鄭建濤，楊 勇，周 東，*

(1．華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510006；2．廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東廣州510080)

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)惡性腫瘤，占腦腫瘤的50%左右。目前針對(duì)膠質(zhì)瘤標(biāo)準(zhǔn)的治療方案主要為最大安全范圍的手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后放療和化療，但是在標(biāo)準(zhǔn)治療方案下，膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后依然不佳，5年生存率約為10%。2016版WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類首次將分子病理類型納入膠質(zhì)瘤病理診斷，其中異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)突變、1號(hào)染色體短臂和19號(hào)染色體長臂(1p/19q)共缺失的患者預(yù)后較好，是膠質(zhì)瘤重要的預(yù)后指標(biāo)。然而不同分子病理分型膠質(zhì)瘤的發(fā)生機(jī)制尚未完全明確，因此探索其中潛在的基因差異表達(dá)具有重要意義。

連接蛋白43(connexin 43，CX43)是重要的連接蛋白之一，以縫隙連接或半通道的形式參與腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)。在膠質(zhì)瘤領(lǐng)域，目前在基礎(chǔ)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)CX43的表達(dá)增加可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長及侵襲。然而關(guān)于

CX43

基因與神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床病理特征及免疫微環(huán)境間的報(bào)道較少。本文旨在利用生物信息學(xué)的方法探索

CX43

基因表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理特征、預(yù)后的關(guān)系及其在腫瘤免疫微環(huán)境中的作用。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

通過癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA，https://portal.gdc.cancer.gov/)下載TCGA膠質(zhì)瘤患者RNA-Seq表達(dá)譜數(shù)據(jù)及臨床相關(guān)數(shù)據(jù)。剔除數(shù)據(jù)不完整的部分樣本，最后納入分析的病例共592例，其中低級(jí)別膠質(zhì)瘤(lower grade glioma，LGG)組包含WHO II級(jí)和III級(jí)共449例，IV級(jí)為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)組共143例。

同時(shí)回顧性收集廣東省人民醫(yī)院神經(jīng)外科2019年4月—2020年4月膠質(zhì)瘤患者術(shù)后石蠟標(biāo)本切片及臨床信息共34例。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 評(píng)價(jià)

CX43

基因在具有不同病理特征的膠質(zhì)瘤患者中的表達(dá)情況

按LGG及GBM組別、IDH突變情況和1p/19q是否共缺失狀態(tài)比較膠質(zhì)瘤患者中CX43 mRNA的表達(dá)情況。

1.2.2 評(píng)估

CX43

基因表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤預(yù)后的影響

以

CX43

基因表達(dá)水平的中位數(shù)為界限進(jìn)行分組，大于等于中位數(shù)者列為CX43高表達(dá)組，低于中位數(shù)者列為CX43低表達(dá)組。使用Kaplan-Meier生存分析曲線圖，應(yīng)用log-rank檢驗(yàn)方法比較

CX43

基因高表達(dá)組及低表達(dá)組的預(yù)后差異。

1.2.3 基因集富集分析

基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)是一種計(jì)算方法，對(duì)輸入基因集的組間差異進(jìn)行排序，從而確定其在不同生物學(xué)功能及信號(hào)通路中的富集情況。將膠質(zhì)瘤標(biāo)準(zhǔn)化的mRNA數(shù)據(jù)集分為CX43高、低兩個(gè)表達(dá)組。在GSEA(4.1.0)版本中，選擇“h.all.v7.2.symbols.gmt”注釋基因集、表型標(biāo)簽選擇“高表達(dá)或低表達(dá)”，置換次數(shù)選擇1 000次。結(jié)果中歸一化富集分?jǐn)?shù)(normalized enrichment score，NES)＞1.5、名 義 上(nominal，NOM)

P

＜0.05且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)

q

＜0.25被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.4

CIBERSORTx

免疫浸潤分析

CIBERSORTx(https://cibersortx.stanford.edu/)是由Alizadeh實(shí)驗(yàn)室和Newman實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的一款分析工具，用于估算基因表達(dá)譜，并使用基因表達(dá)數(shù)據(jù)估算混合細(xì)胞群體中成員細(xì)胞類型的豐度。首先，將標(biāo)準(zhǔn)化的mRNA數(shù)據(jù)集上傳到CIBERSORTx上，利用網(wǎng)頁分析工具，選擇排列置換次數(shù)1 000次，可得到22種免疫細(xì)胞在各樣本中的含量。進(jìn)而比較CX43高、低表達(dá)組間各種免疫細(xì)胞的成分。

1.2.5 臨床樣本免疫組化染色

石蠟標(biāo)本切片，脫蠟水化，微波抗原修復(fù)、3%雙氧水阻斷，10%山羊血清封閉，CX43一抗(購自博士德公司，貨號(hào)BA1727，按1∶150稀釋)4℃孵育過夜，復(fù)溫漂洗后孵育二抗、漂洗后使用DAB顯色劑顯色、蘇木素復(fù)染、脫水晾干后封片，顯微鏡觀察。同法檢測(cè)M2樣巨噬細(xì)胞分子標(biāo)志CD163，其中CD163一抗購自Abcam公司，抗體按1∶500稀釋。CX43免疫組化結(jié)果判讀，根據(jù)免疫組化的染色強(qiáng)度將無明顯染色計(jì)為0分，淺黃色計(jì)為1分，棕黃色計(jì)為2分，棕褐色計(jì)為3分。然后按染色面積評(píng)為：≤10%為0分，10%～25%(含)為1分，25%～50%(含)為2分，50%～75%(含)為3分，＞75%為4分。兩項(xiàng)評(píng)分相乘為最終評(píng)分，評(píng)分≤6分為CX43低表達(dá)組，＞6分為CX43高表達(dá)組。M2樣巨噬細(xì)胞分子標(biāo)志CD163免疫組化結(jié)果判讀，在顯微鏡下評(píng)估CD163陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的數(shù)量。隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野(×400倍)，將每個(gè)高倍視野的標(biāo)記細(xì)胞計(jì)數(shù)后，取平均數(shù)代表該樣本中CD163陽性M2樣巨噬細(xì)胞的浸潤數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用R語言4.0.0版本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。組間連續(xù)變量比較使用Student's

t

檢驗(yàn)，組間率的比較使用卡方檢驗(yàn)。以

α=

0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 CX43 mRNA表達(dá)與膠質(zhì)瘤臨床病理特征的關(guān)系

CX43 mRNA的表達(dá)水平在LGG及GBM組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1A)。在IDH突變型組中CX43 mRNA的表達(dá)水平顯著低于IDH野生型組(圖1B，

P

＜0.01)。1p/19q無共缺失組中CX43 mRNA的表達(dá)水平較共缺失組顯著升高(圖1C，

P

＜0.01)。

圖1 CX43 mRNA表達(dá)水平與各臨床病理特征的關(guān)系

2.2 CX43表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存分析提示CX43 mRNA低表達(dá)組在膠質(zhì)瘤中具有更好的預(yù)后(圖2，

P

＜0.01)。

圖2 CX43 mRNA表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者生存率的關(guān)系

2.3 CX43相關(guān)的GSEA富集分析

CX43

基因高表達(dá)組利用GSEA分析在9個(gè)特征基因集中富集(NOM，

P

＜0.05；FDR，

q

＜0.25)(表1)。其中與免疫相關(guān)的通路包括了白細(xì)胞介素-2(inteleukin 2，IL-2)/信號(hào)轉(zhuǎn)錄與激活因子5(signal transducer and activator of transcription 5，STAT5)信號(hào)通路、白細(xì)胞介素-6(inteleukin 6，IL-6)/Janus激酶(Janus kinase，JAK)/信號(hào)轉(zhuǎn)錄與激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信號(hào)通路、炎癥反應(yīng)等通路。結(jié)果提示

CX43

基因高表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤的作用與免疫浸潤相關(guān)。

表1 GSEA富集分析

2.4 CX43 mRNA高、低表達(dá)組間免疫細(xì)胞的豐度差異

比較CX43 mRNA高、低表達(dá)組中22種免疫細(xì)胞豐度的差異(圖3)，結(jié)果提示幼稚CD4 T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞、活化NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M0表型在CX43低表達(dá)組比高表達(dá)組升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)。而在CX43 mRNA高表達(dá)組顯著升高的為單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M2表型、活化樹突狀細(xì)胞。

圖3 CX43 mRNA高、低表達(dá)組間免疫細(xì)胞的豐度差異

2.5 免疫組化分析結(jié)果

免疫組化檢測(cè)CX43蛋白在具有不同臨床病理特征的膠質(zhì)瘤患者間的表達(dá)水平見圖4，結(jié)果提示1p/19q有、無共缺失和M2樣巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD163細(xì)胞數(shù)在CX43蛋白高、低表達(dá)組間存在差異。1p/19q無共缺失的比例及M2樣巨噬細(xì)胞(CD163細(xì)胞)數(shù)在CX43蛋白高表達(dá)組中增加(

P

＜0.05，表2)。

表2 免疫組化檢測(cè)CX43蛋白在具有不同臨床病理特征的膠質(zhì)瘤患者間的表達(dá)差異

圖4 膠質(zhì)瘤組織中CX43及CD163表達(dá)情況的免疫組化檢測(cè)結(jié)果

3 討論

目前對(duì)膠質(zhì)瘤的認(rèn)識(shí)已經(jīng)從原有的組織病理診斷過渡到分子病理診斷，IDH突變、1p/19q共缺失等分子標(biāo)志物被用于膠質(zhì)瘤的診斷、預(yù)后評(píng)價(jià)及治療，但膠質(zhì)瘤的治療效果仍不佳，中位生存期為20～36個(gè)月。因此利用生物信息學(xué)對(duì)公共數(shù)據(jù)庫的分析挖掘，可發(fā)現(xiàn)新的膠質(zhì)瘤差異基因，有助于未來膠質(zhì)瘤的診斷和治療。

CX43蛋白在人體所有細(xì)胞中均有表達(dá)，是維持細(xì)胞正常生理功能的重要蛋白，負(fù)責(zé)相鄰細(xì)胞間或與細(xì)胞外環(huán)境的物質(zhì)傳遞，其中包括重要的信號(hào)分子和細(xì)胞代謝產(chǎn)物。隨著對(duì)CX43研究的深入，其在腫瘤中的作用被不斷發(fā)現(xiàn)，CX43蛋白高表達(dá)與黑色素瘤、原發(fā)性膽管癌的不良預(yù)后相關(guān)，

CX43

基因的過表達(dá)促進(jìn)乳腺癌及黑色素瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。CX43對(duì)膠質(zhì)瘤的作用集中在基礎(chǔ)試驗(yàn)及免疫組化檢測(cè)CX43的表達(dá)與膠質(zhì)瘤臨床特征方面。

CX43

基因表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤臨床分子病理特征及預(yù)后的研究較為少見。本文通過對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫的生物信息分析及臨床病理標(biāo)本免疫組化的結(jié)果提示，CX43 mRNA在IDH野生型及1p/19q無共缺失組中高表達(dá)，且生存分析中提示

CX43

基因高表達(dá)組的總體生存期更短。既往的研究表明IDH野生型膠質(zhì)瘤對(duì)放化療的反應(yīng)較IDH突變型差，其無進(jìn)展生存期及總體生存期均顯著縮短。同樣，1p/19q無共缺失的患者其中位生存期明顯縮短?？梢?p>CX43

基因高表達(dá)與膠質(zhì)瘤預(yù)后較差的分子病理分型相關(guān)，這可能是

CX43

基因高表達(dá)生存預(yù)后更差的原因之一。Hong等發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞與星形細(xì)胞可利用CX43形成縫隙連接，傳遞microRNA促進(jìn)膠質(zhì)瘤的侵襲性，而在沉默

CX43

基因表達(dá)后可消除該作用。另外CX43的表達(dá)可使膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的化療形成耐藥性，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。這提示IDH野生型、1p/19q無共缺失的膠質(zhì)瘤可能通過CX43高表達(dá)對(duì)化療產(chǎn)生抵抗，從而影響患者的預(yù)后，而以CX43為靶點(diǎn)的治療方法可能是未來膠質(zhì)瘤治療的重要途徑之一?；贕SEA分析的結(jié)果提示CX43 mRNA高表達(dá)的膠質(zhì)瘤與IL-2、IL-6、炎癥免疫通路富集，而CIBERSORTx分析結(jié)果提示CX43 mRNA高表達(dá)的膠質(zhì)瘤M2型巨噬細(xì)胞的比例增高。已知腫瘤免疫細(xì)胞浸潤對(duì)腫瘤的生長起促進(jìn)作用，尤其是M2型巨噬細(xì)胞可釋放相關(guān)免疫因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，而與之對(duì)應(yīng)的M1型巨噬細(xì)胞具有殺傷腫瘤的作用。故將M2型巨噬細(xì)胞極化為M1型巨噬細(xì)胞或抑制巨噬細(xì)胞向M2表型極化是免疫治療中攻克惡性腫瘤的突破點(diǎn)。IL-6是巨噬細(xì)胞向M2表型極化的因子之一，在胰腺導(dǎo)管腺癌中，IL-6是誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2表型極化的信號(hào)因子。另外，在卵巢癌中被證實(shí)減少IL-6的表達(dá)可以通過JAK/STAT3信號(hào)通路抑制巨噬細(xì)胞向M2表型的轉(zhuǎn)化。在膠質(zhì)瘤的研究中M2型巨噬細(xì)胞的增多可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，而使用綠原酸可將M2型巨噬細(xì)胞重新極化為M1型巨噬細(xì)胞，從而抑制膠質(zhì)瘤生長。結(jié)合本文結(jié)果提示，CX43的高表達(dá)可能通過IL-6/JAK/STAT3信號(hào)通路調(diào)控膠質(zhì)瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞向M2表型極化，使M2型巨噬細(xì)胞增多從而導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)展及不良預(yù)后。而針對(duì)

CX43

基因的治療可能成為改善膠質(zhì)瘤免疫微環(huán)境的治療手段，值得進(jìn)一步研究。綜上所述，通過對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫的分析及臨床標(biāo)本驗(yàn)證，提示CX43高表達(dá)與1p/19q無共缺失狀態(tài)相關(guān)，

CX43

基因高表達(dá)為膠質(zhì)瘤不良預(yù)后的指標(biāo)。且CX43高表達(dá)與IL-6免疫通路相關(guān)并伴隨M2型巨噬細(xì)胞增多提示CX43高表達(dá)可能為巨噬細(xì)胞向M2表型極化的促進(jìn)因素。后期針對(duì)CX43與巨噬細(xì)胞M2表型極化作用的分子機(jī)制的研究，可能是對(duì)膠質(zhì)瘤治療新的探索方向。