馮曉娜，付穎

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

根尖周炎是根尖周組織抵御侵入和感染牙髓的微生物及其釋放產(chǎn)物過程破壞了根尖微生態(tài)平衡所致的疾病。由于長期激惹和機(jī)體自身防御機(jī)制不足，致使根尖周結(jié)締組織及骨組織破壞性吸收。根尖周病的骨缺失可能是細(xì)菌及表面成分的間接作用后果[1]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一種酶活性中心，結(jié)合游離狀態(tài)下的鈣鋅離子而激活以后發(fā)揮蛋白分解功能，具有高度恒定性，廣泛存在于全身的結(jié)締組織中，參加水解幾乎細(xì)胞外基質(zhì)的全部成分，其中也包括骨組織[2]。MMP-9是MMPs家族中的明膠酶，也稱IV型膠原酶，除了可水解自然的IV、V、VII、XI膠原外，也可以水解與某些分子結(jié)合后的I、II、III型膠原明膠，還能在某種程度上降解纖維連接蛋白、彈力蛋白。骨膠原是根尖周骨組織的重要組成部分，位于骨表面的膠原層降解以后，骨的脫礦和吸收才能相繼發(fā)生，MMP-9通過降解骨膠原而在骨吸收中起到了不可忽視的作用，MMP-9還可以降解細(xì)胞外基質(zhì)輔助骨組織的吸收，多數(shù)研究表明MMP-9的表達(dá)量與根尖周炎的骨吸收量有關(guān)[3]。親環(huán)素(cyclophilins，Cyps)是一類具有高度保守性的多功能蛋白家族，在真菌、細(xì)菌、植物、昆蟲和哺乳動物中廣泛存在。目前的研究發(fā)現(xiàn)親環(huán)素有 16個(gè)成員，家族高度保守性表現(xiàn)為其疏水區(qū)域的氨基酸排列次序近乎相同。CyPA擁有肽脯氨酰順反異構(gòu)酶功能。CyPA可以促進(jìn)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activate protein kinase，MAPK)信號通路中的p38、MAPK 和C-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase，JNKs)的活化[4-5]。CyPA通過與受體胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)劑(extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN)結(jié)合，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腹主動脈瘤等多種疾病中促進(jìn)MMP-9表達(dá)增多活性增強(qiáng)。已有研究證實(shí)，CyPA的配體EMMPRIN在牙周組織成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞表面高表達(dá)[6]，MMP-9在破骨細(xì)胞功能的初級階段可能已經(jīng)起到一定的作用，CyPA可能通過與配體結(jié)合后，影響MMP-9的表達(dá)導(dǎo)致根尖周炎的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)旨在通過檢測根尖周肉芽腫及根尖囊腫中CyPA及MMP-9的表達(dá)情況，從而探討CyPA及MMP-9表達(dá)與根尖周骨吸收的聯(lián)系。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

2013年10月至2015年5月在錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院就醫(yī)的經(jīng)根尖手術(shù)或牙拔除術(shù)的根尖周病損組織32例?；颊吣挲g在18～65歲之間，平均48歲，男20例，女12例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)受試者均口腔無其他疾病；(2)無其他全身系統(tǒng)性疾病；(3)3個(gè)月內(nèi)沒有服用抗生素和或其他激素類藥物；(4)非孕婦；(5)牙髓無活力，X線檢查診斷為根尖肉芽腫或根尖囊腫。不符合納入標(biāo)準(zhǔn)者，予以排除。8例因正畸需求拔除的健康前磨牙牙髓作對照組。入選患者已然明確了研究目的，自愿進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，并簽署了知情同意書。本研究經(jīng)錦州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會同意備案。

1.2 根尖周骨吸收面積測量

應(yīng)用平行線投照技術(shù)在保持放射條件不變前提下進(jìn)行X線拍攝，每次均64 kV，6.5 mA，曝光時(shí)間0.4 s，距離5 cm，進(jìn)行初步鑒別。根肉芽腫X線片示圍繞根尖部的圓形或橢圓形病變范圍較小界線清楚的透射影。根尖囊腫X線片示患牙根尖病變范圍略大透射區(qū)，邊界清楚，周圍有致密骨白線圍繞。另一名研究者進(jìn)行盲法測量，將全部X線片轉(zhuǎn)換成為BMP圖片格式，并應(yīng)用Image-Pro plus 6.0系統(tǒng)測量是病變區(qū)病損骨密度值均值。

1.3 CyPA及MMP-9蛋白檢測

取正常牙髓根尖1/3作為對照組，根尖手術(shù)后取出組織為實(shí)驗(yàn)組，常規(guī)脫水石蠟包埋切片，HE染色后組織學(xué)觀察。免疫組化檢測CyPA及MMP-9蛋白表達(dá)。常規(guī)切片脫蠟至水，抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加一抗，兔抗人CyPA隆抗體稀釋濃度為1∶300，兔抗人MMP-9單克隆抗體稀釋濃度為1∶400，于濕盒內(nèi)4 ℃冰箱中孵育16～20 h，滴加二抗，于37 ℃恒溫水域箱中孵育30 min，DAB染色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS替代一抗孵育切片作為陰性對照。CyPA及MMP-9 陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜或細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒。用倒立式熒光顯微鏡拍攝于400倍下隨機(jī)選取5個(gè)視野，用Image-Pro plus 6.0圖像處理系統(tǒng)計(jì)每張切片上CyPA、MMP-9的蛋白平均吸光度值(A值)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 CyPA、MMP-9蛋白表達(dá)水平

實(shí)驗(yàn)組CyPA和MMP-9表達(dá)量顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2～5、表1。CyPA在實(shí)驗(yàn)組與對照組的組間表達(dá)中差異明顯(F=73.400，P<0.05)，MMP-9在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)明顯高于對照組(F=33.644，P<0.05)；CyPA在根尖肉芽腫中表達(dá)多于根尖囊腫，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但MMP-9根尖肉芽腫組與根尖囊腫組并無明顯差異性。

圖1 正常牙髓(HE，400×)

圖2 CyPA在根尖肉芽腫的表達(dá)(DAB，400×)

圖3 CyPA在根尖囊腫的表達(dá)(DAB，400×)

圖4 MMP-9在根尖肉芽腫的表達(dá)(DAB，400×)

圖5 MMP-9在根尖囊腫的表達(dá)(DAB，400×)

表1 在根尖周炎患者與對照組患者CyPA、MMP-9

2.2 根尖周病根尖區(qū)CyPA蛋白與MMP-9蛋白的相關(guān)性分析

對于根尖周病患者根尖區(qū)CyPA蛋白與MMP-9蛋白的相關(guān)性分析，統(tǒng)計(jì)散點(diǎn)圖，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性分析，根尖周病CyPA蛋白與MMP-9蛋白平均吸光度值表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.506，P=0.003)，在α=0.01水平上顯著相關(guān)，見圖6。

圖6 根尖周病患者根尖區(qū)CyPA蛋白與MMP-9蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

2.3 CyPA、MMP-9蛋白表達(dá)與根尖周炎病損區(qū)骨密度的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示CyPA蛋白吸光度值和根尖周骨密度值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.410，P< 0.05)，見圖7；MMP-9 蛋白吸光度值和根尖周骨密度值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0748，P< 0.05)，見圖8。

圖7 CyPA蛋白表達(dá)與根尖周骨密度的相關(guān)性分析

圖8 MMP-9蛋白表達(dá)與根尖周骨密度的相關(guān)性分析

3 討 論

根尖周炎主要是由根管感染蔓延至根尖引起的局部炎癥性骨破壞疾病，此過程涉及多種細(xì)胞及其釋放因子的參與，在根尖周病變中有多種細(xì)胞參與了炎癥反應(yīng)如淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞等，也有研究發(fā)現(xiàn)[7]

CyPA多表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞上，集中于血管壁并通過介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和積聚使大量炎性細(xì)胞增生，繼而血管重建，而毛細(xì)血管增生、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤是根尖肉芽腫的主要病理表現(xiàn)，而根尖周炎的另一重要臨床表現(xiàn)是骨的吸收，破骨細(xì)胞是根尖周炎骨吸收的重要細(xì)胞，大量實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)MMP-9是破骨細(xì)胞成熟的表面標(biāo)志物之一[8]，M-CSF，RANKL可以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞成熟并表達(dá)MMP-9[9]，RANK表達(dá)升高可以促進(jìn)MMP-9的表達(dá)使破骨細(xì)胞活化[10]，MMP-9抑制后，破骨細(xì)胞遷移功能減弱[11]。

CyPA和MMP-9的共同作用在口腔領(lǐng)域研究極少，在類風(fēng)濕性疾病、心血管疾病、腫瘤等領(lǐng)域有較多的研究。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，細(xì)胞外CyPA與其膜受體EMMPRIN相互作用促進(jìn)MMP-9的表達(dá)及巨噬細(xì)胞粘附，近而破壞軟骨與骨組織[12]，表明CyPA和MMP-9的協(xié)同作用在軟骨和骨的降解中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與之一致，CyPA和MMP-9的蛋白表達(dá)在根尖周炎的發(fā)展中起協(xié)同作用。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)[13]發(fā)展中CyPA可促進(jìn)單核細(xì)胞分泌炎癥因子IL-6，誘導(dǎo)單核細(xì)胞遷移趨化，CyPA通過NF-кB-MAPK炎癥信號通路增強(qiáng)單核細(xì)胞表達(dá)的MMP-9活性，As是血管壁對各種損害過度應(yīng)答引起的一系列慢性炎癥過程。PCR檢測喉癌中EMMPRIN及MMP-9 mRNA表達(dá)量相較于良性者明顯上調(diào)，且MMP-9 mRNA的相對表達(dá)量與EMMPRIN mRNA的相對表達(dá)量均成正相關(guān)關(guān)系[14]，也提示腫瘤骨轉(zhuǎn)移及骨破壞過程與三者的作用相關(guān)。在口腔專業(yè)領(lǐng)域，初次有學(xué)者發(fā)現(xiàn)了CyPA參與了牙周病的發(fā)生與發(fā)展[15]，隨后國內(nèi)有學(xué)者初次在根尖周炎組織中檢測到了CyPA的存在[16]。

本實(shí)驗(yàn)中可見CyPA大量聚集于淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞，少見于巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞，MMP-9大量表達(dá)于主要表達(dá)在淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞，少見漿細(xì)胞，CyPA和MMP-9在慢性根尖周炎組織同時(shí)高表達(dá)于單核細(xì)胞，提示CyPA促進(jìn)根尖周炎中MMP-9的表達(dá)，這一過程可能一方面通過CyPA通過NF-кB-MAPK炎癥信號通路促進(jìn)單核細(xì)胞表達(dá)MMP-9進(jìn)一步發(fā)揮促炎作用，CyPA配體EMMPRIN高表達(dá)于破骨細(xì)胞表面，CyPA表達(dá)升高可能刺激根尖周組織表達(dá)TNF-α，IL-6，IL-1，IL-11而后促進(jìn)RANKL的激活發(fā)揮對根尖周炎骨吸收的促進(jìn)作用，RANKL，IL-1、IL-6、IL-11、TGF-α可以使MMP-9表達(dá)升高活化破骨細(xì)胞，趨化單核細(xì)胞，所以推測另一方面CyPA在與配體EMMPRIN 結(jié)合后可能通過細(xì)胞因子TNF-α，IL-6，IL-1，IL-11，RANKL的作用使MMP-9協(xié)同表達(dá)，實(shí)驗(yàn)中MMP-9在根尖周炎組織的表達(dá)顯著高于對照組，提示MMP-9在根尖周炎的發(fā)展中起到促進(jìn)作用，這一作用的發(fā)揮可能是通過M-CSF，RANKL，IL-1、IL-6對MMP-9的促進(jìn)使破骨細(xì)胞活化，上調(diào)中性粒細(xì)胞表達(dá)，發(fā)揮骨吸收作用。CyPA和MMP-9在根尖周肉芽及囊腫的骨吸收中所起到的協(xié)同表達(dá)可能通過單核細(xì)胞、破骨細(xì)胞發(fā)揮作用，明確調(diào)節(jié)機(jī)制仍需更多研究加以說明。臨床中慢性根尖周炎癥主要表現(xiàn)為根尖肉芽腫和根尖囊腫，臨床中根尖肉芽腫可能最終發(fā)展為根尖囊腫，而兩者之間的鏡下的主要鑒別在于是否存在復(fù)層鱗狀上皮，CyPA在上皮細(xì)胞表達(dá)提示CyPA可能對根尖肉芽腫向根尖囊腫的轉(zhuǎn)化起促進(jìn)作用。

綜上所述，本研究中CyPA和MMP-9在根尖周炎中的表達(dá)顯著高于正常牙髓組織，CyPA和MMP-9的表達(dá)與根尖區(qū)骨密度值呈負(fù)相關(guān)，兩者不僅參與根尖炎癥的發(fā)生過程，而且與根尖骨吸收可能密切相關(guān)。CyPA和MMP-9與全身的炎癥性疾病有一定相關(guān)性，可能通過調(diào)節(jié)全身或局部的炎癥反應(yīng)參與了根尖周牙槽骨的破壞。