常晨，楊荔艷，蔡洪慶，苑青，郝佳潔*，王明榮*

(國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院，分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，北京100021)

食管癌是我國主要的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居第6位，病死率居第4位。根據(jù)病理類型不同，食管癌可分為鱗癌和腺癌兩種常見亞型，在中國，食管鱗癌是最主要的病理類型，占90%以上。食管癌的5年生存率總體較低，國家癌癥中心的數(shù)據(jù)顯示，2018年我國食管癌的5年生存率為33.0%。因此，探索食管癌的分子改變，尋找預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志及潛在治療靶點(diǎn)對改善食管癌患者的生存尤為重要。

SERPINE1

基因定位于7q22.1，共9個外顯子，是絲氨酸蛋白酶抑制因子超家族成員。既往的研究發(fā)現(xiàn)，這個分子在腫瘤中的作用包括促進(jìn)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移、維持增殖信號、抗凋亡和誘導(dǎo)血管生成等。Sakakibara等發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌轉(zhuǎn)移患者的腫瘤組織中SERPINE1的表達(dá)升高，且其高表達(dá)的患者生存率較低，因此提示其可能作為食管鱗癌預(yù)后的標(biāo)志物。RNAscope作為一項新的用于檢測細(xì)胞中目標(biāo)RNA的原位雜交(

in situ

hybridization，ISH)技術(shù)，近些年來越來越多地被應(yīng)用于腫瘤研究領(lǐng)域。該項技術(shù)的操作流程簡單、靈敏度和特異性高于傳統(tǒng)的熒光原位雜交方法，具有向臨床應(yīng)用推廣的潛力。本研究使用RNAscope技術(shù)檢測了236例食管鱗癌中SERPINE1 mRNA的表達(dá)情況，并分析了其與臨床病理指標(biāo)及預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 公共數(shù)據(jù)庫分析

從基因表達(dá)庫(Gene Expression Omnibus，GEO)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下載GSE20347微陣列的數(shù)據(jù)集，比較SERPINE1 mRNA在正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)情況。從基因組圖譜(The Cancer Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(https://www.cancer.gov)下載81例食管鱗癌組織的SERPINE1 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床病理參數(shù)信息，從中提取出SERPINE1 mRNA的每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段(fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，F(xiàn)PKM)值，將其與T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分級、疾病分期和生存時間等信息進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.2 病例與標(biāo)本

本研究共收集食管鱗癌手術(shù)切除及其配對切緣形態(tài)學(xué)正常的癌旁組織236例，均來自2011—2012年河南省林州腫瘤醫(yī)院。標(biāo)本為完成臨床診斷后取得的剩余組織，且所有患者均已簽署知情同意書。標(biāo)本取材后按照常規(guī)步驟進(jìn)行福爾馬林固定和石蠟包埋。該項研究的設(shè)計和開展經(jīng)過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(No.12-097/631，16-084/1163)。

以組織病理學(xué)的檢查為確診標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)第7版美國癌癥聯(lián)合委員會癌癥分期手冊進(jìn)行分期?？偵媛识x為手術(shù)后一段時間內(nèi)死亡個體的百分比。隨訪至少5 a，入組患者均有完整的隨訪信息。

1.3 組織芯片-SERPINE1 mRNA原位雜交檢測

每個病例選取3個癌組織點(diǎn)和2個手術(shù)切緣正常的癌旁組織點(diǎn)，本室自行制作食管癌組織微陣列(tissue microarrays，TMAs)，并制備4 μm切片備用。采用RNAscope原位雜交技術(shù)對食管癌樣本進(jìn)行檢測，RNAscope探 針購 自 美 國ACD公 司(764～1 752 bp，RNAscopeProbe-Hs-SERPINE1)。原位雜交按照RNAscope 2.5 HD Reagent Brown檢測試劑盒的說明書進(jìn)行。主要步驟如下：切片脫蠟，雙氧水處理，靶標(biāo)修復(fù)試劑處理，蛋白酶處理，RNAScope探針雜交及放大處理，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，封片。實驗結(jié)果使用NanoZoomer(Hamamatsu公司，日本)病理掃描儀進(jìn)行掃描，并由兩位研究者獨(dú)立進(jìn)行雙盲評分。

1.4 結(jié)果判斷

SERPINE1 mRNA信號評分采用半定量法，即染色強(qiáng)度和染色面積百分比綜合決定。其中，信號強(qiáng)度的評分標(biāo)準(zhǔn)為：無染色0分，弱染色1分，中染色2分，強(qiáng)染色3分。染色面積的評分標(biāo)準(zhǔn)為：無著色范圍0分，1%～20%為1分，21%～50%為2分，51%～100%為3分。最終的評分為兩者得分的乘積。兩者得分之積≥3分為高表達(dá)，＜3分為低表達(dá)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所 得 數(shù) 據(jù) 用Microsoft Excel、SPSS 22.0和GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。用Mann-Whitney

U

檢驗兩組數(shù)據(jù)的差異。采用Pearson卡方檢驗和Fisher精確檢驗分析SERPINE1 mRNA表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)之間的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier生存曲線及Log-rank分析SERPINE1 mRNA陽性表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系，進(jìn)一步通過Cox比例風(fēng)險模型分析不同臨床病理指標(biāo)和SERPINE1 mRNA表達(dá)水平對患者術(shù)后生存時間的影響。采用雙側(cè)檢驗，以

α

=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)庫中SERPINE1 mRNA的表達(dá)水平變化

分析GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE20347數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織相比，SERPINE1 mRNA在食管鱗癌中的表達(dá)顯著升高(

n

=17，

P

＜0.01，圖1A～圖1B)。進(jìn)一步分析食管鱗癌的TCGA RNA測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)SERPINE1 mRNA表達(dá)水平與組織學(xué)分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均無顯著相關(guān)關(guān)系(圖1C～圖1F)，但SERPINE1 mRNA表達(dá)水平較高的患者生存期較短，雖差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但提示SERPINE1的表達(dá)可能與食管鱗癌預(yù)后相關(guān)(圖1G)。

圖1 SERPINE1 mRNA在數(shù)據(jù)庫樣本中的表達(dá)情況

2.2 食管鱗癌組織中SERPINE1 mRNA的表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性

使用含有236例食管鱗癌組織和手術(shù)切緣形態(tài)學(xué)正常的食管癌旁上皮組織芯片，進(jìn)行SERPINE1 mRNA表達(dá)水平的原位檢測，其在食管鱗癌組織中的陽性表達(dá)率為23.7%(56/236)，而在癌旁組織中完全測不到，兩者之間表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.01，圖2和表1)。食管鱗癌組織中SERPINE1 mRNA的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系見表2，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，SERPINE1 mRNA表達(dá)水平與性別、腫瘤浸潤深度、腫瘤分級及病理分期相關(guān)(均為

P

＜0.05)。

表1 食管鱗癌及手術(shù)切緣正常上皮中SERPINE1 mRNA的表達(dá)情況

表2 食管鱗癌組織中SERPINE1 mRNA表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

圖2 SERPINE1 mRNA原位雜交結(jié)果代表圖

2.3 SERPINE1 mRNA的表達(dá)水平與食管鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存曲線顯示，SERPINE1 mRNA高表達(dá)患者的生存時間(21.25個月)顯著短于低表達(dá)(44.4個月)的患者(

P

=0.017，圖3)。單因素分析顯示，SERPINE1 mRNA水平、N分期和臨床分期與患者的生存時間相關(guān)(均

P

＜0.05)；包括SERPINE1 mRNA水平、N分期和臨床分期的多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，SERPINE1 mRNA的高表達(dá)是食管鱗癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立影響因素(表3)。

圖3 SERPINE1 mRNA表達(dá)水平與食管鱗癌患者術(shù)后總生存率的關(guān)系

表3 食管鱗癌患者術(shù)后總生存時間的單因素和多因素回歸分析

3 討論

復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是食管癌治療失敗及患者死亡的主要原因之一。有效的預(yù)后標(biāo)志物可輔助臨床醫(yī)生將根治術(shù)后患者的預(yù)后風(fēng)險分為高危組和低危組，從而對高危組患者進(jìn)行及時的干預(yù)，并能防止對低危組的過度治療，實現(xiàn)腫瘤患者的精準(zhǔn)化、個體化治療，以達(dá)到延長患者生存的目的，在改善患者預(yù)后及提高生存率方面具有重要的意義及應(yīng)用價值。

SERPINE1

基因的編碼產(chǎn)物纖溶酶原激活物抑制因子1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)是組織型纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，tPA)和尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase plasminogen activator，uPA)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，屬于纖溶酶原激活系統(tǒng)的成員。PAI-1是一種分泌蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤中，PAI-1的活性增強(qiáng)會增加轉(zhuǎn)移的風(fēng)險；在乳腺癌患者，血漿PAI-1的水平升高是乳腺癌潛在的預(yù)后標(biāo)志物。PAI-1在胃癌、卵巢癌、膠質(zhì)瘤、腎透明細(xì)胞癌等組織中也存在表達(dá)異常，且與患者的不良預(yù)后相關(guān)。關(guān)于SERPINE1在食管鱗癌中的研究，Zhang等曾于2014年報道在食管鱗癌組織中PAI-1蛋白表達(dá)的陽性率高于正常食管組織，且其表達(dá)與腫瘤浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，但與預(yù)后無顯著相關(guān)。在食管鱗癌細(xì)胞中，敲降

SERPINE1

基因可顯著抑制食管鱗癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。本研究首次采用RNA原位雜交方法檢測了食管鱗癌組織中SERPINE1 mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示SERPINE1 mRNA的表達(dá)水平在23.7%的食管鱗癌病例中異常升高，其表達(dá)水平與食管鱗癌患者的總生存率顯著相關(guān)，且是獨(dú)立的不良預(yù)后因素，這與上述PAI-1表達(dá)與其他腫瘤的預(yù)后不良相關(guān)的報道是一致的，而與Zhang等對食管鱗癌的研究結(jié)論略有不同。不過，我們注意到在Zhang等研究的結(jié)果中PAI-1陽性的患者也有生存較差的傾向，雖然

P

值不具有統(tǒng)計學(xué)意義，但顯示臨界相關(guān)(

P=

0.055)。因此，我們推測PAI-1表達(dá)可能確是患者預(yù)后較差的重要因素。而且提示在診療過程中，SERPINE1 mRNA高表達(dá)的患者可能需要給予更積極的術(shù)后輔助治療。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SERPINE1 mRNA在食管鱗癌中存在異常表達(dá)，其高表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)，并且是獨(dú)立預(yù)后因素。SERPINE1 mRNA有可能作為食管鱗癌分子分型、輔助治療及預(yù)后評估的標(biāo)志物。