尹 僖，謝 偉

(重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院核醫(yī)學科/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室/兒科學重慶市重點實驗室/重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預防國際科技合作基地，重慶 400014)

感染性疾病是全球引起人類死亡的第二大主要原因，而金黃色葡萄球菌是引起人類感染[1]，尤其是呼吸道感染的主要病原體之一[2-3]。金黃色葡萄球菌是一種可寄生于宿主體表的條件致病菌，同時也是引起局部化膿性感染、肺炎、心內(nèi)膜炎及全身膿毒血癥等醫(yī)院獲得性感染的主要致病菌[4]。α溶血毒素(Hla)是一種外毒素，通常由致病性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌產(chǎn)生[5]。Hla可促使中性粒細胞裂解，損傷上皮細胞而產(chǎn)生生物學效應，引起菌血癥等臨床癥狀[6]。呼吸道上皮作為宿主對抗細菌感染的第一道防線，研究其在感染條件下發(fā)生的變化對于理解宿主-細胞的相互作用非常關鍵。人支氣管上皮細胞株16HBE14o-是一種對Hla敏感的細胞株，而人支氣管上皮細胞株S9則對Hla不敏感[7]。對比研究這2種細胞株，對研究Hla在金黃色葡萄球菌感染時對呼吸道上皮細胞的作用具有重要意義。

表達譜芯片可以同時研究組織的數(shù)萬個基因表達情況，在全基因組層面對細胞的基因表達變化進行全面化較，尋找與感染相關的各種基因。美國國立衛(wèi)生研究院生物信息中的基因芯片數(shù)據(jù)庫(GEO)是當今最大、最全面的公共基因表達譜數(shù)據(jù)庫，至今已經(jīng)收集100多萬個樣本的表達譜原始數(shù)據(jù)。從不同的角度對數(shù)據(jù)進行再分析，可以讓這些數(shù)據(jù)獲得更大的使用價值，也可減少不必要的重復研究[8-9]。為發(fā)現(xiàn)在病原體-宿主相互作用中起關鍵作用的基因，本研究將從GEO數(shù)據(jù)庫下載的不同呼吸道上皮細胞在不同類型金黃色葡萄球菌感染的表達譜芯片進行分析，旨在尋找差異表達基因，并對其進行基因本體論分析，然后通過通路分析方法篩選出金黃色葡萄球菌感染中的相關通路。另外，通過提取差異通路中的基因，進行基因產(chǎn)物蛋白互作的分析，找到維持上述通路關鍵的節(jié)點基因?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1一般材料 從GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢索下載不同呼吸道上皮細胞在不同類型金黃色葡萄球菌感染的表達譜芯片數(shù)據(jù)，登錄號為GSE65018[10]。該數(shù)據(jù)集包括對金黃色葡萄球菌Hla毒素敏感的細胞株16HBE14o-和對Hla毒素抵抗的細胞株S9，分別用表達/非表達Hla毒素的金黃色葡萄球菌感染。

1.2方法 利用在線基因分析系統(tǒng)(https://www.gcbi.com.cn/gclib/html/index)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。對通過過濾標準的基因進行非配對樣本t檢驗，利用Class comparison工具對2組樣本分類對比，找到差異表達基因，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。利用DAVID在線分析系統(tǒng)(https://david.ncifcrf.gov/)對差異表達基因進行GO本體分析。

2 結 果

2.1基本情況 根據(jù)預先設定的數(shù)據(jù)標準化過濾要求，16HBE14o-組共有1 164個基因，S9組有201個基因通過了過濾標準，可用于進一步生物信息學分析。

2.2差異表達分析 應用在線基因分析系統(tǒng)的差異表達分析工具，分類比較差異顯著的基因(P<0.05，變化倍數(shù)大于2倍)，分別篩選出50個在16HBE14o-和S9中，表達/非表達Hla毒素金黃色葡萄球菌感染時差異表達最顯著的基因。在S9感染表達/非表達Hla毒素金黃色葡萄球菌時，50個差異最顯著的基因中，有24個基因表達上調(diào)，26個基因表達下調(diào)。在16HBE14o-感染表達/非表達Hla毒素金黃色葡萄球菌時，50個差異最顯著的基因中，有9個基因表達上調(diào)，41個基因表達下調(diào)。

2.3差異基因的GO分析 DAVID在線分析系統(tǒng)對差異基因進行基因本體論GO分析結果，見表1、2。

表1 S9細胞株中與Hla毒素相關的GO分析

續(xù)表1 S9細胞株中與Hla毒素相關的GO分析

表2 16HBE14o-細胞株中與Hla毒素相關的GO分析

續(xù)表2 16HBE14o-細胞株中與Hla毒素相關的GO分析

2.4差異基因的通路分析 使用在線基因分析系統(tǒng)的Pthway Relation Network功能，通過KEGG數(shù)據(jù)庫分析2組細胞感染實驗中差異基因的信號通路。結果顯示，對Hla毒素非敏感的S9細胞株中，發(fā)現(xiàn)差異基因相關的信號通路主要為MAPK、JAK/STAT及Toll樣受體通路等與免疫反應關系密切。而16HBE14o-細胞株中與Hla毒素相關的信號通路結果顯示，受體通路等與免疫反應無特異相關性。

2.5差異基因的蛋白互作分析 使用STRING功能，通過在線網(wǎng)絡http://www.string-db.org/數(shù)據(jù)庫分析2組細胞感染實驗中差異基因的蛋白互作情況。S9細胞株中表達/非表達Hla毒素金黃色葡萄球菌感染時的差異基因蛋白互作分析結果顯示，其主要與FOS蛋白、EGR1蛋白、DUSP1蛋白、ATF3蛋白作用聯(lián)系緊密。16HBE14o-細胞株中表達/非表達Hla毒素金黃色葡萄球菌感染時的差異基因蛋白互作分析結果顯示，其與蛋白作用不大。

3 討 論

本研究從16HBE14o-和S9細胞株感染表達/非表達Hla毒素金黃色葡萄球菌的基因芯片數(shù)據(jù)中，分別篩選出1 164個和201個顯著差異(差異大于1.5倍)的基因，并對這些基因進行了基因本體論和信號通路分析。2種細胞株在感染條件下的差異基因數(shù)量上區(qū)別較大，可能是由于2種細胞株對Hla毒素的敏感度不同所導致。說明細菌因子與氣道上皮細胞的相互作用可能具有高度的細胞類型特異性，這與文獻[11]報道內(nèi)容一致?；虮倔w論分析發(fā)現(xiàn)，差異基因主要與轉錄調(diào)控、信號轉導、炎性反應及免疫反應等有關，這與公認的感染免疫相關基因本體一致[8-9]。

值得注意的是，在對Hla毒素非敏感的S9細胞株中，與差異基因相關的基因本體包括細胞對脂多糖的反應，這一現(xiàn)象可能是由于差異基因的重疊性所致。信號通路分析發(fā)現(xiàn)，差異基因相關的信號通路主要為MAPK、JAK/STAT及Toll樣受體通路等與免疫反應關系密切的信號通路，這也與公認的金黃色葡萄球菌感染中被激活的信號通路相一致[12-13]。進一步證明，Hla是金黃色葡萄球菌的主要效應毒素。S9細胞株中，表達/非表達Hla毒素金黃色葡萄球菌感染時的差異基因蛋白互作分析結果顯示，其主要與FOS蛋白、EGR1蛋白、DUSP1蛋白、ATF3蛋白作用聯(lián)系緊密；而16HBE14o-細胞株中，表達/非表達Hla毒素金黃色葡萄球菌感染時的差異基因蛋白互作分析結果顯示，其與蛋白作用不大。這提示S9細胞可能對Hla誘導的細胞膜損傷具有更高水平的抵抗力,與文獻報道一致[14]。

本研究運用生物信息學的方法分析基因芯片數(shù)據(jù)，16HBE14o-和S9細胞株中，表達/非表達Hla毒素金黃色葡萄球菌感染時基因表達差異顯著；S9細胞株蛋白互作聯(lián)系緊密。