武永樂 尚宏偉 孫廣永 張 棟* 丁惠國*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院肝病消化中心，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，北京100069; 3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院科研實(shí)驗(yàn)中心，北京 100050)

久坐的生活方式及過多的能量攝入導(dǎo)致肥胖發(fā)生率逐年增加。而由肥胖引發(fā)的胰島素抵抗、非酒精性脂肪性肝病、動脈粥樣硬化等多種代謝性疾病，大大增加了患者死亡風(fēng)險(xiǎn)。目前肥胖作為一種慢性炎癥疾病的觀點(diǎn)已是共識。研究[1]顯示，脂肪組織中的炎癥反應(yīng)是誘發(fā)肥胖、胰島素抵抗及各種肥胖相關(guān)疾病的核心，幾乎所有的免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞)均不同程度地參與了肥胖及其代謝性疾病的過程。其中巨噬細(xì)胞是肥胖中介導(dǎo)脂肪組織炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞，其活化后能分泌大量趨化因子，促進(jìn)T細(xì)胞、自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞等向脂肪組織趨化募集；同時(shí)其產(chǎn)生的活性氧、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)亦能引起氧化應(yīng)激，加重脂肪組織的炎癥反應(yīng)。另外，脂肪組織中的CD4、CD8等促炎T細(xì)胞功能、數(shù)量的增加及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量的降低也與脂肪組織的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[2]。因此，認(rèn)識脂肪組織中巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞的比例、功能狀態(tài)是研究肥胖等代謝性疾病免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)。分離純化脂肪組織免疫細(xì)胞的技術(shù)多種多樣，目前主要有機(jī)械研磨及酶消化方式，后者包括Ⅱ型膠原酶、Ⅳ型膠原酶和Liberase酶消化。不同的操作方式導(dǎo)致提取免疫細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量參差不齊，并且某些繁瑣的程序進(jìn)一步影響免疫細(xì)胞活性和抗原表位，影響脂肪組織免疫環(huán)境評估的準(zhǔn)確性。因此，建立一套高效的、穩(wěn)定的分離脂肪組織免疫細(xì)胞的方法非常必要。本研究比較了機(jī)械研磨和不同消化酶消化脂肪組織的效果，以期能最大限度地提高脂肪組織中免疫細(xì)胞的數(shù)量及活性。并通過高脂飲食建立小鼠肥胖模型，進(jìn)一步分析了小鼠脂肪組織中巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的比例及亞群變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

8周齡雄性C57BL/6J小鼠購自北京維通利華公司(動物合格證號：110322211100187237)，60%的高脂飼料購自上海派克生物公司。小鼠在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院的SPF級動物設(shè)施中飼養(yǎng)。采用數(shù)字表法隨機(jī)將小鼠分為正常飲食(normal control diet,NCD)組及高脂飲食(high fact diet,HFD)組，高脂飲食組喂養(yǎng)60%高脂飼料建立小鼠肥胖模型，正常飲食組喂養(yǎng)正常飼料作為對照。16周后吸入麻醉并處死小鼠，取附睪周圍脂肪組織進(jìn)行機(jī)械研磨或酶消化處理。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)編號：20-2038)，符合動物倫理與福利的相關(guān)規(guī)定要求。

1.1.2 試劑與抗體

Ⅱ型膠原酶、Ⅳ型膠原酶和Liberase酶(包括嗜熱菌蛋白酶低、中、高含量)購自Sigma公司(美國)；DNA酶Ⅰ (DNase Ⅰ)購自Roche公司(德國)；無鈣鎂的DPBS (1×)購自Corning公司(美國)?？剐∈蟮腃D3、CD4、CD8、NK1.1、CD45、F4/80、CD11b、CD11C、CD206、髓樣細(xì)胞表達(dá)激發(fā)受體1(triggering receptor expressed on myeloid cells 1,TREM1)、TNF-α、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、Foxp3熒光抗體購自BioLegend公司(美國)；7AAD試劑盒購自BD Pharmingen公司(美國)。組織勻漿儀(Gentle MACSTM)和勻漿管(Gentle-MACSTMC)購自美天旎公司(德國)。流式細(xì)胞儀(FACS Aria Ⅱ)購自BD公司(美國)。

1.2 方法

1.2.1 機(jī)械研磨分離脂肪組織免疫細(xì)胞

①在深度麻醉下，切取C57BL/6J雄性小鼠附睪周圍脂肪組織，小心地移到有蓋培養(yǎng)皿中。②將脂肪組織剪碎成小團(tuán)塊狀，直徑小于1 mm，并進(jìn)一步在70 μm的濾網(wǎng)上研磨過濾。③將過濾后的細(xì)胞懸液，50 g，4 ℃，離心5 min，去除沉淀。取上清，500 g，4 ℃，繼續(xù)離心 5 min。④將上述細(xì)胞沉淀用含0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的杜氏磷酸緩沖液(Dulbecco’s phosphate buffered saline, DPBS)重懸洗滌兩次。上述過程全程在冰上操作，最后用含0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA的DPBS重懸進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測。

1.2.2 體外酶消化法分離脂肪組織免疫細(xì)胞

①在深度麻醉下，切取C57BL/6J雄性小鼠附睪周圍脂肪組織，小心地移到有蓋培養(yǎng)皿中。②將脂肪組織剪碎成小團(tuán)塊狀，直徑小于1 mm，用5 mL消化酶將脂肪組織重懸于組織勻漿管中。③將上述懸液在組織勻漿儀中按脂肪組織消化的程序勻漿兩次。37 ℃，孵育30 min。之后在組織勻漿儀中繼續(xù)勻漿兩次。④加入10 mL含2%(體積分?jǐn)?shù))血清的DPBS終止消化，將懸液在70 μm的濾網(wǎng)上過濾，棄掉濾出的脂肪殘?jiān)＂輰⑦^濾后的細(xì)胞懸液50 g，4 ℃，離心5 min。去除沉淀，取上清，500 g，4 ℃，繼續(xù)離心5 min。⑥將上述細(xì)胞沉淀用含0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA的DPBS重懸洗滌兩次。上述過程除酶消化步驟外，全程在冰上操作，最后用含0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA的DPBS重懸進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測。

Liberase酶消化液：1 mg/mL BSA，0.2 mg/mL的Liberase，0.001%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的DNA酶；Ⅱ型膠原酶消化液:1 mg/mL BSA，1.0 mg/mL的Ⅱ型膠原酶, 0.001%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的DNA酶；Ⅳ型膠原酶消化液:1 mg/mL BSA，0.1 mg/mL的Ⅳ型膠原酶，0.001%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的DNA酶。

1.2.3 流式細(xì)胞儀分析檢測

所有細(xì)胞樣本均用含0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA的DPBS重懸，細(xì)胞進(jìn)行熒光染色后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測。流式數(shù)據(jù)用FlowJo_v10.7.1版軟件(Treestar)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。具體染色方案如下。巨噬細(xì)胞：CD45+7AAD-F4/80+CD11b+Ly6G-；中性粒細(xì)胞：CD45+7AAD-CD11b+Ly6G-；M1型巨噬細(xì)胞：CD45+7AAD-F4/80+CD11b+Ly6G-CD11C+CD206-；M2型巨噬細(xì)胞：CD45+7AAD-F4/80+CD11b+Ly6G-CD11C-CD206+；CD4 T細(xì)胞：CD45+7AAD-CD3+NK1.1-CD4+CD8-；CD8 T細(xì)胞：CD45+7AAD-CD3+NK1.1-CD4-CD8+；雙陰性T細(xì)胞(double negative T cell,DN T)：CD45+7AAD-CD3+NK1.1-CD4-CD8-；Th1細(xì)胞：CD45+7AAD-CD3+NK1.1-CD4+CD8-IFNγ+；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)：CD45+7AAD-CD3+NK1.1-CD4+CD8-Foxp3+。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 機(jī)械研磨和不同酶消化對脂肪組織免疫細(xì)胞活性及獲取量的影響的比較

機(jī)械研磨、Ⅱ型膠原酶、Ⅳ型膠原酶、Liberase酶消化4種方式所獲得的CD45+的免疫細(xì)胞7AAD陰性的細(xì)胞為活細(xì)胞。如圖1所示，上述4種消化方式，所獲得的細(xì)胞的死亡率依次為30.7%±3.73%，9.71%±1.01%，14.3%±2.11%和6.43%±1.23%。其中機(jī)械研磨對免疫細(xì)胞造成的損傷最大，死亡細(xì)胞比例最高；Ⅱ型膠原酶和Liberase酶消化的方式對免疫細(xì)胞造成的損傷較小，死亡細(xì)胞比例最低。各組之間死亡細(xì)胞比例差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

每只小鼠的附睪周圍脂肪組織中，通過上述4種消化方式能獲得的有活性的CD45+的免疫細(xì)胞數(shù)量如圖1所示，上述4種消化方式所能獲得的7AAD-CD45+的免疫細(xì)胞數(shù)依次為0.55×105±0.12×105、1.12×105±0.11×105、0.80×105±0.15×105、1.35×105±0.13×105。其中機(jī)械研磨所獲得的免疫細(xì)胞數(shù)最少，Ⅱ型膠原酶消化和Liberase酶消化所獲得的免疫細(xì)胞數(shù)最多。各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 比較機(jī)械研磨和不同酶消化的方式所能獲得的脂肪組織免疫細(xì)胞的數(shù)量及活性Fig.1 Comparison of the number and activity of adipose tissue immune cells obtained by mechanical grinding and different enzymatic digestion methodsA: a typical flow gating process for detecting the activity of immune cells in adipose tissue； B： Survival of CD45+ immune cells in adipose tissue was detected by 7AAD staining under mechanical grinding and different enzymatic digestion methods; C: statistical analysis of the mortality of CD45+ immune cells obtained in different ways; D: statistical analysis of the number of immune cells that obtain active CD45+ in different ways; *P<0.05; **P<0.01.

2.2 Liberase酶消化和Ⅱ型膠原酶消化的最佳作用條件的優(yōu)化

分別應(yīng)用嗜熱菌蛋白酶低、中及高含量的Liberase,消化脂肪組織，免疫細(xì)胞死亡率分別為11.8%±1.23%、7.76%±1.13%、5.17%±0.67%,嗜熱菌蛋白酶含量越高，對CD45+免疫細(xì)胞的損傷越小，其死亡率也越低，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

用不同濃度的 Ⅱ 型膠原酶(0.5、1.0、2.0 mg/mL)對脂肪組織進(jìn)行消化。CD45+免疫細(xì)胞死亡率分別為8.21%±1.01%、12.7%±1.41%、20.8%±2.03%,各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。隨著Ⅱ型膠原酶濃度的增加，免疫細(xì)胞的死亡率增加，0.5 mg/mL的Ⅱ型膠原酶造成的CD45+免疫細(xì)胞的死亡率最低。

將作用條件優(yōu)化后的Liberase及Ⅱ型膠原酶進(jìn)行比較，嗜熱菌蛋白酶高含量的Liberase消化后的免疫細(xì)胞死亡率要比0.5 mg/mL的Ⅱ型膠原酶消化后的免疫細(xì)胞死亡率低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果詳見圖2。

圖2 不同作用條件的Liberase及Ⅱ型膠原酶消化對脂肪組織免疫細(xì)胞存活的影響Fig.2 Effect of Liberase and type Ⅱ collagenase digestion under different conditions on the survival of adipose tissue immune cellsA: a typical flow chart of digesting adipose tissue with Liberase containing different amounts of thermolysin and different concentrations of type Ⅱ collagenase, affecting the survival of immune cells; B: statistical analysis of digesting adipose tissue with Liberase of different enzyme content and type Ⅱ collagenase of different concentration, affecting the survival of immune cells; ** P<0.01.

2.3 肥胖過程中，脂肪組織中巨噬細(xì)胞的促炎作用明顯增強(qiáng)

C57BL/6J小鼠喂養(yǎng)高脂飼料16周后，小鼠的體質(zhì)量明顯增加，并伴隨有胰島素抵抗的發(fā)生(圖3A，B)。同時(shí)肥胖小鼠脂肪組織中，免疫細(xì)胞的浸潤明顯增加(圖3C)。利用上述優(yōu)化的脂肪組織消化方案，對脂肪組織中的固有免疫細(xì)胞亞群，特別是中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示，HFD飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪組織中中性粒細(xì)胞的比例(1.46×105±0.36×105)較(圖3D)正常組(0.52×105±0.13×105)增加(P<0.01)。

肥胖小鼠中，脂肪組織巨噬細(xì)胞的比例明顯增加，占CD45+免疫細(xì)胞的比例，正常組為17.1%±2.34%，HFD誘導(dǎo)的肥胖組為26.0%±4.51%(P<0.01)。巨噬細(xì)胞中主要是M1型巨噬細(xì)胞(CD11C+CD206-)的比例明顯增加，而M2型巨噬細(xì)胞(CD11C-CD206+)的比例明顯降低(圖3E、F)。肥胖小鼠脂肪組織中分泌TNF-α的巨噬細(xì)胞比例明顯增加，其中正常組為5.55%±1.13%，HFD誘發(fā)的肥胖組為14.9%±3.13%(P<0.01)。同時(shí)，肥胖小鼠的脂肪組織中TREM1+巨噬細(xì)胞的比例明顯增加，其中正常組為24.0%±3.85%，HFD誘發(fā)的肥胖組為50.4%±5.34%(圖3G～H)。

圖3 高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪組織中巨噬細(xì)胞比例及促炎作用的分析Fig.3 Analysis of the proportion of macrophages and their pro-inflammatory effects in adipose tissue of obese HFD miceA: The body weight changes of mice fed with normal diet and HFD for 16 weeks. B: The glucose tolerance test (GTT) showed that the insulin resistance level of high-fat diet mice was significantly higher than that of normal diet mice after 16 weeks of feeding mice with different diets. C: It was confirmed by hematoxylin-eosin staining that the number of inflammatory cells infiltrated in adipose tissue of obese mice was significantly higher than that of normal mice. D: It was confirmed by flow cytometry that the proportion of CD11b+Ly6G+ neutrophils in the adipose tissue of obese mice to CD45+ immune cells was significantly higher than that of normal diet mice. E,F: It was confirmed by flow cytometry that the proportion of macrophages and M1 type macrophages in adipose tissue of obese mice was significantly higher than that of normal mouse adipose tissue, while the proportion of M2 type macrophages was significantly reduced. G,H: Compared with normal diet mice, the ability of macrophages in adipose tissue of obese mice to secrete TNF-α and the expression of TREM1 were significantly increased. *P<0.05； **P<0.01; HFD: high-fat diet; NCD: normal control diet; TNF-α: tumor necrosis factor-α; TREM1: triggering receptor expressed on myeloid cells 1.

2.4 肥胖過程中，脂肪組織中促炎T細(xì)胞的比例明顯增加

檢測NCD小鼠及HFD小鼠中適應(yīng)性免疫細(xì)胞比例,結(jié)果顯示，HFD組CD3 T淋巴細(xì)胞占CD45+免疫細(xì)胞的比例(NCD組:38.3±2.31%；HFD組:47.5%±3.29%)，特別是CD8 T細(xì)胞的比例(NCD組:6.72±2.28%；HFD組:16.8%±3.31%)，明顯增加；而NK細(xì)胞(NCD組:11.6%±2.32%；HFD組:6.31%±1.35%)及雙陰性T細(xì)胞(DN T，NCD組:14.0%±1.21%；HFD組:8.33%±1.30%)的比例均有明顯的降低(圖4A～C)(P<0.01)。

在小鼠肥胖過程中，Th1細(xì)胞占CD4 T細(xì)胞的比例明顯增加(NCD組:7.02%±1.35%；HFD組:12.3%±2.35%,P<0.01)，而Treg細(xì)胞占CD4T細(xì)胞的比例有一定程度的降低(NCD組:7.21%±1.35%；HFD組:6.02%±1.15%)。同時(shí)，與NCD小鼠相比，HFD小鼠脂肪組織中Th1與Treg的比值也明顯增加(Th1/Treg：2.18±0.56,P<0.01)(圖4D～F)。

圖4 高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪組織中T淋巴細(xì)胞比例及促炎作用的分析Fig.4 Analysis of the proportion and pro-inflammatory effects of T lymphocytes in adipose tissue of obese mice induced by high-fat diet A-C: typical graphs and statistical analysis of the proportion of T lymphocytes, NK cells and NKT cells in CD45+ immune cells in the adipose tissue of mice on normal diet and high-fat diet by flow cytometry; D-F: typical graphs and statistical analysis of the proportion of Th1 and Treg cells in the adipose tissue of mice on normal diet and high-fat diet by flow cytometry; HFD: high-fat diet; NCD: normal control diet; NK: natural killer cell; IFN-γ: interferon-γ; NKT: natural kill T cell; DN T: double negative T cell; *P<0.05; **P<0.01.

3 討論

肥胖是一種代謝性疾病，同時(shí)也是一種慢性炎癥疾病。探討脂肪組織中免疫細(xì)胞的比例及炎癥狀態(tài)，對于深入了解肥胖及胰島素抵抗的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要意義。本研究試圖提供一種高效、低損傷的分離檢測脂肪組織免疫細(xì)胞的方式，以期為脂肪組織內(nèi)炎癥反應(yīng)的研究提供技術(shù)支持。

目前，關(guān)于脂肪組織中免疫細(xì)胞分離的技術(shù)主要有兩類：機(jī)械研磨法和酶消化法。機(jī)械研磨法簡單、快速、費(fèi)用低。但通過機(jī)械研磨法得到細(xì)胞的活力顯著低于酶消化法，且機(jī)械分離得到的免疫細(xì)胞亞群往往缺乏CD34表達(dá)[3]。膠原酶是酶消化法中最常用的酶類，其具有獨(dú)特的水解天然膠原蛋白的能力，可消化脂肪、肝臟等組織中的細(xì)胞外基質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于動物組織中細(xì)胞的分離[4]。早期，膠原酶主要用于分離脂肪組織中的脂肪細(xì)胞及脂肪前體細(xì)胞，并用于脂肪細(xì)胞代謝的研究[5]。隨著流式細(xì)胞檢測技術(shù)的發(fā)展，通過膠原酶消化的方式，分離脂肪組織中的免疫細(xì)胞，并對其亞群、比例進(jìn)行流式檢測也愈發(fā)普遍。有文獻(xiàn)[6-8]顯示，以膠原酶為基礎(chǔ)的酶消化方式獲得有核細(xì)胞的效率要明顯高于機(jī)械研磨的方式。而本研究也比較了機(jī)械研磨和酶消化對脂肪組織免疫細(xì)胞的獲取量及免疫細(xì)胞活性的影響，與之前報(bào)道[6-8]一致，與機(jī)械研磨相比，膠原酶消化能獲得脂肪組織免疫細(xì)胞的產(chǎn)量更高，對免疫細(xì)胞損傷更低，活性也更好。

目前常用于酶消化的膠原酶類，主要包括Ⅱ型膠原酶、Ⅳ型膠原酶及Liberase等。其中Ⅱ型膠原酶常用于脂肪細(xì)胞的消化分離[9-11]，Ⅳ型膠原酶常用于胎盤組織[12]、肝臟組織[13]等的消化分離。Liberase主要是將高度純化的膠原酶Ⅰ、膠原酶Ⅱ和嗜熱菌蛋白酶按精確比例混合，從而達(dá)到高效的解離原代組織的目的，常用于皮膚組織、脂肪組織的消化[14]。而本結(jié)果也顯示，Liberase酶能有效地提高脂肪組織免疫細(xì)胞的獲得率，且對免疫細(xì)胞的損傷最低。嗜熱菌蛋白酶是Liberase酶類的主要成分之一，是一種非梭菌中性蛋白酶，其能夠快速水解疏水性強(qiáng)的氨基酸，具有分離產(chǎn)量高、分離得到的細(xì)胞活力強(qiáng)等特點(diǎn)[15]。Liberase 酶類根據(jù)其中嗜熱菌蛋白酶含量的不同，又可分為低含量、中含量及高含量3種。筆者發(fā)現(xiàn)，隨著嗜熱菌蛋白酶含量的增加，脂肪組織免疫細(xì)胞的獲得率增高，所獲得免疫細(xì)胞的活性增強(qiáng)，說明嗜熱菌蛋白酶在脂肪組織免疫細(xì)胞的消化分離中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。同時(shí)本的結(jié)果也提示，嗜熱菌蛋白酶高含量的Liberase是最佳的消化分離脂肪組織中免疫細(xì)胞的酶類。

脂肪組織的炎癥反應(yīng)是誘發(fā)肥胖及胰島素抵抗的核心[16]。其中的巨噬細(xì)胞是調(diào)控脂肪組織炎癥反應(yīng)的主要免疫細(xì)胞，可分為M1、M2兩種類型。M1型巨噬細(xì)胞主要分泌促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等，也能通過激活一氧化氮合酶產(chǎn)生活性氧及一氧化氮，加重脂肪組織炎癥反應(yīng)[17]。而M2型巨噬細(xì)胞主要分泌抑炎因子IL-10，并通過分泌趨化因子CCL22，趨化Treg細(xì)胞向脂肪組織募集，從而起到抑制脂肪組織炎癥反應(yīng)的作用[18]。本研究證實(shí)，肥胖過程中巨噬細(xì)胞比例增加，主要是促炎的M1型巨噬細(xì)胞的比例明顯上調(diào)，而M2型巨噬細(xì)胞比例明顯下調(diào)，這也可能是誘發(fā)脂肪組織炎癥反應(yīng)的重要原因之一。TREM1是表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞膜表面的受體蛋白，其能招募巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞至炎癥部位，亦能促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6、CCL2等炎性因子，級聯(lián)放大組織中的炎癥反應(yīng)[19]。本研究也證實(shí)，肥胖過程中脂肪組織TREM1+的巨噬細(xì)胞比例明顯增加，而這有可能是誘發(fā)脂肪組織炎癥反應(yīng)的另一重要因素。

脂肪組織巨噬細(xì)胞的活化能分泌大量趨化因子促進(jìn)T淋巴細(xì)胞向炎癥部位募集。不同的T淋巴細(xì)胞亞群在脂肪組織炎癥反應(yīng)中發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用。其中Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ也能促進(jìn)巨噬細(xì)胞在脂肪組織中的募集活化，加重脂肪組織中的炎癥反應(yīng)[20]。而Treg細(xì)胞，作為一種調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，可抑制CD4、CD8 T細(xì)胞的活化增殖，炎性因子分泌及細(xì)胞毒性等，發(fā)揮抗炎作用,也能增加脂肪細(xì)胞對胰島素的敏感性，提高脂肪細(xì)胞葡萄糖的攝入量[21]。由此可見，Th1及Treg細(xì)胞的比例及促炎、抑炎的平衡，在調(diào)控脂肪組織炎癥及肥胖過程功能中也發(fā)揮著重要作用。而本研究也顯示，在肥胖過程中，脂肪組織中Th1細(xì)胞的比例明顯增加，而Treg細(xì)胞的比例有一定程度降低，其中Th1與Treg細(xì)胞的比值增加最為明顯。這進(jìn)一步證實(shí)，肥胖過程中Th1與Treg促炎抑炎的失衡，也是導(dǎo)致脂肪組織炎癥反應(yīng)的重要原因之一。

總之，通過此研究，建立了一套以嗜熱菌蛋白酶含量較高的Liberase為核心的高效消化分離脂肪組織免疫細(xì)胞的方法，此方法獲得的脂肪組織免疫細(xì)胞數(shù)量較多，且免疫細(xì)胞活性較高。通過此方法，進(jìn)一步檢測了肥胖過程中，脂肪組織免疫細(xì)胞亞群的變化。筆者發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞在脂肪組織中的促炎作用明顯增強(qiáng)，這可能是導(dǎo)致脂肪組織炎癥，誘發(fā)肥胖發(fā)病的關(guān)鍵因素。通過此研究，希望能為深入探索肥胖及胰島素抵抗中的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制提供研究基礎(chǔ)及技術(shù)支持。