陳 浩， 黃 智， 張 帥， 王黎洲， 周 石

缺血性腦卒中是全球最嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，現(xiàn)階段除了早期溶栓、取栓等介入治療外，尚無其他更有效的治療手段。然而介入治療后血管再通的同時，可能發(fā)生腦缺血/再灌注（I/R）損傷［1-3］，是影響腦卒中預后的重要環(huán)節(jié)。因此尋找新的有效措施預防腦I/R損傷具有重要意義。微小核糖核酸（microRNA，miRNA，miR）是通過靶向調(diào)節(jié)信使RNA（mRNA）穩(wěn)定性和/或轉(zhuǎn)化效率執(zhí)行轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后負調(diào)控功能的小片段（18～25 nt）單鏈非編碼RNA分子［4］。研究證實最成熟的miRNA通過結(jié)合3’非編碼區(qū)改變靶向mRNA降解或翻譯［5-6］。既往研究顯示miR-29b、miR-21、miR-200和miR-497似可作為潛在治療靶點，通過改變大腦皮層中通常高表達的關(guān)鍵信號元件參與腦I/R損傷［7］。miR-29b也可能負調(diào)控B淋巴細胞瘤（BCL）-2家族成員，如BCL-W（BCL-2L2）和髓樣細胞白血?。∕CL）-1等促生存蛋白。這些蛋白是腦I/R損傷的重要調(diào)節(jié)因子，其作用機制尚不清楚［8-10］。本研究旨在確定miR-29b是否對體外腦I/R損傷具有保護作用，并探討其潛在作用機制，以期為改善其臨床療效提供新策略。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞和主要試劑

小鼠成神經(jīng)細胞瘤（N2a）細胞（中國科學院上海分院），miR-29b模擬物、抑制劑及相應對照組序列（廣州銳博生物科技公司），LipofectamineTM 3000試劑（美國Invitrogen公司），細胞計數(shù)試劑盒（CCK）-8（日本同仁化學研究所），膜聯(lián)蛋白（annexin）Ⅴ/碘化丙啶（PI）凋亡試劑盒（杭州聯(lián)科生物科技公司），TRIzol試劑（美國Thermo Fisher公司），抗小鼠多克隆MCL-1抗體（1∶2 000）（美國Sigma公司），抗小鼠多克隆BCL-2抗體（1∶1 000）、抗小鼠多克隆半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（caspase）-3抗體（1∶1 000）（英國Abcam公司），抗小鼠多克隆3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體（1∶1 000）（美國Santa Cruz生物技術(shù)公司），化學發(fā)光試劑（美國Merck Millipore公司），psiCheckTM2載體（美國Invitrogen公司），限制性內(nèi)切酶（生工生物工程上海公司），7500 Fast實時聚合酶鏈反應（PCR）系統(tǒng)PCR儀（美國Thermo Fisher公司），KO-PLUS誘變試劑盒（美國Santa Cruz生物技術(shù)公司）。

1.2 氧糖剝奪/復氧模型建立和實驗分組

37℃、5%CO2、95%O2濕潤空氣條件下，N2a細胞置于加入10%胎牛血清（美國Hyclone公司）和1%青霉素/鏈霉素（美國Mediatech公司）的高糖Dulbecco改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）（美國HyClone公司）中培養(yǎng)；N2a細胞置于脫氧無糖DMEM（美國HyClone公司）進行氧糖剝奪（OGD）處理，缺氧條件（5%CO2、1%O2、94%N2）下培養(yǎng)4 h；置于含葡萄糖DMEM，正常培養(yǎng)條件（5%CO2、95%O2）下于12 h進行復氧（R）處理。體外OGD/R模型建立并分為6組：空白對照組（control）、OGD/R組（OGD/R）、OGD/R＋轉(zhuǎn)染miR-29b模擬物組（mimics）、OGD/R＋轉(zhuǎn)染miR-29b抑制劑組（inhibitor）、OGD/R＋轉(zhuǎn)染miR-29b模擬物陰性對照組（mimics NC）、OGD/R＋轉(zhuǎn)染miR-29b抑制劑陰性對照組（inhibitor NC）。

1.3 miRNA模擬轉(zhuǎn)染和實驗分組

miR-29b模擬物、miR-29b抑制劑、模擬物NC、抑制劑NC引物序列見表1。按2×105細胞將miR-29b模擬各組N2a細胞培養(yǎng)于6孔板中，分別用LipofectamineTM3000試劑轉(zhuǎn)染200μL成熟miR-29b模擬物、miR-29b抑制劑、模擬物NC、抑制劑NC 24 h，并相應分為4組。

表1 miRNA引物序列

1.4 細胞活力檢測

上述4組序列轉(zhuǎn)染后，在96孔板每孔中加入100μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育1 h；酶標儀測量450 nm處吸光度。

1.5 細胞凋亡檢測

采用annexinⅤ/PI凋亡試劑盒定量檢測凋亡細胞。收集4組N2a細胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，置于含5μL annexinⅤ（10 g/mL）的200μL結(jié)合緩沖液中重新懸浮，暗室中靜置10 min；置于10μL PI（20 g/mL）中孵育；流式細胞儀（美國Beckman公司）檢測細胞凋亡，CellQuestTM軟件（美國BDBiosciences公司）進行數(shù)據(jù)采集和分析。

1.6 蛋白分離和免疫印跡分析

常規(guī)方法對4組樣本2×l06N2a細胞裂解后，提取總蛋白，進行免疫印跡分析。主要抗體為抗小鼠多克隆MCL-1抗體（1∶20 000）、BCL-2抗體（1∶1 000）、caspase-3抗體（1∶1 000）、GAPDH抗體（1∶1 000）。采用化學發(fā)光試劑和LAS4000發(fā)光成像分析儀（美國GE Healthcare公司）觀察蛋白印跡。

1.7 實時定量PCR檢測

根據(jù)TRIzol試劑使用說明，從細胞中提取總RNA，NanoDrop 1000分光光度計（美國Thermo Fisher公司）進行RNA定量；根據(jù)Bestar qPCR RT試劑盒（德國DBI Bioscience公司）使用說明，對每個樣本1μg總RNA行逆轉(zhuǎn)錄，96孔板和7500 Fast PCR儀行實時定量PCR檢測。每20μL PCR反應體系包括1μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（1∶5）、0.5μL有義引物、0.5μL通用逆轉(zhuǎn)錄引物、10μL混合緩沖液（Bestar Sybr-Green qPCR master mix），加雙蒸水至20μL。反應條件為94℃，反應2 min，94℃和58℃循環(huán)20 s，循環(huán)40次，72℃反應20 s，所有反應重復3次。引物序列見表2。

表2 miR-29b引物序列

1.8 重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)和雙熒光素酶檢測

從GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索小鼠MCL-1 mRNA（NM_000286）3'非翻譯區(qū)（UTR）并應用合成引物：MCL-1正向5'GCTAGCCGCTACTAGGCTCCCC3'，反向5'CGGGTAGTATATACGCGTCGTTAC3'擴增。將產(chǎn)物克隆至psiCheckTM2載體，重組載體擴增至重組大腸桿菌DH5α，并用無內(nèi)毒素質(zhì)粒純化試劑盒純化。每片段分別用Takara LA Taq（日本TaKaRa生物公司）PCR擴增并克隆至載體。采用KO-PLUS誘變試劑盒使MCL-1 3'UTR序列中miR-29b結(jié)合位點突變。所有構(gòu)建物均經(jīng)限制性內(nèi)切酶（上海生工生物工程公司）消化測序。

N2a細胞在6孔板上接種密度為1.0×105細胞/mL，次日可達到50%覆蓋。miR-29b轉(zhuǎn)染24 h，用上述LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染psiCheckTM2-MCL-1-3'UTR-wt/-mut質(zhì)粒（美國Invitrogen公司），再孵育24 h；收集細胞，測定熒光素酶活性，通過雙熒光素酶報告器（美國Promega公司）和微孔板閱讀器（美國Biotek公司）標準化熒光素酶活性。處理后的細胞樣本與對照細胞樣本的發(fā)光率，均給予3個獨立樣本轉(zhuǎn)染的均值±標準差。

1.9 數(shù)據(jù)分析

實時定量PCR數(shù)據(jù)分析中，以相對定量法測定目標miRNA表達量變化。用U6 RNA對表達進行標準化，并測定擴增后變化。每個樣本折疊變化用2-ΔΔCq表達式計算法，ΔΔCq＝（Cq目標基因-CqU6）PIH-（Cq目標基因-CqU6）對照。值2-ΔΔCq＞1.5或＜0.67考慮miRNA差異表達。t檢驗評估實時定量PCR檢測的miRNA表達差異。采用SPSS 17.0軟件分析其他實驗數(shù)據(jù)。各組間miRNA log10轉(zhuǎn)換相對數(shù)量比較用單因素方差分析，其基因間差異評價用Post-Hoc檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-29b與MCL-1相互作用

雙熒光素酶實驗顯示，與psiCheckTM2-MCL-1-3'UTR-mut轉(zhuǎn)染細胞相比，miR-29b模擬物和psiCheckTM2-MCL-1-3'UTR-wt處理后N2a細胞中熒光素酶活性降低（圖1）；結(jié)果表明miR-29b通過與MCL-1的3'UTR端結(jié)合下調(diào)MCL-1表達。

圖1 N2a細胞中轉(zhuǎn)染miR-29b模擬物與MCL-1 3'UTR端潛在miR-29b結(jié)合片段的相互作用

2.2 miR-29b模擬物和抑制劑在N2a細胞中的作用

轉(zhuǎn)染24 h后，OGD/R組miR-29b水平與control組相比明顯升高，mimics組升高更明顯，inhibitor組升高不明顯（圖2）。

2.3 miR-29b模擬物和抑制劑對細胞活力的影響

OGD/R組細胞存活率與control組相比明顯降低，mimics組降低更加明顯（P＜0.01），inhibitor組與control組無明顯差別；表明OGD/R環(huán)境下miR-29b模擬物抑制N2a細胞活力，miR-29b抑制劑促進N2a細胞存活（圖3）。

圖2 miR-29b模擬物和抑制劑在N2a細胞中的作用

2.4 miR-29b模擬物和抑制劑對細胞凋亡的影響

mimics組細胞凋亡發(fā)生與control組相比顯著升高，inhibitor組與mimics組相比細胞凋亡較少（圖4）；表明OGD/R環(huán)境下miR-29b模擬物促進神經(jīng)細胞凋亡，miR-29b抑制劑抑制神經(jīng)細胞凋亡。

圖3 miR-29b模擬物和抑制劑對N2a細胞活力的影響

圖4 miR-29b模擬物和抑制劑對細胞凋亡的影響

2.5 miR-29b模擬物和抑制劑對凋亡蛋白的影響

OGD/R組細胞中BCL-2、MCL-1表達水平與control組相比均明顯下調(diào)，caspase-3明顯上調(diào)，mimics組BCL-2、MCL-1表達進一步受抑，但在inhibitor組明顯上調(diào)，caspase-3表達明顯下調(diào)；表明OGD/R環(huán)境下miR-29b下調(diào)MCL-1、BCL-2表達，同時上調(diào)caspase-3表達（圖5）。

3 討論

研究表明腦I/R損傷是影響腦卒中預后的重要環(huán)節(jié)，OGD/R環(huán)境下神經(jīng)細胞凋亡明顯增加［11-12］。本實驗研究結(jié)果與之一致。然而OGD/R環(huán)境下神經(jīng)細胞凋亡機制不甚明確［12］。許多研究表明，miRNA在腦I/R損傷中起關(guān)鍵作用［13-14］。miR-29b是否有促進細胞凋亡的作用尚不明確［15］。本研究結(jié)果表明，腦I/R過程中miR-29b表達明顯升高，且下調(diào)抗凋亡蛋白MCL-1、BCL-2表達，上調(diào)凋亡蛋白caspase-3表達，促進神經(jīng)細胞凋亡，但miR-29b促進神經(jīng)細胞凋亡的具體機制仍不清楚。miR-29b可直接與MCL-1 3’UTR端結(jié)合下調(diào)MCL-1表達，因此推斷miR-29b通過靶向下調(diào)MCL-1表達促進腦I/R時神經(jīng)細胞凋亡。

圖5 miR-29b模擬物和抑制物對N2a細胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

以往大量研究關(guān)注miR-29b對腫瘤的調(diào)控作用。然而miR-29b在OGD/R環(huán)境下和腦I/R損傷患者神經(jīng)細胞中也顯著上調(diào)［7，16］。有研究顯示，激活的miR-29b在神經(jīng)元成熟過程中通過靶向BH3蛋白表達促進神經(jīng)細胞凋亡［17］。本實驗研究表明miR-29可與MCL-1蛋白3'UTR端結(jié)合，這與既往研究結(jié)果一致。BCL-2家族可分為抗凋亡因子或促凋亡因子，它們通過改變線粒體膜完整性和功能發(fā)揮作用，也影響凋亡信號轉(zhuǎn)導通路。BCL-2家族由3個亞群組成：①促生存蛋白，如BCL-2、BCL-xl（BCL-2L1）、BCL-w（BCL-2L2）、MCL-1和A1；②多域促凋亡蛋白，如BAX和BAK；③BH3域促凋亡蛋白，如BIM、PUMA（BBC3）、BID、BAD、BIK、BMF、HRK和NOXA（PMAIP1）［18-20］。MCL-1是BCL-2家族中重要的抗凋亡蛋白，抑制MCL-1可通過線粒體途徑促進細胞死亡；MCL-1還參與腦I/R損傷過程中神經(jīng)細胞凋亡［21］。因此，本研究考慮miR-29b與MCL-1間相互作用，是神經(jīng)細胞凋亡過程中關(guān)鍵因素之一。Shi等［22］研究也表明，一些miRNA直接針對BCL-2家族蛋白3'UTR端，如miR-15b在永久性大腦中動脈閉塞（MCAO）后高表達，可能直接針對BCL-2。miR-491-5p也被認為可結(jié)合BCL-xl（BCL-2L1）mRNA，這是BCL-2家族中抗凋亡成員之一［23］。此外，miR-29b上調(diào)通過抑制缺血后腦損傷BCL-2L2蛋白促進神經(jīng)元細胞凋亡［24］。許多化療藥物通過下調(diào)腫瘤細胞中MCL-1表達誘導細胞凋亡，本中心既往研究結(jié)果表明靶向miR-29b也可能通過抑制MCL-1表達成為腦I/R損傷的治療靶點［25］。本研究再次證實該結(jié)果。

本研究在蛋白質(zhì)和組織學水平證實本中心最初假設(shè)，即miR-29b通過靶向MCL-1促進腦I/R損傷過程中神經(jīng)細胞凋亡。然而本研究也有一定局限性，如實驗數(shù)據(jù)是在體外環(huán)境中應用miR-29b模擬物所獲得，可能不能準確反映體內(nèi)效應。本中心計劃在MCAO動物模型中進一步實驗探索腦I/R損傷與miR-29b抑制劑或MCL-1過表達間的治療關(guān)系。此外，需要進一步實驗驗證miR-29b在腦I/R損傷中靶向MCL-1的神經(jīng)損傷和神經(jīng)保護作用，探討miR-29b在腦I/R損傷時神經(jīng)元細胞中的功能和機制，以期為缺血性腦卒中患者開發(fā)出新的治療靶點。