔90 d暴露對雌鼠大腦皮質(zhì)及海馬中Glu含量的影響如圖3所示，與對照組相比，各硝酸釔暴露組大鼠大腦皮質(zhì)中Glu含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P＞

0.05)；而160 mg/(kg·d)硝酸釔暴露組大鼠海馬中Glu含量顯著降低(

P

＜0.05)。

圖3 硝酸釔90 d暴露對雌鼠大腦皮質(zhì)及海馬中Glu含量的影響(n=10)

2.4 離子型谷氨酸受體蛋白表達(dá)檢測結(jié)果

硝酸釔90 d暴露對雌鼠海馬中NMDA受體R1、R2A、R2B蛋白表達(dá)的影響如圖4所示，與對照組相比，40 mg/(kg·d)硝酸釔暴露組大鼠海馬中NMDA受體R2A含量和160 mg/(kg·d)硝酸釔暴露組大鼠海馬中NMDA受體R1、R2A含量均顯著降低(

P

＜0.05)。

圖4 硝酸釔90 d暴露對雌鼠海馬中NMDA受體蛋白表達(dá)的影響(n=10)

2.5 大鼠海馬組織HE染色結(jié)果

硝酸釔90 d暴露對雌鼠海馬組織結(jié)構(gòu)的影響如圖5所示。在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，與對照組相比，各硝酸釔暴露組海馬組織均未見形態(tài)學(xué)異?，F(xiàn)象，海馬各區(qū)神經(jīng)元呈圓形、橢圓形或錐形，細(xì)胞核為原型或橢圓形，著色均勻?yàn)闇\藍(lán)紫色，核仁明顯，神經(jīng)元數(shù)量正常；其中錐體細(xì)胞、齒狀回顆粒細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞輪廓于周圍組織分界清晰。海馬神經(jīng)元形態(tài)基本完整，分布規(guī)則，數(shù)量無明顯變化，細(xì)胞核未見明顯異常。此結(jié)果提示硝酸釔90 d暴露不會對雌鼠海馬組織造成病理學(xué)改變。

圖5 硝酸釔90 d暴露對雌鼠海馬組織結(jié)構(gòu)的影響(×400)

3 討論

Morris水迷宮由英國生理學(xué)家Morris于1984年發(fā)明，目的是用于評估嚙齒動物的腦學(xué)習(xí)記憶，目前被廣泛應(yīng)用于評價(jià)動物的空間學(xué)習(xí)與記憶能力。本研究結(jié)果顯示，定位航行實(shí)驗(yàn)的第4天訓(xùn)練中，與對照組相比，40、160 mg/(kg·d)劑量組雌鼠的逃避潛伏期均顯著降低(

P

＜0.05)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)中，與對照組相比，40、160 mg/(kg·d)劑量組雌鼠的穿越原平臺所在位置次數(shù)、目標(biāo)象限中游泳時間均顯著升高(

P

＜0.05)，說明中、高劑量組雌鼠對原平臺所在位置的記憶更加深刻。對于空間探索實(shí)驗(yàn)的逃避潛伏期，各劑量組雌鼠在不同象限中的停留時間有所差異。對照組雌鼠在目標(biāo)象限中停留時間顯著低于另外兩個象限，而160 mg/(kg·d)劑量組雌鼠在目標(biāo)象限中停留時間顯著高于剩余3個象限，由此可見對照組雌鼠對原平臺位置的記憶能力低于160 mg/(kg·d)劑量組雌鼠。本研究結(jié)果提示40、160 mg/(kg·d)劑量的硝酸釔亞慢性暴露可引起雌性大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的增強(qiáng)，且隨著暴露劑量的增高，大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力也隨之增高。學(xué)習(xí)和記憶是機(jī)體大腦的復(fù)雜神經(jīng)生理活動，而海馬對于空間記憶的產(chǎn)生與維持具有重要意義。海馬中谷氨酸(Glu)是重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，可以激活突觸后膜上NMDA受體(NMDARs)，此過程與神經(jīng)元突觸可塑性、學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)。一般認(rèn)為，NMDA受體表達(dá)減少可能導(dǎo)致大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的減弱，但本研究結(jié)果顯示，硝酸釔的亞慢性(90 d)暴露促進(jìn)了雌性大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，與對照組相比，160 mg/(kg·d)劑量組海馬中Glu含量顯著降低，40 mg/(kg·d)劑量組海馬中R2A含量顯著降低(

P

＜0.05)；160 mg/(kg·d)劑量組海馬中R1、R2A含量顯著降低(

P

＜0.05)，因此關(guān)于硝酸釔影響雌性大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入研究。另外，近年來由于NMDA受體過度活化與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病存在密切關(guān)系，對開發(fā)靶向NMDA受體的藥物一直備受重視。多項(xiàng)研究表明，NMDAR拮抗劑在動物已經(jīng)獲得學(xué)習(xí)記憶后給藥，在大鼠進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練后，將NMDAR拮抗劑注入大鼠海馬，可以提高大鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中的空間記憶能力。因此，抑制NMDA受體表達(dá)也有可能保護(hù)大鼠對空間學(xué)習(xí)記憶能力的維持，但是這與硝酸釔影響雌性大鼠神經(jīng)行為功能的機(jī)制是否有關(guān)，仍需要進(jìn)一步的探索。

本研究根據(jù)OECD424準(zhǔn)則，評價(jià)硝酸釔對雌性大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，發(fā)現(xiàn)40、160 mg/(kg·d)劑量組雌鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力提高，160 mg/(kg·d)劑量組雌鼠海馬組織中Glu含量與NMDA R1受體蛋白表達(dá)均顯著降低；40、160 mg/(kg·d)劑量組雌鼠海馬組織中NMDA R2A受體蛋白表達(dá)顯著降低，提示硝酸釔亞慢性暴露引起雌性大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)的機(jī)制，可能與海馬組織中Glu含量降低、NMDA受體表達(dá)減少有關(guān)。