張 和 張新宇 安文林 童貽剛

(北京化工大學生命科學與技術學院 北京 100029)

1 引 言

由于抗菌類藥物的長期使用，細菌進化出多種對抗藥物作用的機制，甚至部分細菌產生多重耐藥現象，這大大降低了抗菌類藥物的藥效，使得細菌感染性疾病的治療變得愈發(fā)困難，同時也增加了治療成本。隨著細菌耐藥性問題的日趨嚴重，噬菌體憑借其生理學特性可考慮作為對抗耐藥病原菌的方法之一。噬菌體是感染細菌、真菌等微生物的病毒總稱，在土壤、水體、空氣及生物體內廣泛存在，因其部分能引起宿主菌的裂解，故稱其為噬菌體。自噬菌體被發(fā)現以來，其憑借基因組較小、繁殖速度快等[1-2]優(yōu)點，成為遺傳調控等方面的生物學基礎研究和基因工程中的重要材料或工具，推動著生物學眾多領域的發(fā)展。合成生物學是一門新興學科，它通過對現有生命體進行人工改造，使其產生預定的功能，甚至能夠創(chuàng)造出全新的生命體[3]。

但由于噬菌體與細菌相互作用產生共同進化，針對噬菌體的感染進化出多種抗感染機制，即產生抗噬菌體致病菌，進而限制了噬菌體療法的應用；同時，噬菌體對宿主菌識別和裂解的特異性限制了其作為抗菌藥物的應用，因此尋找或改造得到廣譜裂解性噬菌體十分有必要。其中，可以利用人工改造噬菌體獲得特定裂解譜的人工噬菌體。利用逐漸興起的合成生物學方法和技術改造現有噬菌體，或合成全新的噬菌體，可以對現有噬菌體優(yōu)勢特性進行加強，同時對其不足之處進行彌補，從而解決目前噬菌體應用過程中存在的一些難題[4-5]，進一步推動噬菌體工程化及應用化的進程。

2 合成生物學用于噬菌體改造的方法

2.1 基因組編輯

基因編輯是一種能夠較為精準地對不同生物體內基因組特定位置進行改造和修飾的新興基因工程技術。隨著該技術的不斷發(fā)展，鋅指核酸酶(Zinc-Finger Nucleases，ZFN)[6]、類轉錄激活因子效應物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nuclease，TALEN)[7]、成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)[8]、單堿基編輯(Base Editor，BE)[9]和先導編輯(PE)[10]等技術相繼被發(fā)現，不僅為基因功能研究提供了有力的工具，而且還為醫(yī)學領域提供了新的治療思路。尤其是近年來逐漸興起的 CRISPR 技術，其由于具有操作簡單方便、打靶精確等眾多優(yōu)點，被廣泛應用于生物學領域。

CRISPR-Cas 系統(tǒng)是由負責識別靶序列的 CRISPR 元件和切割靶序列的 Cas(CRISPRAssociated Proteins)蛋白組成。CRISPR 序列經轉錄和加工變?yōu)槌墒斓?crRNA，接著其主動靶向目的片段，與目的片段結合后，Cas 蛋白便行使切割功能，切斷目的 DNA 雙鏈，使基因產生特定的雙鏈缺口(Double-Strand Breaks，DSBs)。此時，生物體內在應激狀態(tài)下會開啟兩種主要修復機制，即同源重組(Homology-Directed Repair，HDR)[11]和非同源末端連接(non-Homologous End Joining，NHEJ)[12]，可利用修復過程中插入片段或定點突變實現基因編輯。

噬菌體中存在大量未知功能的基因，使得相應的基礎研究與合成新噬菌體存在很多難題，而使用上述技術則可以在一定程度上解決這些問題。目前在噬菌體基因組編輯方面也取得了一些成果。例如：2017 年，Tao 等[13]將含有 CRISPR序列和 Cas 蛋白對應的基因序列的重組質粒導入大腸桿菌中，達到了對 T4 噬菌體基因組進行編輯的目的；2019 年，Hoshiga 等[14]利用 CRISPR基因編輯技術對 T2 噬菌體尾部負責吸附宿主菌的受體結構進行改造，成功修飾后使 T2 噬菌體對大腸桿菌 O157:H7 的侵染能力得到很大提升，這有利于治療由該種大腸桿菌感染導致的疾病。

2.2 人工合成

由于野生型噬菌體存在未知基因、易使細菌耐受、宿主范圍變窄等問題，所以其大規(guī)模應用受限。而采用近年來逐漸興起的合成生物學方法理性設計并合成人工噬菌體，可以在一定程度上解決該問題[4-5,15]。

設計、組裝、拯救和檢測是人工合成噬菌體的 4 個主要步驟，如圖 1 所示。(a)設計：在正式合成之前，需對擬合成的噬菌體基因組進行理性設計，而由于 DNA 化學合成技術的限制，整個基因組序列需要分為 100 nt 左右的寡核苷酸序列。(b)組裝：寡核苷酸序列合成后，在聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)儀中拼接成長度為 1 000 bp 左右的 DNA 雙鏈，再進一步利用酵母重組平臺技術將其拼接為全基因組。(c)拯救：利用合適的方法將全基因組導入細菌中，使其在細菌體內包裝成有活性的成熟噬菌體顆粒，并釋放到體外。(d)檢測：測定新噬菌體的生長規(guī)律和裂解效率并對其進行評價。

圖1 人工合成噬菌體的基本流程Fig. 1 Graphical illustration of the basic process of synthesizing artificial phages

利用 PCR 擴增組裝 0.1～20 kb 的噬菌體基因組成功率較高。2003 年，Smith 等[16]成功合成了大腸桿菌 X174 噬菌體，其基因組全長為5 386 bp。他們先合成 42 nt 左右的寡核苷酸序列，進一步利用 PCR 技術拼接得到全基因組，隨后利用電轉的方法將全基因組導入對應的大腸桿菌中，使其在體內包裝成有活性的成熟噬菌體顆粒，并釋放到體外。當噬菌體基因組大于20 kb 時，在體外操作難度大，成功率較低[17]，而研究發(fā)現酵母可以攝取外源 DNA 片段且自身重組能力較強，故其可作為 DNA 大片段的拼接平臺[18]。2015 年，Ando 等[19]利用合成生物學思想，將 T7 噬菌體中負責尾部識別的基因模塊用 K11 噬菌體相應模塊進行替換，使其能夠感染克雷伯菌。2017 年，Oldfield 等[20]通過分片段合成、多片段同時優(yōu)化改造的方法從頭合成了單純性皰疹病毒。

3 合成生物學工程化噬菌體的應用

3.1 解決細菌藥物耐受性問題

3.1.1 細菌耐藥性機制

細菌耐藥性是指細菌對抗菌類藥物的耐受作用。細菌一旦產生耐藥性，藥物的作用效果就會大幅下降。根據發(fā)生原因的不同，可將細菌耐藥分為特異性耐藥和非特異性耐藥[21]。細菌特異性耐藥的主要機制有：細菌自身產生滅活抗生素的酶，藥物作用靶點發(fā)生改變。細菌非特異性耐藥主要機制有：細菌形成生物被膜對自身進行保護，細菌外排泵對藥物的主動外排作用[22]。

(1)細菌特異性耐藥機制

在細菌體內由某些質?；蛉旧w表達產生的滅活酶使抗菌類藥物失活是耐藥性產生的重要原因。例如：表達產生的 β-內酰胺酶通過破壞 β-內酰胺環(huán)的立體結構使其失活[23]；細菌體內的氨基苷類抗生素鈍化酶可在氨基苷類抗生素的氨基或羥基上接上乙?；⑾佘挣；蛄柞；然鶊F，使它們原有結構發(fā)生改變從而失去作用[24]；細菌產生的氯霉素乙酰轉移酶可使氯霉素結構改變而失活等[25]。

抗生素需要與細菌體內的特定位點結合才能發(fā)揮作用，因此這些抗生素結合位點對抗生素治療而言至關重要。而研究發(fā)現，細菌通過改變與抗生素結合的靶蛋白結構，使抗生素的結合能力減弱甚至不能結合，從而使得療效顯著下降。例如，由于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin ResistantStaphylococcus Aureus，MRSA)青霉素結合蛋白組成比敏感菌株多一個青霉素結合蛋白2a(PBP2a)[26]，使其對青霉素產生嚴重抗性。

(2)細菌非特異性耐藥機制

細菌生物被膜是指細菌自身分泌多糖、纖維蛋白、脂蛋白等物質，將其包裹起來形成的菌團膜狀物[27]。由于生物被膜中存在大量多糖物質，它們帶有的一定數量的電荷會形成天然屏障，使抗生素難以進入細菌體內發(fā)揮作用，同時被膜中還有一些水解酶類會使抗生素失活，從而對抗生素產生抗性。再加上營養(yǎng)物質、氧氣等在生物被膜深處的濃度較低，使細菌處于一種對抗生素不敏感的狀態(tài)，也會使得抗生素作用減弱[28]。

在細菌細胞膜表面存在一類具有特定結構的主動轉運蛋白，即細菌外排泵。該系統(tǒng)主要由通道蛋白、輔助蛋白和轉運子三部分組成，可將抗生素等物質從細胞內部排出[29]。最開始是在根瘤菌中發(fā)現了外排泵，后續(xù)的研究證明根瘤菌用它來轉運營養(yǎng)物質和礦物質，而隨著抗生素的廣泛應用，研究人員在多種細菌中發(fā)現外排泵，進一步研究發(fā)現正是外排泵的外排作用使得細菌產生多重耐藥性[30]。

3.1.2 解決方法

(1)藥物外排泵角度

外排泵對多種抗生素的外排作用是細菌產生多重耐藥的主要原因之一[31]。存在于細胞膜表面的外排泵，能夠利用腺嘌呤核苷三磷酸(5'-Adenylate Triphosphate，ATP)水解釋放的能量或質子跨膜移動產生的能量將胞內的多種抗生素排出，使菌體內藥物濃度降低，從而達不到預期的治療效果[32]。

Chan 等[33]研究報道，銅綠假單胞菌噬菌體 OMKO1 可以利用藥物外排系統(tǒng) MexAB 和MexXY 的外膜孔蛋白 M(OprM)作為受體結合位點，以此來侵入并裂解宿主菌。長此以往，銅綠假單胞菌便通過改變細胞膜表面噬菌體結合位點的結構來避免被噬菌體感染，這樣就會進化出對噬菌體 OMKO1 的耐受性。一旦外排泵系統(tǒng)中孔蛋白的結構發(fā)生改變，它對藥物的外排功能就會喪失，對抗生素類藥物的敏感性隨之增強。因此，可以再次通過抗生素來治療銅綠假單胞菌造成的感染。該研究結果表明，噬菌體 OMKO1 可以迫使銅綠假單胞菌在噬菌體耐受性和抗生素敏感性之間達到理想的遺傳平衡，這有利于噬菌體療法對抗多重耐藥菌。利用噬菌體驅動多重耐藥菌進化增強噬菌體的耐受性，使其對抗生素的敏感性增強。因此，這種噬菌體療法效果更加顯著：當噬菌體裂解宿主菌時便達到了殺菌效果；亦或是細菌進化出噬菌體耐受性，由于它們對抗生素的敏感性增強，也能達到殺菌效果。

噬菌體選擇在銅綠假單胞菌中產生了一種進化平衡，細菌對噬菌體感染的耐受性進化改變了外排泵機制，導致其對幾種抗生素類藥物的敏感性增強。盡管現代噬菌體治療仍處于起步階段，但我們認為，類 OMKO1 噬菌體是一種噬菌體治療的新方法，噬菌體對多重耐藥菌發(fā)揮選擇作用，使其對傳統(tǒng)抗生素越來越敏感。這種使用噬菌體來改造細菌外排泵的方法可以延長現有抗生素的使用壽命，并有可能減少抗生素耐藥性的產生。

(2)生物被膜角度

細菌生物被膜可提高細菌對外界理化環(huán)境的抵抗力，使細菌不易被抗生素或常規(guī)消毒劑殺死，給細菌感染疾病的治療帶來極大困難。近年來，隨著對噬菌體研究的深入，人們發(fā)現噬菌體可以有效抑制細菌生物被膜的形成以及破壞已形成的細菌生物被膜。具體地，可以通過 4 種方法破壞細菌生物被膜，從而改善細菌耐藥性。

①噬菌體編碼的胞外多糖解聚酶降解生物被膜中的多糖成分。現已分離的某些噬菌體能夠表達胞外多糖解聚酶，該酶可以降解構成生物被膜基質的胞外多糖成分，從而破壞生物被膜之間的連接，降解生物被膜。Olsen 等[34]研究了細胞內溶素 LysK 和聚-N-乙酰葡糖胺解聚酶 DA7 在靜態(tài)和動態(tài)模型中對葡萄球菌生物被膜的功效。結果發(fā)現，LysK 顯示出對多種金黃色葡萄球菌菌株的活性，并且低微摩爾濃度和納摩爾濃度的LysK 和 DA7 便可從聚苯乙烯和玻璃表面除去靜態(tài)及動態(tài)生物被膜。兩者組合使用時，酶起協(xié)同作用，可明顯降低活細胞計數?？傮w而言，該結果表明無論是單獨使用還是組合使用，LysK 和DA7 都是有效的抗生物被膜劑。商安琪[35]觀察到克雷伯氏菌 K13 能夠產生豐厚的莢膜多糖，因此其專一性侵染噬菌體 P13 需產生一種多糖解聚酶先將宿主菌胞外的多糖降解，而后同菌體細胞接觸，開始裂解過程。后續(xù)的研究發(fā)現，噬菌體P13 可在特定位點將胞外多糖水解，得到大量具有特定結構的寡糖片段，將寡糖分離純化后解析其結構，從而得到 K13 胞外多糖的結構，為進一步研究胞外多糖的降解奠定了基礎。

②噬菌體裂解酶破壞細胞生物被膜。噬菌體裂解酶通過與細菌被膜表面的受體結合，進而侵染細菌并使其裂解死亡，從而減少生物被膜的產生。宋軍等[36]發(fā)現 MRSA 能夠形成生物被膜，且其相關感染很難根除。而噬菌體裂解酶LysGH15 對 MRSA 生物被膜有一定的破壞作用。通過 24 孔板法培養(yǎng) MRSA 生物被膜，將裂解酶LysGH15 作用于生物被膜，并用結晶紫染色法測定 LysGH15 對生物被膜細菌的作用效果。結果表明，檢測的 22 株 MRSA 中，有 16 株能夠形成生物被膜，LysGH15 能夠有效清除和抑制 MRSA 生物被膜。其中，10 μg/mL LysGH15 可以在 1 h 內有效清除生物被膜。因此，LysGH15 具有作為新型抗菌劑應用于清除 MRSA 生物被膜和治療相關感染的潛力。Lu 和 Collins[37]通過基因工程的手段使大腸桿菌噬菌體 T7 在感染菌體的同時表達裂解酶 DspB，發(fā)現其對生物被膜中細菌數量的清除率可達 99.997%，與未表達 DspB 的噬菌體相比，清除率有了明顯提高。

③噬菌體自身裂解生物被膜內部的細菌。近年來，隨著生物成像技術的發(fā)展，揭示了生物被膜形成的微菌落之間存在著輸水通道，具有運輸養(yǎng)料和排泄廢物的功能。而噬菌體正好可以利用生物被膜間存在的輸水通道進入內部，進而裂解生物被膜內部的細菌。Briandet 等[38]在實驗中通過使乳酸菌噬菌體 C2 帶上熒光標記，觀察到 C2可以通過輸水通道進入生物被膜內部，裂解乳酸菌，并使得生物被膜面積減小。

④噬菌體和抗生素聯(lián)合使用殺滅生物被膜內部的細菌。單獨使用噬菌體和抗生素對細菌都有一定的殺滅作用，二者聯(lián)合使用則具有協(xié)同作用，可以達到更好的效果，能有效緩解細菌耐藥和噬菌體耐受的問題。Gordillo Altamirano 等[39]研究發(fā)現，鮑曼不動桿菌產生的一種黏稠的外層可以保護它并阻止抗生素的進入，從而產生耐藥性。研究者們發(fā)現，將鮑曼不動桿菌菌株 AB900和 A9844 分別與其各自的噬菌體 ΦFG02 和ΦCO01 共培養(yǎng)，能夠觀察到噬菌體耐受型的菌株出現。掃描電子顯微鏡分析表明，野生型的菌株表面有生物被膜的存在，而在突變型菌株表面沒有發(fā)現。同時，比較突變型菌株和野生型菌株的基因組發(fā)現，突變型菌株基因組的 K 位點發(fā)生單核苷酸缺失，而鮑曼不動桿菌 K 位點的基因正是調控莢膜多糖的產生、修飾和輸出。因此這些對噬菌體產生耐受的鮑曼不動桿菌菌株是不能正常生產莢膜多糖的。進一步的研究證明，噬菌體ΦFG02 和 ΦCO01 的受體正是鮑曼不動桿菌的莢膜多糖，通過改變或丟失這些受體而產生噬菌體抗性，從而抑制噬菌體吸附，避免裂解死亡。為了抵抗噬菌體，鮑曼不動桿菌不再產生生物被膜，因此可以使用抗生素進行殺菌。Lu 和Collins[40]研究發(fā)現，利用工程噬菌體靶向抑制大腸桿菌中的 SOS 基因網絡，可以在體外提高喹諾酮類藥物的殺傷能力，并顯著提高感染小鼠的存活率。此外，研究還證明工程噬菌體可以增強對耐藥細菌、生物被膜細胞的殺傷能力，減少抗生素治療后產生的耐藥細菌數量，并可作為其他抗生素(如氨基糖苷類和 β-內酰胺類)的強佐劑。同時研究還發(fā)現工程噬菌體靶向非 SOS 基因網絡，同時過表達多個因子，也可以產生有效的抗生素佐劑。

綜上所述，在利用噬菌體改造細菌藥物外排泵方面，可通過改變噬菌體的尾絲蛋白使其以細菌外排泵系統(tǒng)相關蛋白作為受體結合位點，將其與抗生素聯(lián)用以達到殺菌效果。對于尾絲蛋白的改造有兩種思路：一是特異性設計并構建噬菌體基因模塊，對已知功能的噬菌體基因模塊進行替換，改變其與細菌的結合位點；二是隨機突變現有的尾絲蛋白，構建數量巨大的噬菌體突變庫，然后進行篩選。開發(fā)更加有效的方法來改變噬菌體受體結合位點，對后續(xù)噬菌體治療的臨床應用具有重要作用。在利用噬菌體清除生物被膜方面，未來可以使用能夠產生多糖解聚酶或裂解酶的噬菌體來清除細菌生物被膜，并且殺滅細菌。利用合成生物學的方法構建噬菌體基因模塊，用多糖解聚酶或裂解酶基因替換已知功能的噬菌體基因模塊，使其表達出特定的酶；對于自身可以表達這兩種酶的噬菌體，可以考慮構建基因調控開關，對多糖解聚酶和裂解酶基因的轉錄及表達進行嚴格控制，合成及優(yōu)化代謝網絡，產生更多的多糖解聚酶及裂解酶。

3.2 解決噬菌體感染耐受性問題

3.2.1 細菌的噬菌體感染耐受性機制

噬菌體侵染細菌的過程包括吸附、注入、合成、組裝和釋放 5 個步驟。細菌在與噬菌體長期的共同進化過程中，針對抑制吸附、阻止注入、干擾 DNA、流產感染等過程[41]的感染產生了多種機制的耐受性。

(1)阻止噬菌體吸附

噬菌體通過識別結合受體吸附到細菌上，受體主要包括細菌表面的結構蛋白、脂多糖[42]等，其中受體蛋白有外膜蛋白受體 FhuA、細胞膜蛋白 YueB[43]等。通過使受體蛋白無法表達、改變受體結構、產生競爭性抑制，使噬菌體無法識別細菌表面從而抑制侵入。

細菌容易對以多糖為受體的噬菌體產生耐受，這是由于多糖結構具有多樣性且其與多糖合成相關的酶有較多種類。Latino 等[44]分離出銅綠假單胞的抗噬菌體突變株 PAO1，并發(fā)現該突變株是在脂多糖(LPS)合成過程中的基因上發(fā)生突變。Tan 等[45]發(fā)現細菌 Kp36 能夠利用可移動遺傳元件破壞磷酸轉移酶wcaJ的編碼區(qū)來阻止噬菌體感染；BvgAS 雙組分調節(jié)系統(tǒng)影響噬菌體吸附效率，噬菌體 BPP-1 的受體 Prn 只在 Bvg＋期表達，因此 Bvg＋細胞感染噬菌體 BPP-1 的效率比 Bvg－細胞高 100 萬倍[46]。T5 噬菌體感染大腸桿菌可以產生一種脂蛋白(Llp)，從而阻止該噬菌體與大腸桿菌上的識別受體鐵氧體外膜轉運體(FhuA)相互作用[47]。宿主細胞的脂蛋白也可以干擾吸入，如 F＋菌株編碼的外膜蛋白 TraT 可以改變多數 T 噬菌體受體外膜蛋白 A (OmpA)的構象[48]。

此外，細菌和噬菌體間可以形成物理屏障以阻止吸附。褐藻酸鹽是由假單胞菌、固氮菌產生的胞外多糖[49]，有研究發(fā)現降低胞外多糖有利于噬菌體滲透進入細胞，這說明產生褐藻酸鹽的固氮菌的噬菌體抗性增強[50]。流感嗜血桿菌利用相變(PV)來調節(jié)其針對噬菌體感染的防御系統(tǒng)的活性[51]。

通過產生其他能與宿主受體特異性結合的產物，與噬菌體形成競爭抑制作用，也可以降低噬菌體感染效率從而阻止噬菌體的吸附。例如，T5噬菌體在其受體蛋白 pb5 與外膜轉運蛋白 FhuA結合后感染大腸桿菌[52]，抗菌肽 Microcin J25 在營養(yǎng)耗盡的情況下也使用 FhuA 作為受體阻礙噬菌體與該位點結合[53]。

(2)阻止噬菌體注入

溫和噬菌體侵染細胞是通過將其 DNA 整合到宿主基因組上，并且在不裂解宿主的前提下隨宿主 DNA 進行復制，其中整合的前噬菌體片段能夠編碼一些錨定蛋白，并在該噬菌體下次侵入時產生一定的免疫能力，該機制稱為超免疫(Sie)。革蘭氏陽性菌乳球菌中 Sie2009系統(tǒng)存在于 P335 乳球菌噬菌體組中的幾個前噬菌體中，通過抑制噬菌體 DNA 轉移到宿主細胞而產生對乳球菌噬菌體抗性[54]。革蘭氏陰性菌中，T4 噬菌體有兩套 Sie 系統(tǒng)——分別由Imm和Sp編碼，該系統(tǒng)通過阻止其 DNA 進入來抑制噬菌體感染[55]。其中，免疫蛋白 Imm 通過改變吸附位點構象阻止噬菌體 DNA 轉移到細菌細胞質，膜蛋白 Sp 抑制 T4 溶菌酶活性阻止噬菌體 DNA 的注入[56]。溫和噬菌體 HK97 中 Sie 系統(tǒng)通過將gp15 蛋白插入大腸桿菌的內膜，其與噬菌體尾部蛋白相互作用，阻止裂解性噬菌體 HK97 和HK95 的 DNA 注入[57]。

(3)干擾噬菌體 DNA

(4)流產噬菌體感染

流產感染是在噬菌體繁殖之前殺死被噬菌體感染的細胞，從而保全其他細胞不被感染，是一種利他行為。該系統(tǒng)存在于噬菌體的全生命周期，可以殺死噬菌體從而降低感染風險，且與流產過程相關的基因通常存在于前噬菌體的序列中[59]。Abi 系統(tǒng)包括 AbiA-Z，分別可以干擾噬菌體基因組復制、RNA 轉錄、噬菌體外殼蛋白表達和噬菌體蛋白外殼組裝等[60]，如AbiZ基因可以通過破壞被感染細胞的細胞膜來誘導細胞死亡，保護乳酸乳球菌免受噬菌體 phi 31的感染[61]。最具特征的 Abi 系統(tǒng)為 Rex 系統(tǒng)，由 lambda 噬菌體表達，包含兩個基因rexA和rexB[62]，該系統(tǒng)可以抑制 T4、T5、T7 噬菌體噬菌斑的形成[63]。較為常見的一種 Abi 系統(tǒng)是由毒素-抗毒素(Toxin-Antitoxin，TA)系統(tǒng)介導的[64]，此系統(tǒng)由兩個共表達基因組成，分別編碼毒素和抗毒素，二者通過拮抗作用對細菌生長狀態(tài)進行調節(jié)。另外，大腸桿菌中還有兩個 Abi 系統(tǒng)，分別是Lit編碼細胞死亡肽酶[65]和反密碼子核酸酶(PrrC)[66]通過抑制翻譯機制終止噬菌體感染。

3.2.2 應對噬菌體感染耐受性策略

以噬菌體作為抗菌素的噬菌體療法正在興起，可以從側面解決細菌耐藥性的問題，但在噬菌體與細菌的軍備競賽中，細菌發(fā)展出一系列抵御噬菌體感染的防御策略，同時噬菌體也進化出不同的機制對抗細菌的先天免疫或適應性免疫。本節(jié)主要介紹噬菌體產生的抗耐受性機制并分析利用合成生物學解決噬菌體耐受性的可能方案。

(1)針對受體

通過改造存在于噬菌體尾部的受體結合蛋白來改變噬菌體與細菌結合能力、宿主范圍、感染效率等。Zeng 和 Salmond[67]對噬菌體受體蛋白 EcLamB 進行研究并將編碼該蛋白的質粒pMUT13 轉導到不同腸桿菌屬中，結果發(fā)現可以擴大該類噬菌體的宿主范圍。Dunne 等[68]解析了李斯特菌(Listeria)噬菌體 PSA 受體結合蛋白(Retinol Binding Proteins，RBPs)的晶體結構，結合合成生物學和結構導向的方法改變受體蛋白特異性。由于 RBPs 是決定噬菌體宿主范圍的關鍵性因素，因此通過改造 PSA，能夠將毒性較弱且宿主范圍較小的噬菌體改造成毒性較強且宿主范圍明確、特異性強的噬菌體。該研究通過確定噬菌體 PSA 的 RBPs 為 gp15，誘變獲得隨機序列的 RBPs 構建合成 RBPs 庫，篩選宿主范圍改變的噬菌體突變體，將上述特征整合成一個廣譜性合成噬菌體。此外，該研究利用 PSA 衍生物(PSA DLCR ply511)[69]發(fā)現 3 種途徑可以拓寬噬菌體宿主范圍的方法。第一種是基于 RBPs 定向突變，通過易錯 PCR(epPCR)靶向誘導，構建合成 RBPs 基因文庫，發(fā)現了 6 個單點突變的噬菌體菌株(S302R、I306K、I306R、A332V、S334R 和S354T)可以擴大宿主范圍。第二種是合并兩種不同 RBPs 的嵌合 PSA 具有擴大宿主范圍的特點，獲得一種通過參與多個 RBPs 識別多個受體表位的噬菌體；通過構建合成噬菌體，使其能夠同時編碼野生型和突變型 gp15，表達蛋白嵌合物。第三種是以結構和序列引導設計嵌合 RBPs 獲得 PSA 衍生物，生成 5 個具有嵌合 RBP 的合成噬菌體，將宿主范圍從 SV 4b 擴展到 SV 4a、SV 4b、SV 4d。

構建尾絲蛋白突變庫。例如，Citorik 等[70]在對 T7 噬菌體拓寬宿主范圍的早期研究中利用雜交方式，通過交換兩種噬菌體之間的 C 端結構域來交換宿主范圍，其中不同的尾絲蛋白使噬菌體能夠識別不同的宿主，組裝出具有不同噬菌體尾部的雜交 T7 噬菌體衣殼[19]；Yosef 等[71]設計質粒編碼 15 種不同噬菌體的尾部基因，通過構建 T7 噬菌體雜交顆粒，實現 T7 噬菌體 DNA 可以導入多種宿主細胞中。但上述研究無法應對細菌耐噬菌體范圍的快速變化，因此 Yehl 等[72]通過構建 107容量的噬菌體尾絲蛋白結構突變庫，對噬菌體尾絲蛋白誘變改造噬菌體宿主范圍并抑制細菌耐藥性，如圖 2 所示。該研究主要改造 T3 噬菌體，對其尾絲蛋白中決定宿主范圍的區(qū)域 HRDRs 進行基因工程改造，類似抗體特異性工程，通過定點突變、高通量測序技術，用NNK 密碼子替換編碼氨基酸環(huán)路的密碼子，在對尾部的蛋白質結構影響最小的情況下對特定的表位結合區(qū)域產生大量突變體，篩選宿主范圍改變的合成噬菌體，緩解細菌的噬菌體感染耐受。結果顯示，改造后的噬菌體不僅能殺死特定的不同大腸桿菌菌株，還能殺死已對噬菌體產生抗性的細菌[72]。

改造受體使其特異性識別胞外聚合物。一些噬菌體還進化出能特異性識別甚至降解細胞外聚合物的機制，從而阻止細菌對噬菌體產生耐受性。多糖降解酶可分為水解酶和裂解酶兩類。其中，水解酶可以切斷糖苷鍵上的糖基-氧鍵，裂解酶可以切斷單糖和糖醛酸 C4 之間的鍵并在糖醛酸 C4 和 C5 之間引入一個雙鍵。例如，化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)噬菌體 H4489A編碼的透明質酸裂解酶可以特異性切割乙酰透明質酸，從而使噬菌體進入宿主細胞[73]；通過在噬菌體中引入具有多糖降解酶功能的基因特異性降解胞外聚合物，使噬菌體進入宿主細胞。

(2)針對限制修飾系統(tǒng)

為應對限制修飾(R-M)系統(tǒng)，噬菌體進化出幾種逃逸策略克服細菌 R-M 系統(tǒng)對噬菌體 DNA的干擾，分別是通過點突變使噬菌體缺失內切酶識別位點[74]、宿主或自身對基因進行甲基化、獲得同源甲基化酶基因、模仿噬菌體 DNA 刺激修飾酶等方式，產生降解 R-M 輔助因子、抑制修飾酶等作用，從而保護噬菌體 DNA 等。對于甲基化作用，如 T7 噬菌體的 Ocr 蛋白模仿噬菌體 DNA 并阻礙甲基化酶和限制性核酸內切酶結合，從而抑制其活性[75]。對于抑制修飾酶作用，ArdC 是一種 I-R-M 型系統(tǒng)特異性的抗限制蛋白，IncB 質粒 R16 的 ArdA 可以選擇性地抑制EcoKI 的修飾酶活性，在接合過程中保護進入的T 鏈[76]。對于點突變，在芽孢桿菌中，用基因組中的胸腺嘧啶取代尿嘧啶或羥甲基尿嘧啶可防止噬菌體識別和裂解含有胸腺嘧啶的位點[77]。因此，根據上述合理推測，通過對限制性核酸內切酶識別位點進行人工突變可以使噬菌體抵御部分細菌的耐受性。

(3)針對 CRISPR 系統(tǒng)

早前，研究者認為噬菌體逃脫 CRISPR-Cas系統(tǒng)介導的唯一機制是通過誘導隨機點突變，對原間隔區(qū)或 PAM 序列突變，使 crRNA 和靶 DNA無法配對從而致使侵入噬菌體的 CRISPR-Cas系統(tǒng)失活。但是單靠突變無法使噬菌體長期存活。噬菌體也可以通過修飾堿基來逃避 CRISPRCas 系統(tǒng)靶向，如羥甲基胞嘧啶(Hydroxymethyl Cytosine HMC)及其糖基化形式可以保護 T4 噬菌體免受 CRISPR 系統(tǒng)的免疫[78]。直到 2013 年，在銅綠假單胞菌噬菌體中首次發(fā)現了 5 個編碼不同Anti-CRISPR 蛋白的基因可以干擾宿主 CRISPRCas 系統(tǒng)[79]。因此，向某細菌 CRISPR-Cas 系統(tǒng)靶向的噬菌體基因組中添加 Anti-CRISPR 可以使該噬菌體避免適應性免疫反應；噬菌體自身可以編碼蛋白抑制劑以抵御 CRISPR-Cas 系統(tǒng)，如霍亂弧菌(Vibrio cholerae)血清群 O1 中 ICP1 噬菌體編碼的 CRISPR-Cas 系統(tǒng)可用來對抗宿主中的抑制噬菌體感染的染色體島，在沒有這種靶向的情況下，噬菌體編碼的 CRISPR-Cas 系統(tǒng)可以獲得新的間隔區(qū)，確保有效靶向染色體島，恢復噬菌體復制[80]。因此，定向插入 Anti-CRISPR 能夠使噬菌體逃脫細菌適應性免疫反應所造成的噬菌體耐受性。

(4)針對 Abi 系統(tǒng)

噬菌體可以改變與編碼 Abi 系統(tǒng)相關的基因來阻止該系統(tǒng)的激活，通過對特定基因定點突變或產生編碼抗毒素的分子抵消毒素活性，從而逃避 Abi 系統(tǒng)。Abi 系統(tǒng)可分為 AbiD1、AbiK、AbiV、AbiT 和 AbiQ 等。其中，乳球菌噬菌體中不同基因的突變可以規(guī)避 Abi 系統(tǒng)。有研究表明逃避 AbiK 系統(tǒng)可以利用 P2 ORF35-Sak3 誘導編碼Sak基因的隨機突變來進行[81]；在大腸桿菌噬菌體 T4rII 中，突變motA可以使噬菌體避免Rex 介導的排斥[82]；突變 T4 噬菌體編碼肽 Gol的基因阻止 Abi 系統(tǒng)的激活[65]。編碼抗毒素分子的例子有：大腸桿菌 O157:H7 中攜帶兩個開放閱讀框(ORF)分別是lsoA(ORF1) 編碼毒素、lsoB(ORF2) 編碼抗毒素，其與大腸桿菌 K-12編碼毒素-抗毒素系統(tǒng)的 RnlA 和 RnlB 具有同源性。研究發(fā)現，T4 噬菌體中的 Dmd 通過直接相互作用抑制 RnlA 和 LsoA 的毒性，從而阻止 Abi系統(tǒng)的激活[83]。根據上述研究合理推測，可以通過對編碼 Abi 系統(tǒng)的基因以及編碼 TA 系統(tǒng)的基因進行定點突變，從而使噬菌體逃逸。

綜上所述，可以利用合成生物學手段，定向突變獲得受體蛋白模塊獲取 RBP 基因文庫、對尾部結構組件進行模塊交換、構建尾部組件突變庫、利用基因工程設計結構模塊、構建 Anti-CRISPR 系統(tǒng)、定向改造功能基因模塊，對現有或不存在的生物組件及系統(tǒng)進行重新設計改造，從而對隨機突變等常規(guī)技術無法解決的問題進行補充完善。此外，需要特別注意的是，針對細菌受體的改造可以選擇保守細菌外膜蛋白作為受體，這樣的受體較難發(fā)生突變，因此不容易形成耐受。

4 噬菌體的合成生物學與生物安全

合成生物學主要面臨生物恐怖襲擊、公眾健康、實驗安全等幾個方面的問題與挑戰(zhàn)[84]。公眾對合成基因組的擔憂主要來源于產生高致病性、強傳染性的病毒會對健康帶來威脅。

因為噬菌體僅特異性感染細菌，所以合成噬菌體無需考慮倫理安全以及其他合成基因組學帶來的風險，通過噬菌體的簡單模型能夠幫助人類更好地理解合成生物學的機制，并且噬菌體在生態(tài)環(huán)境、病原體疾病鑒定治療等方面具有廣闊的發(fā)展前景。但是，噬菌體利用其生物學特性可以包裝細菌、導入毒性基因和耐藥基因等，增強細菌的致命性和耐藥性[85]，而且其對生態(tài)環(huán)境也有較大影響，如果合成噬菌體意外泄漏，感染其宿主細菌，則有可能會打破整個菌落的生態(tài)平衡[86]。因此，噬菌體可能會成為潛在的生物恐怖劑。噬菌體攜帶未知功能蛋白或毒性蛋白，其中溶源性噬菌體利用其生物學特性可以作為生物武器，將致命的毒性基因整合到宿主細胞的染色體上，使不致命性細菌產生致命性。例如，2011 年 5 月，強毒性的大腸桿菌O104:H4 在德國引起溶血性尿毒癥和腹瀉的暴發(fā)，至今已有 810 例該綜合征和 39 例死亡，經過調查發(fā)現該致病性細菌是通過獲得含有志賀毒素的溶原性噬菌體而產生致病性[87]；由于以霍亂弧菌(Vibrio cholerae)為宿主的溶原性噬菌體 CTXΦ 含有毒性基因ctxABT，導致霍亂弧菌產生致病性，可引起食物中毒[88]。在生物恐怖襲擊中，若將此類噬菌體分散在適當的環(huán)境下，其產生的高致病性細菌能被很好地隱藏起來，難以預防、檢測、控制以及溯源。因此，需要對合成噬菌體制定嚴格的法律法規(guī)，從而規(guī)避由合成噬菌體引發(fā)的生物安全問題。

5 總結和展望

本文主要討論針對噬菌體的合成技術、合成應用及生物安全，并根據合成生物學的相關研究重點論述合成噬菌體在應對細菌耐受性的機制及策略，并分析其運用與解決細菌耐受性的可行性。結合現有研究可考慮利用合成生物學方法開發(fā)噬菌體基因模塊、構建基因調控開關、對編碼噬菌體尾絲蛋白及細菌受體蛋白相關元件進行改造，從而快速應對細菌進化產生的適應性免疫，為抗生素治療及噬菌體治療提供新思路。

近年來，由于抗生素藥物的濫用，耐藥菌大量出現，這不僅使細菌感染性疾病治療效果下降，還會增加新藥研發(fā)的成本和時間。噬菌體既能殺死對抗生素敏感的細菌，也能殺死對抗生素有耐藥性的細菌，因此，可引入噬菌體來解決耐藥性的問題。但隨之而來也面臨著一些潛在的問題及挑戰(zhàn)：第一，大多數噬菌體基因組大小受衣殼容量的影響，限制了基因組片段的替換和修飾[89]；第二，噬菌體基因組或組織結構發(fā)生任何變化都可能對噬菌體的感染性或生長能力產生負面影響；第三，自然環(huán)境中尚未發(fā)現一種噬菌體具有理想治療劑所具備的所有特性。最重要的是，細菌進化產生對噬菌體的耐受性會導致噬菌體感染失效。而合成生物學的快速發(fā)展給這些難題帶來了新的解決方法，可以對已知性質的噬菌體進行靶向基因修飾，從而快速獲得符合要求的噬菌體，通過基因工程擴大噬菌體宿主范圍主要是針對編碼 RBP 的基因進行改造。Dedrick 等[90]利用基因工程和正向遺傳學的方法開發(fā)了噬菌體衍生物，有效地殺死感染的M. abscessus菌株，從而治愈一位 15 歲患者。還可以通過改變宿主細菌胞外聚合物或受體相互作用來影響噬菌體 DNA 注入宿主細胞的能力。此外，利用噬菌體 Anti-restriction 和 Anti-CRISPR機制可以解決細菌耐噬菌體的問題。未來，可利用合成生物學的方法和技術改造噬菌體，再將改造后的噬菌體和抗菌類藥物聯(lián)合使用，使細菌恢復對抗生素的敏感性，達到更好的治療效果。工程噬菌體不僅可以用于解決細菌耐受性問題，還可以用于原位修飾人類微生物群，以減輕某些細菌疾病和代謝、免疫或精神障礙的癥狀[91]。