李文澍，劉雪梅

一次成功的臨床妊娠需要經(jīng)歷卵母細(xì)胞成熟、精卵細(xì)胞融合及胚胎發(fā)育等過(guò)程，而減數(shù)分裂和有絲分裂的正常進(jìn)行是卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎正常發(fā)育的基礎(chǔ)條件之一。在細(xì)胞分裂過(guò)程中同源染色體通過(guò)微管組織中心呈對(duì)稱排列，在兩極紡錘體的牽引下染色體分裂形成下一級(jí)細(xì)胞，而紡錘體組裝及染色體分離都離不開(kāi)微管蛋白的基礎(chǔ)作用，其中TUBB8是一種特殊的微管蛋白亞型，在人類卵母細(xì)胞和早期胚胎細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用[1-2]。既往研究表明TUBB8基因發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟障礙、受精障礙和早期胚胎發(fā)育停滯等[3-4]?，F(xiàn)報(bào)告1例TUBB8基因突變型導(dǎo)致患者反復(fù)早期胚胎發(fā)育停滯的臨床病例。

1 病例報(bào)告

患者 女，36歲，因婚后未避孕未孕10年，于2018年10月7日就診于我院生殖醫(yī)學(xué)中心。平素月經(jīng)規(guī)律，周期30 d。體質(zhì)量指數(shù)（BMI）21.6 kg/m2，抗苗勒管激素（AMH）2.634 ng/mL（1 ng/mL=7.14 pmol/L）?；A(chǔ)性激素水平和甲狀腺功能未見(jiàn)明顯異常。子宮輸卵管造影（HSG）示：宮腔顯影正常，雙側(cè)輸卵管顯影，盆腔造影劑彌散局限。染色體核型為46，XX。2018年10月31日因超聲發(fā)現(xiàn)宮腔內(nèi)異?；芈曈谖以盒袑m腔鏡檢查術(shù)+宮腔鏡下子宮內(nèi)膜息肉切除術(shù)，術(shù)中見(jiàn)：左側(cè)輸卵管開(kāi)口處可見(jiàn)5 mm×3 mm息肉，宮腔前后壁遍布息肉樣增生；術(shù)后病理回報(bào)為子宮內(nèi)膜息肉。男方39歲，BMI25.1 kg/m2。精液常規(guī)示弱精子癥、畸形精子癥。染色體核型為46，XY。因甲狀腺功能減退口服優(yōu)甲樂(lè)治療。雙方均無(wú)不良生活習(xí)慣及嗜好，未從事生殖毒性的相關(guān)工作。

2018年12月—2019年12月患者于我院生殖醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行了4個(gè)體外受精/卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（IVF/ICSI）周期的助孕治療。①2018年12月24日行第1周期：控制性超促排卵（COH）方案采用拮抗劑方案，當(dāng)有1個(gè)以上優(yōu)勢(shì)卵泡直徑大于18 mm或2個(gè)以上優(yōu)勢(shì)卵泡直徑大于17 mm時(shí)，肌內(nèi)注射人絨毛膜促性腺激素（hCG）6 000 IU扳機(jī)，34～36 h后取卵，共獲卵4枚。男方當(dāng)日因精液量少，精子濃度低，進(jìn)行了2次取精，2次精液合并處理后行IVF受精。受精后2 h實(shí)驗(yàn)室觀察見(jiàn)2枚卵母細(xì)胞排出第二極體，第2日（D2）觀察未見(jiàn)2原核（2PN）的受精卵，第3日（D3）觀察見(jiàn)2枚受精卵形成3細(xì)胞的胚胎，因未形成可移植胚胎取消周期。②2019年2月25日行第2周期：COH方案采用卵泡期長(zhǎng)效長(zhǎng)方案助孕，月經(jīng)第3天給予促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（GnRHa，達(dá)菲林）3.75 mg肌內(nèi)注射，注射后33 d超聲及性激素檢查示卵巢卵泡處于基礎(chǔ)狀態(tài)，每天給予FSH（麗申寶）300 IU及重組人生長(zhǎng)激素4 IU。扳機(jī)后34～36 h取卵，共獲卵8枚。IVF受精后2 h觀察見(jiàn)5枚卵母細(xì)胞排出第二極體，D2觀察未見(jiàn)2PN的受精卵，D3觀察有2枚受精卵卵裂分別形成8細(xì)胞和5細(xì)胞的胚胎，移植后未孕。③2019年6月22日行第3周期：COH方案采用長(zhǎng)方案助孕，扳機(jī)后34～36 h取卵，共獲卵5枚。由于前2個(gè)周期IVF后見(jiàn)第二極體排出，但D2未觀察到PN形成，因此本周期給予ICSI+卵母細(xì)胞激活助孕。D2實(shí)驗(yàn)室觀察見(jiàn)5枚卵母細(xì)胞均形成2PN的受精卵，D3觀察見(jiàn)其中4枚受精卵發(fā)生卵裂形成3～5細(xì)胞的卵裂期胚胎，移植1枚4細(xì)胞和1枚5細(xì)胞的胚胎后未孕，剩余2枚胚胎行囊胚培養(yǎng)未形成囊胚。④2019年11月27日行第4周期：COH方案采用拮抗劑方案，加用生長(zhǎng)激素，采用肌內(nèi)注射hCG4 000 IU+短效GnRHa（曲普瑞林）0.2 mg雙扳機(jī)，34～36 h后取卵，共獲卵8枚。本周期仍采用ICSI+卵母細(xì)胞激活助孕。D2實(shí)驗(yàn)室觀察見(jiàn)8枚卵母細(xì)胞均形成2PN的受精卵，D3觀察見(jiàn)7枚受精卵卵裂形成卵裂期胚胎，移植1枚8細(xì)胞和1枚4細(xì)胞的胚胎后未孕，剩余5枚胚胎行囊胚培養(yǎng)未形成囊胚。見(jiàn)表1。2020年6月對(duì)夫婦雙方進(jìn)行了全外顯子的測(cè)序（復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院）。結(jié)果經(jīng)Sanger測(cè)序確認(rèn)女方存在TUBB8基因的雜合突變——TUBB8，c.208C>T/p.Pro70Ser，見(jiàn)圖1；男方未發(fā)現(xiàn)突變基因。

表1 患者的IVF+ICSI臨床結(jié)果

圖1 TUBB8基因突變定位

2 討論

該患者有10年不孕病史，在排除了其他不孕相關(guān)因素后，患者首先進(jìn)行了2個(gè)周期的IVF治療。無(wú)論是實(shí)施拮抗劑方案還是卵泡期長(zhǎng)效長(zhǎng)方案，患者雖有成熟卵母細(xì)胞形成，但在隨后的受精及胚胎早期分裂結(jié)果均不理想。由于男方存在弱精子癥、畸形精子癥，首先考慮到精子質(zhì)量影響胚胎質(zhì)量的可能，遂更改方案，后2個(gè)周期采用ICSI方式，并加用了改善卵母細(xì)胞質(zhì)量的相應(yīng)措施。結(jié)果表明，成熟卵率與卵裂期胚胎形成率均得到改善，但最終所有胚胎的發(fā)育仍停滯在了8細(xì)胞期，并伴隨胚胎碎片化。綜合4個(gè)助孕周期，患者均能生成成熟卵母細(xì)胞，但存在卵母細(xì)胞受精障礙及早期胚胎發(fā)育停滯的情況，并通過(guò)查閱文獻(xiàn)，追蹤以往相似研究案例結(jié)果，可以得知存在于卵母細(xì)胞中的母體RNA與蛋白質(zhì)在受精卵形成后仍會(huì)對(duì)胚胎發(fā)育有影響，母體基因突變可能是導(dǎo)致早期胚胎發(fā)育停滯的主要原因之一[5]，遂對(duì)患者及其配偶進(jìn)行了全外顯子的測(cè)序，由此發(fā)現(xiàn)了突變基因型TUBB8，c.208C>T/p.Pro70Ser。

在卵母細(xì)胞和早期胚胎中，TUBB8基因是微管蛋白系列最重要的表達(dá)基因之一，而在減數(shù)分裂和有絲分裂過(guò)程中紡錘體組裝和染色體分離都離不開(kāi)微管蛋白的基礎(chǔ)作用[2]。TUBB8基因只存在于靈長(zhǎng)類動(dòng)物中，本身為高度保守的基因型，而基因錯(cuò)義突變會(huì)影響a/β微管蛋白等二聚體的折疊與組裝，改變了體內(nèi)微管蛋白的動(dòng)力學(xué)，使紡錘體發(fā)生組裝缺陷，并最終使卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育停滯[6]。文獻(xiàn)報(bào)道目前已發(fā)現(xiàn)82種TUBB8變異基因型[7]，不同變異基因型會(huì)呈現(xiàn)不同的臨床表型，包括：①形成的未成熟卵母細(xì)胞發(fā)育完全停滯；②形成無(wú)法受精的MⅡ期卵母細(xì)胞；③形成無(wú)法卵裂的受精卵；④形成的早期胚胎發(fā)育停滯；⑤形成外觀正常但反復(fù)植入失敗的胚胎[8]。大多數(shù)TUBB8致病變異基因型發(fā)生在中國(guó)[9]。本研究所闡述的TUBB8，c.208C>T/p.Pro70Ser的雜合子突變屬于新發(fā)現(xiàn)的突變型，未在既往的文獻(xiàn)中報(bào)道過(guò)，該基因型呈現(xiàn)的臨床表型為早期胚胎發(fā)育停滯，無(wú)法進(jìn)一步培養(yǎng)成正常的囊胚。

自從2016年Feng等[3]首次證明TUBB8基因突變會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟障礙和早期胚胎發(fā)育障礙，此后有相關(guān)研究證明了TUBB8基因突變導(dǎo)致的早期胚胎發(fā)育停滯。研究表明某些TUBB8突變患者可以形成MⅡ期卵母細(xì)胞，且能正常受精和卵裂，但形成的所有胚胎發(fā)育都停滯在2細(xì)胞期～8細(xì)胞期[10-11]。推測(cè)患者早期胚胎發(fā)育停滯的原因可能是TUBB8基因突變影響了卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中紡錘體的形成與組裝，使染色體不均勻分裂，雖然有的卵母細(xì)胞可以成熟形成MⅡ期卵母細(xì)胞，但受精后可能形成非整倍體胚胎，導(dǎo)致胚胎無(wú)法繼續(xù)正常發(fā)育[4，12]。Jia等[10]最新的研究闡述了另一種有關(guān)TUBB8基因突變導(dǎo)致胚胎發(fā)育停滯的機(jī)制，揭示了TUBB8基因中1個(gè)新的雜合突變（c.1041C>A；p.N347K），該突變可干擾有絲分裂紡錘體組裝和染色體排列使早期胚胎發(fā)育停滯，該研究將人TUBB8突變基因型cDNA注入小鼠的2PN受精卵中，突變基因型TUBB8 cDNA直接阻斷了受精卵的第一次有絲分裂，使97%的受精卵細(xì)胞無(wú)法形成功能正常的紡錘體，而在注射TUBB8正?；蛐蚦DNA后紡錘體長(zhǎng)度和胚胎形成率得到了明顯改善。Yuan等[11]的研究亦指出TUBB8基因突變引起的微管缺陷可導(dǎo)致紡錘體排列不規(guī)則，進(jìn)一步導(dǎo)致早期胚胎細(xì)胞第一次有絲分裂過(guò)程中卵裂球的不完全分離和Ⅱ型反向卵裂。

TUBB8基因外顯子編碼區(qū)測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)以下變異位點(diǎn)

TUBB8基因突變相關(guān)疾病有2種遺傳方式：父系起源的常染色體顯性遺傳和常染色體隱性遺傳。為進(jìn)一步探知TUBB8變異來(lái)源，應(yīng)檢測(cè)女方的父母及兄弟姐妹的血樣，但因患者為獨(dú)生女，母親已去世，父親因身體等情況拒絕進(jìn)行檢測(cè)，因此未行相關(guān)檢測(cè)，無(wú)法確定該基因型是新發(fā)的突變型還是遺傳所致。

雖然現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了數(shù)十種致病的TUBB8基因突變型，但目前還缺乏有效的治療方法。Jia等[10]的研究雖然提出正?；蛐蚑UBB8 cDNA胞內(nèi)注射可以改善小鼠細(xì)胞紡錘體的組裝，并且注射后胚胎可以正常發(fā)育并產(chǎn)生活的后代，但小鼠早期胚胎分裂模式與人類不同，所以正?；蛐蚑UBB8 cDNA胞內(nèi)注射在人體內(nèi)應(yīng)用的安全性和有效性方面還缺乏實(shí)驗(yàn)論據(jù)支持。此外對(duì)生發(fā)泡置換、細(xì)胞質(zhì)和紡錘體移植等進(jìn)一步的研究可能會(huì)引發(fā)新的治療思路，但目前都尚不成熟。Ca2+可能參與早期胚胎細(xì)胞有絲分裂，Ca2+促進(jìn)了紡錘體微管的破裂，并調(diào)節(jié)染色體向兩側(cè)紡錘體極點(diǎn)移動(dòng)[13]，因此有研究提出補(bǔ)充Ca2+可能對(duì)TUBB8基因突變引發(fā)的胚胎發(fā)育停滯有正向治療作用的觀點(diǎn)[12]。

綜上所述，TUBB8基因在人類卵母細(xì)胞發(fā)育、受精和早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用，基因突變會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)育阻滯和早期胚胎發(fā)育停滯。本研究對(duì)有10年不孕史并反復(fù)IVF/ICSI助孕后早期胚胎發(fā)育停滯的患者進(jìn)行了全外顯子基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了一種新的TUBB8基因突變型（c.208C>T/p.Pro70Ser）。該突變基因型導(dǎo)致胚胎發(fā)育停滯的具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)基礎(chǔ)研究探討。

志謝感謝復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王磊教授和陳標(biāo)榜老師的基因檢測(cè)工作。