劉禮姣，邱慶竹，鄭均敏，謝利劍

(上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，上海市兒童醫(yī)院，上海 200062)

肺動(dòng)脈高壓(PAH)是一種病因復(fù)雜、高致死性進(jìn)行性的心血管疾病，主要表現(xiàn)為逐漸升高的肺動(dòng)脈壓力，最終可導(dǎo)致肺血管重構(gòu)、右心室肥大和功能衰竭，甚至死亡[1]。肺動(dòng)脈細(xì)胞尤其是肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmo-nary aterial smooth muscle cells，PASMCs)無序增殖增加和凋亡減少引起的肺血管重塑是PAH發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)[2]。目前，臨床上廣泛應(yīng)用的靶向藥物治療，如前列環(huán)素類、內(nèi)皮素受體拮抗劑、磷酸二酯酶抑制劑等不能從根本上逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)，對(duì)PAH的療效并不理想，因此，關(guān)于PAH的臨床診治依然極具挑戰(zhàn)性。

丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA，TanⅡA)是丹參中含量豐富的脂溶性活性藥理成分，具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈血管、改善微循環(huán)、保護(hù)心臟、減少和清除血小板聚集、增強(qiáng)機(jī)體抗缺氧能力、拮抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基等重要作用。研究[3-5]發(fā)現(xiàn)，Tan Ⅱ A通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡及影響其自噬與增殖發(fā)揮良好的抗腫瘤活性。Tan Ⅱ A通過降低細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑P27蛋白降解，使細(xì)胞周期停止在G0/G1期，抑制PASMCs增殖，但Tan Ⅱ A對(duì)PASMCs自噬與凋亡的影響目前尚不明確[6]。研究[7]顯示，經(jīng)典的抗凋亡通路磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol-3-kinase/Akt，PI3K/Akt)在自噬中也發(fā)揮著重要調(diào)控作用。因此，本研究通過建立低氧誘導(dǎo)PAH小鼠及細(xì)胞模型，分析TanⅡA對(duì)PAH的治療作用，并初步探討TanⅡA對(duì)低氧誘導(dǎo)的PAH中PI3K/Akt信號(hào)通路及自噬和凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

C57BL6雄性小鼠15只(8周齡，體質(zhì)量22～25 g，上海SLAC實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，TanⅡA(10 mg，純度≥97%，美國Sigma，加入1 mL二甲基亞砜將其充分溶解，配制成濃度為10 mg/mL的原液)，二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma)，BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(北京BLKW Biotechnology)，RIPA裂解液、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測(cè)試劑盒、脂質(zhì)氧化(MDA)檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)，常壓低氧實(shí)驗(yàn)箱(長沙長錦科技有限公司)，測(cè)氧儀(浙江建德電化學(xué)儀器廠)，PowerLab Systerm電生理信號(hào)采集儀、聚乙烯導(dǎo)管(AD Instruments 公司)，人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(hPASMCs，美國Sciencell)，平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基、平滑肌細(xì)胞生長因子、青霉素/鏈霉素溶液(雙抗，美國Sciencell)，胎牛血清(北京Solarbio)，無酚紅細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM，美國Gibco)，胰蛋白酶消化液(北京Solarbio)，聚丙烯酰胺凝膠預(yù)混液(上海碧云天生物技術(shù)公司)，預(yù)染蛋白Marker(美國Thermo Fisher)，Loading Buffer及ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(新賽美生物科技公司)，兔抗鼠磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體(英國CST)，兔抗鼠Bax多克隆抗體(一抗，美國Proteintech Group)，兔抗鼠P62抗體(一抗，美國CST公司)，兔抗鼠Akt抗體(一抗)及兔抗鼠磷酸化Akt(Phosphorylated-Akt，P-Akt)抗體(一抗，美國CST公司)，辣根過氧化酶標(biāo)記二抗(山羊抗兔，英國CST公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(日本SANYO)，三氣培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 低氧動(dòng)物模型建立及分組 取15只8周齡C57BL6雄性小鼠，體質(zhì)量22～25 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組：常氧組(n=5)、低氧組(n=5)和低氧+TanⅡA組(n=5)。常氧組呼吸正常空氣，低氧組和低氧+TanⅡA組置于常壓低氧箱內(nèi)，采用測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)使箱內(nèi)氧濃度維持在10.0%±0.5%，石灰鈉和無水氯化鈣吸收箱內(nèi)過量的CO2及水蒸氣，將CO2濃度控制在0.5%以內(nèi)，每天低氧24 h，連續(xù)2周。2周后低氧+TanⅡA組每天腹腔注射TanⅡA 10 mg/(kg·d)，其他兩組小鼠腹腔注射磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)，連續(xù)2周，2周中低氧組和低氧+TanⅡA組繼續(xù)置于低氧環(huán)境中，在4周造模過程中3組小鼠均置于同一房間內(nèi)，飼養(yǎng)條件相同，每天均自由進(jìn)食及飲水。

1.2.2 小鼠右心室壓力測(cè)定、取材及肺組織病理學(xué)觀察 4周造模結(jié)束后稱量小鼠質(zhì)量，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(10 μL/g)使小鼠麻醉，待其進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，取仰臥位用細(xì)線固定四肢及門牙在解剖臺(tái)上，頸部皮膚消毒后進(jìn)行頸部正中切口，逐層鈍性分離肌肉、結(jié)締組織，游離右側(cè)頸外靜脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，動(dòng)脈夾夾閉近心端，用聚乙烯導(dǎo)管(導(dǎo)管內(nèi)充滿0.5%肝素溶液，抗凝血)行右側(cè)頸外靜脈插管術(shù)，固定導(dǎo)管，導(dǎo)管另一端經(jīng)壓力換能器與Power Lab 電生理信號(hào)采集儀相連，記錄右心室收縮壓(RVSP)。測(cè)壓結(jié)束后，對(duì)小鼠胸腹部皮膚消毒，迅速打開胸腔，充分暴露心、肺等臟器，取裝有適量磷酸鹽緩沖溶液(PBS)的5 mL注射器，用針頭迅速刺入右心室，緩慢注入PBS進(jìn)行灌流，然后小心分離心、肺。其中右肺放置于無酶凍存管中后立即置于液氮罐內(nèi)快速冷卻，隨后置于-80 ℃低溫冰箱內(nèi)保存，用于后續(xù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，左肺以4%甲醛溶液固定24 h后，行病理切片及蘇木精伊紅染色法(HE)染色。

1.2.3 小鼠肺組織中氧化應(yīng)激相關(guān)產(chǎn)物檢測(cè) 取-80 ℃低溫冰箱中冷凍備用的肺組織適量，采用預(yù)冷生理鹽水沖洗除去血液，吸水紙吸干稱質(zhì)量后迅速置于1.5 mL無菌EP管中，加入適量RIPA裂解液(肺組織質(zhì)量占裂解液比例為10%)，采用超聲波細(xì)胞破碎儀充分磨碎后再靜置裂解10 min(以上操作均在冰上進(jìn)行)，10 min后10%肺組織勻漿于4 ℃離心，12 000 r/min，離心10 min，然后取上清液并轉(zhuǎn)移至新標(biāo)記好的1.5 mL EP管內(nèi)，采用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定上清液蛋白濃度。參照試劑盒說明書，分別采用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定小鼠肺組織MDA水平，WST-8法測(cè)定小鼠肺組織中總SOD活性。

1.2.4 PASMCs培養(yǎng) PASMCs采用配制好的hPASMCs培養(yǎng)基(由基礎(chǔ)平滑肌培養(yǎng)液、2.0%胎牛血清、0.5%平滑肌細(xì)胞生長因子和0.5%青霉素/鏈霉素雙抗混合制成)培養(yǎng)，每2天換液1次，待細(xì)胞生長達(dá)80%～90%，以0.25%胰蛋白酶消化分散細(xì)胞，離心后重懸，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)至第2～5代細(xì)胞即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，采用不含胎牛血清的無酚紅DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞同步化后隨機(jī)分成常氧組(n=3)、低氧組(n=3)、低氧+TanⅡA組(n=3)，TanⅡA濃度參照文獻(xiàn)[8]設(shè)定為5 μg/mL，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，其中常氧組置于37 ℃、5%CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h；低氧組和低氧+TanⅡA組放置于3%O2、5%CO2、95%N2低氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。

1.2.5 免疫印跡法(WB)檢測(cè)Bax、P62及P-Akt及Akt表達(dá) 24 h培養(yǎng)結(jié)束后，將預(yù)冷好的PBS溶液適量加入“1.2.4”項(xiàng)下3組細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿后棄去PBS，以上過程重復(fù)3次。洗凈培養(yǎng)皿內(nèi)原培養(yǎng)液后，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入適量含苯甲基磺酰氧(PMSF)的RIPA裂解液(1 mL裂解液中加入10 μL PMSF)，搖勻后置于冰上裂解30 min，采用潔凈的細(xì)胞刮輕輕將細(xì)胞完全收刮于培養(yǎng)皿一側(cè)，并用移液槍轉(zhuǎn)移至已標(biāo)記好的1.5 mL EP管內(nèi)，整個(gè)過程在冰上操作。將含有細(xì)胞裂解蛋白的EP管放入預(yù)冷好的離心機(jī)內(nèi)離心15 min，4 ℃，12 000 r/min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管內(nèi)做好標(biāo)記置于冰上。取上述上清液適量，采用蒸餾水稀釋12.5倍后進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。取50 μg蛋白樣品，10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜適當(dāng)時(shí)間，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氧乙烯(PVDF)膜上，裁膜后在常溫?fù)u床上5% BSA封閉緩沖液中封閉1 h，后將條帶分別浸于Bax(1∶2 000)、P62(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)、P-Akt(1∶2 000)的一抗稀釋液中4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜。洗膜3次，每次10 min，常溫下辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗稀釋液中孵育1 h，再洗膜3次，每次10 min。顯色液顯色后轉(zhuǎn)至暗箱內(nèi)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，應(yīng)用Image J軟件分析各目的蛋白及內(nèi)參GAPDH的灰度值，兩者灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 TanⅡA對(duì)3組小鼠RVSP的影響

4周造模結(jié)束后，低氧組小鼠意外死亡1只，常氧組及低氧+TanⅡA組小鼠均成功存活。右心導(dǎo)管測(cè)壓結(jié)果顯示，與常氧組比較，低氧組小鼠RVSP增加(t=9.149，P<0.05)；與低氧組比較，低氧+TanⅡA組RVSP降低(t=2.963，P<0.05)。見表1。

表1 TanⅡA對(duì)3組小鼠RVSP的影響

2.2 HE染色下3組小鼠肺組織病理學(xué)改變比較

常氧組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺小動(dòng)脈具有完整內(nèi)膜及正常平滑肌肌層組織，管壁周圍幾乎無炎癥細(xì)胞浸潤。與常氧組比較，低氧組可見肺小動(dòng)脈內(nèi)膜不光滑，管壁和平滑肌肌層組織增厚，血管腔減小，管壁周圍可見大量炎細(xì)胞浸潤。與低氧組比較，低氧+TanⅡA組病理改變減輕，肺小動(dòng)脈內(nèi)膜不光滑，管壁和平滑肌肌層組織有一定程度增厚，血管腔減小，管壁周圍炎細(xì)胞浸潤減少，見圖1。

常氧組 低氧組 低氧+TanⅡA組

2.3 3組小鼠肺組織中MDA含量及SOD活性變化比較

與常氧組比較，低氧組小鼠肺組織中MDA含量增加，SOD活性下降(t分別為3.164及4.446，P均<0.05)。與低氧組比較，低氧+TanⅡA組小鼠肺組織中MDA含量減少，SOD活性增加(t分別為2.306及3.058，P均<0.05)。見表2。

表2 3組小鼠肺組織中MDA含量及SOD活性變化比較 mg/prot

2.4 3組PASMCs中Bax、P62及PI3K/Akt信號(hào)通路中P-Akt蛋白表達(dá)水平比較

與常氧組比較，低氧組PASMCs中Bax蛋白表達(dá)降低，P62蛋白表達(dá)增加(t分別為47.930、19.110，P均<0.05)；與低氧組比較，低氧+TanⅡA組PASMCs中Bax蛋白表達(dá)增加，P62蛋白表達(dá)降低(t分別為4.218、8.700，P均<0.05)。與常氧組比較，低氧組PASMCs中P-Akt/Akt值增加(t=7.463，P<0.05)。常氧組與低氧+Tan Ⅱ A組P-Akt/Akt值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.266，P>0.05)。與低氧組比較，低氧+TanⅡA組PASMCs中P-Akt/Akt值降低(t=6.906，P<0.05)。見表3。

表3 3組PASMCs中Bax、P62及PI3K/Akt信號(hào)通路中P-Akt蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

PAH是一個(gè)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、起病隱匿的全球性健康問題，在任何年齡段均可發(fā)生，流行病學(xué)顯示，全球PAH發(fā)病率約1%[8]。異常增高的肺血管阻力和肺動(dòng)脈壓力為PAH的主要特征，這種壓力的持續(xù)增高與血管周圍炎癥反應(yīng)、PASMCs增殖異常、肺血管重塑以及血管異常收縮等多種因素相關(guān)[9-10]。PAH的定義為平均肺動(dòng)脈壓>25 mm Hg，正常肺毛細(xì)血管楔壓<15 mm Hg，且肺血管阻力>3 WU，目前診斷肺動(dòng)脈高壓金標(biāo)準(zhǔn)是右心導(dǎo)管檢查[11]。

本研究采用慢性低氧性PAH模型，選用體型較小，遺傳穩(wěn)定性較高的C57BL6小鼠，這種模型是基于薛全福等[12]的研究方法加以改造。低氧性PAH主要病理生理特征是肺血管收縮和肺血管重構(gòu)[13]。本研究結(jié)果顯示，隨著低氧時(shí)間延長，低氧組小鼠進(jìn)食量、進(jìn)水量、活動(dòng)量減少，精神狀態(tài)逐漸變差，但低氧組體質(zhì)量較常氧組改變不明顯；肺組織切片HE染色結(jié)果提示，與常氧組比較，低氧組肺血管壁和平滑肌肌層組織增厚、血管腔減小、管壁周圍大量炎性細(xì)胞浸潤，提示低氧導(dǎo)致肺血管重構(gòu)，與國外低氧建立小鼠PAH模型結(jié)果相似[14]?；诒菊n題組前期造模方法[15]及右心導(dǎo)管測(cè)壓、肺組織HE染色結(jié)果，本研究低氧誘導(dǎo)的小鼠PAH模型成功建立。同時(shí)，肺組織切片HE染色結(jié)果提示，與低氧組比較，低氧+TanⅡA組管壁和平滑肌肌層組織增厚程度減輕、管壁周圍炎細(xì)胞浸潤減少。右心導(dǎo)管測(cè)壓結(jié)果顯示，與常氧組比較，低氧組小鼠RVSP增加；與低氧組比較，低氧+TanⅡA組RVSP降低，表明TanⅡA可改善低氧狀態(tài)下的肺血管重塑，減輕低氧PAH中右心室收縮壓。本研究結(jié)果顯示，低氧組小鼠肺組織中SOD活性較常氧組下降，而MDA含量增加，低氧+TanⅡA組小鼠肺組織中SOD活性較低氧組增加，MDA含量降低，提示TanⅡA減少低氧PAH中氧化應(yīng)激水平，與既往研究[16]結(jié)果一致。有研究[17]顯示，氧化應(yīng)激在PAH發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著十分重要的作用。在PAH中，SOD活性下降，氧自由基清除能力下降，MDA含量增加，并與氧自由基等物質(zhì)結(jié)合，促進(jìn)PASMCs異常增殖，加重肺動(dòng)脈內(nèi)皮損傷，同時(shí)通過激活基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)參與細(xì)胞外基質(zhì)沉積，促進(jìn)肺血管重構(gòu)。因此，本研究中TanⅡA通過降低PAH中氧化應(yīng)激水平，減輕低氧PAH中肺血管重構(gòu)，達(dá)到治療PAH的作用。

早在1891年，Romberg E等[18]提出PAH患者肺部血管存在閉塞性病變和中層增厚現(xiàn)象，ARCHER S L等[19-21]先后使用來源于PAH患者的原代細(xì)胞模型或動(dòng)物模型的數(shù)據(jù)證明，PAH中PASMCs、肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(PAECs)和成纖維細(xì)胞中均存在一種增殖失衡，凋亡抵抗的類癌現(xiàn)象。He Y等[22]通過體外低氧條件下原代PASMCs培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)低氧組PASMCs中Bax表達(dá)低于常氧組。Yang C等[23]在低氧誘導(dǎo)PAH大鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，低氧組肺組織中細(xì)胞凋亡指數(shù)下降，通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)mRNA表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)低氧組肺組織中Bcl-2表達(dá)高于對(duì)照組，而Bax表達(dá)低于對(duì)照組。Lu J Y等[24]在研究Na+/H+交換器-1(NHE-1)抑制劑時(shí)發(fā)現(xiàn)，NHE-1抑制通過阻止低氧時(shí)PASMCs的Ca2+增加，導(dǎo)致Bcl-2表達(dá)降低及Bax表達(dá)增加從而誘導(dǎo)和促進(jìn)低氧培養(yǎng)下的PASMCs凋亡，表明低氧抑制Bax/Bcl-2值增加的促凋亡作用。本研究結(jié)果顯示，低氧組PASMCs中Bax表達(dá)低于常氧組，與Lu J Y等[24]研究一致，低氧環(huán)境下PASMCs凋亡減少。本研究結(jié)果表明，與低氧組比較，低氧+Tan Ⅱ A組PASMCs中Bax表達(dá)增加，提示Tan Ⅱ A通過改善低氧誘導(dǎo)下Bax/Bcl-2值的降低，部分逆轉(zhuǎn)低氧誘導(dǎo)的PAH中PASMCs凋亡的減少，從而發(fā)揮減少低氧PAH中肺血管重構(gòu)的作用。

自噬與凋亡是維持自身穩(wěn)態(tài)的重要生理過程。自噬失調(diào)參與多種疾病的發(fā)生，近年來自噬在PAH中的作用也被廣泛研究[25-27]，但目前自噬在PAH的確切作用尚不明確。有研究[28]顯示，激活自噬在PASMCs的作用是促增殖的促生存機(jī)制，促進(jìn)肺血管重構(gòu)。同時(shí)，有研究[29-31]發(fā)現(xiàn)，自噬在PAH患者和缺氧誘導(dǎo)的PAH大鼠及小鼠模型的PASMCs表達(dá)增加，自噬標(biāo)記蛋白LC3 Ⅱ / Ⅰ值增加，P62蛋白表達(dá)下調(diào)。本研究結(jié)果顯示，低氧組PASMCs中P62蛋白表達(dá)較常氧組增加，與Li L等[30]研究結(jié)果不一致，可能的原因?yàn)椋?1)P62表達(dá)水平與細(xì)胞密度相關(guān)[32]，因此，細(xì)胞培養(yǎng)初始接種的細(xì)胞密度可能影響P62的表達(dá)差異；(2)氧化損傷可激活紅系衍生的核因子2相關(guān)因子(Nrf2)上調(diào)P62蛋白的表達(dá)保護(hù)血管平滑肌細(xì)胞[33]；(3)可能與PAH中自噬呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化過程有關(guān)[34]；(4)其他實(shí)驗(yàn)條件的不同也可能引起差異(如氧濃度等)。此外，本研究結(jié)果顯示，低氧+TanⅡA組PASMCs中P62蛋白表達(dá)較低氧組降低，表明TanⅡA顯著抑制低氧條件下PASMCs中P62蛋白的表達(dá)。

PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路廣泛存在于細(xì)胞中，參與細(xì)胞生長、增殖、分化等多種生理活動(dòng)。有研究[35]表明，缺氧激活PI3K/Akt信號(hào)通路，活化的PI3K作用于膜上磷脂產(chǎn)生第二信使，然后使絲氨酸/蘇氨酸激酶活化，活化后的Akt從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白，包括Bcl-2家族蛋白、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(Caspase 9)等，并通過這些蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡及遷移等。如依賴PI3K的Akt激活后可使Bax、絲氨酸(Ser)184殘基磷酸化從而導(dǎo)致Bax失活，同時(shí)使Bad的Ser136/Serl12殘基磷酸化，導(dǎo)致Bad與Bcl-2解聚，解聚后的Bad與抗凋亡結(jié)合蛋白14-3-3結(jié)合，而解聚后的Bcl-2則發(fā)揮抗凋亡作用，從而抑制細(xì)胞凋亡[36]。

此外，PI3K/Akt通路參與肺動(dòng)脈高壓中肺血管重構(gòu)及其進(jìn)展。Fan Z等[37]指出PI3K/Akt通路參與肺動(dòng)脈高壓中PASMCs細(xì)胞骨架重排和表型轉(zhuǎn)換，而PASMCs表型轉(zhuǎn)換在肺動(dòng)脈高壓進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用[38]。Chai X等[39]發(fā)現(xiàn)，低氧通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)PAH大鼠肺動(dòng)脈成纖維細(xì)胞增殖、遷移和分化及低氧性肺血管重構(gòu)。Xia X D等[40]應(yīng)用PI3K抑制劑及賴氨酸氧化酶抑制劑，可有效抑制低氧誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈壓力升高及肺血管重構(gòu)。本研究結(jié)果顯示，低氧組PASMCs中P-Akt/Akt值高于常氧組，表明低氧激活PAH中PI3K/Akt信號(hào)通路，與既往研究結(jié)果一致[22,40]。低氧+TanⅡA組PASMCs中P-Akt/Akt值較低氧組降低，提示TanⅡA抑制低氧誘導(dǎo)下PAH中PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，同時(shí)本研究中低氧+TanⅡA組PASMCs中Bax表達(dá)較低氧組增加，結(jié)合前文所述，缺氧激活PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，因此考慮TanⅡA可能通過抑制低氧誘導(dǎo)下PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，使促凋亡蛋白Bax失活減少，從而部分逆轉(zhuǎn)低氧狀態(tài)下PASMCs凋亡減少，改善低氧PAH中肺血管重構(gòu)。

綜上所述，TanⅡA具有保護(hù)低氧PAH的作用，可能與TanⅡA減輕低氧PAH中氧化應(yīng)激水平及抑制低氧PASMCs中PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，部分逆轉(zhuǎn)低氧狀態(tài)下PASMCs凋亡的減少，改善PAH中肺血管重構(gòu)有關(guān)。本研究可為臨床應(yīng)用TanⅡA治療PAH提供參考。