賴燕清

（福建醫(yī)科大學附屬龍巖第一醫(yī)院 龍巖364000）

骨性關節(jié)炎（Osteoarthritiis,OA）是臨床中最常見的一種骨退行性病變，臨床多表現(xiàn)為關節(jié)疼痛、腫脹以及活動受限[1～3]。流行病學研究結果顯示，全球范圍內約有1.4億人患有OA[4]。目前OA治療并無靶向性藥物，早中期多使用非甾體類藥物干預，但存在明顯的胃腸道副反應，因此只適合短期對癥治療[5～6]。中醫(yī)藥對于早中期OA有著良好的療效，在OA的治療中日益受到認可[7]。三七是一味臨床上常見治療OA的中藥，具有祛風除濕、通痹止痛的功效[8～9]?，F(xiàn)代藥理學研究顯示，三七具有抗炎、鎮(zhèn)痛以及抗腫瘤等作用[10～11]。但三七對OA的作用機制，目前尚不明確。網(wǎng)絡藥理學可以利用現(xiàn)有文獻基礎和生物信息學，從多成分、多靶點以及多通路的角度出發(fā)，構建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡，探討多種中藥成分與疾病之間的相互作用機制。因此本研究擬運用網(wǎng)絡藥理學技術，初步探討三七配伍對OA的作用機制，以期為后續(xù)研究提供理論參考?，F(xiàn)報道如下：

1 工具與方法

1.1 三七活血成分及潛在治療靶點收集 使用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP）數(shù)據(jù)庫[12]對三七的活性成分進行篩選。以利用度（OB）≥30%以及類藥性（DL）≥0.18為條件進行篩選，并將篩選后的活性成分使用TCMSP、草藥成分指標數(shù)據(jù)庫（Herbal Ingredients'Targets Database,HIT）[13]及PubChem數(shù)據(jù)庫查找相應靶點，并使用Excel進行整理。

1.2 OA治療靶點收集 使用治療靶點數(shù)據(jù)庫（Therapeutic Target Database,TTD）[14]以 及GeneCards數(shù)據(jù)庫[15]收集OA潛在治療靶點，以“Osteoarthritis”為檢索詞，采用Excel將得到的靶點信息進行整合。TTD數(shù)據(jù)庫即含有研究成功的臨床藥物靶點，也有目前在研的藥物靶點，且均經(jīng)過試驗驗證，可信度較強。GeneCards通過整合網(wǎng)絡多個基因數(shù)據(jù)庫，含有所有關于人類的基因注釋信息和預測信息，信息較全。

1.3 構建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡 將三七有效活性成分相應靶點以及OA治療靶點進行合并，取其交集，即為三七-OA潛在治療靶點。以三七有效成分和三七-OA潛在治療靶點為節(jié)點，在Excel表格中建立藥物-成分-靶點-疾病關系，導入Cytoscape3.7.2軟件中建立三七活性成分與OA治療靶點之間的相互作用網(wǎng)絡。

1.4 KEGG通路以及GO富集分析 將三七-OA潛在治療靶點在David網(wǎng)站[16]進行KEGG（京都基因與基因組百科全書）通路富集分析以及基因本體（Gene Ontology,GO）生物過程富集分析，GO分析包括生物學過程（Biological Process,BP）、細胞組分（Cellular Component,CC）、分子功能（Molecular Function,MF）三個部分。使用R語言對P值進行校正并選擇前10個分析結果進行氣泡圖展示，進一步探討三七治療OA的潛在作用機制。

1.5 關鍵基因鑒定以及子模塊分析 使用STRING數(shù)據(jù)庫[17]對三七-OA治療靶點構建蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡（PPI），隨后使用Cytoscape軟件進行可視化。具有最高自由度的基因被認為是關鍵基因。對三七-OA共靶向基因進行模塊分析，使用MCODE插件進行子模塊分析，子模塊納入標準如下：MCODE評分＞5，節(jié)點數(shù)量＞10，并對模塊分析結果進行KEGG通路富集分析。

2 結果

2.1 三七活血成分及潛在治療靶點 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，以口服OB≥30%以及DL≥0.18為篩選條件，檢索到8種三七有效成分，其中包括β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素以及人參皂苷等。見表1。將檢索到的有效成分在TCMSP及HIT數(shù)據(jù)庫上收集相應的治療靶點，Excel整理查重后共有186個治療靶點。

表1 TCMSP數(shù)據(jù)庫中三七有效成分

2.2 三七治療骨關節(jié)炎靶點 通過檢索TTD以及GeneCards數(shù)據(jù)庫，Excel整理取出重復值，共篩選出骨關節(jié)炎潛在治療靶點1 282個。將三七治療靶點與骨關節(jié)炎治療靶點進行匹對，共發(fā)現(xiàn)靶點88個。見圖1。

圖1 三七治療OA靶點

2.3 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡 將三七的每個有效成分和其相對應治療靶標導入Cytoscape軟件中，繪制成分-靶點對應圖形，以紅色倒三角形代表三七活性成分，黃色圓形代表潛在治療靶點。結果顯示三七中主要活性成分包括β-谷甾醇、豆甾醇、人參皂苷Rh2、食脂素、亞油酸乙酯以及槲皮素，而其中最主要的三個活性成分為β-谷甾醇、人參皂苷Rh2以及槲皮素。見圖2。

圖2 “三七-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖

2.4 KEGG通路富集分析 將關鍵靶基因在David網(wǎng)站中進行KEGG通路富集，共富集顯著性通路101條。使用R語言對P值進行校正并選擇前10條通路進行氣泡圖展示。結果顯示三七治療OA的信號通路主要富集在腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、Toll樣受體信號通路、凋亡以及缺氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路等。見圖3。

圖3 三七-OA共同靶點KEGG通路富集分析結果

2.5 GO富集分析 將獲得的三七-OA共同靶點放入David網(wǎng)站上進行GO富集分析，選擇生物學過程（BP）、分子功能（MF）以及細胞組分（CC）三個內容。結果顯示三七-OA共同靶點在BP上主要富集在藥物反應、衰老、缺氧反應以及炎癥反應等生物學過程上；在MF上主要富集在酶結合、轉錄因子結合、蛋白結合以及細胞因子活性等分子功能上；在CC上主要位于細胞外間隙、胞膜以及細胞質中。見圖4～圖6。

圖4 三七-OA共同靶點GO-BP富集分析結果

圖5 三七-OA共同靶點GO-MF富集分析結果

圖6 三七-OA共同靶點GO-CC富集分析結果

2.6 關鍵基因以及子模塊分析 三七-OA共同靶點蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡如圖7所示，自由度前3個基因分別為IL-6、TNF以及AKT1，被認為是關鍵基因。MCODE插件發(fā)現(xiàn)子模塊1個，含有45個節(jié)點、780條邊，如圖8A所示。使用David數(shù)據(jù)庫對子模塊進行KEGG分析，子模塊基因主要富集在TNF信號通路以及類風濕性關節(jié)炎等。見圖8B。

圖7 三七-OA共同靶點蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡

圖8 子模塊分析以及KEGG通路富集分析結果

3 討論

隨著我國老齡化社會程度加重，我國OA患者呈逐年增加趨勢。OA的主要病理表現(xiàn)有滑膜炎癥、軟骨損傷以及軟骨下骨的反應性增生[18]。流行病學調查結果顯示，OA是導致下肢殘疾的十大原因之一[19]。關節(jié)置換術被認為是治療終末期OA的黃金方法，但其仍然存在療效不滿意、并發(fā)癥高、感染、返修等不足[20]。因此如何延緩早中期OA患者過早進展成重度OA，延緩初次關節(jié)置換年齡一直是骨科醫(yī)師研究的重點。

中醫(yī)藥在早中期OA治療中的療效一直受到認可[7,21]。OA屬于中醫(yī)學痹病范疇，多由于素體正氣不足，腠理不密，衛(wèi)外不固，外邪入侵可使津血運行不暢，氣滯血瘀，不通則痛；此外長期反復發(fā)作可進一步損傷肝腎，導致肝腎虧虛，筋脈失養(yǎng)，不榮則痛。三七有化瘀止血、活血定痛功效，對于早中期OA患者，可以有效促進血液運行，避免氣滯血瘀，延緩早中期OA患者過早進展成重度OA。戶紅卿等[9]的研究結果顯示，三七結合針灸可以有效改善血瘀型膝原發(fā)性骨關節(jié)炎患者臨床癥狀；喬登朝等[22]的研究結果也顯示三七可以有效抑制創(chuàng)傷性膝關節(jié)滑膜炎，抑制患者疼痛?，F(xiàn)代藥理學研究結果也顯示三七總皂苷可以有效抑制關節(jié)炎大鼠血清中炎癥介質的表達，從而達到抑制滑膜炎、改善患肢功能的療效[10]。此外，三七總皂苷聯(lián)合白芍總苷具有抑制急性痛風性關節(jié)炎大鼠血清中IL-1β、IL-18、TNF-α含量，并抑制滑膜組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、TNF-α等表達的作用[23]，然而三七對于OA的作用機制，目前尚不明確。

本研究從網(wǎng)絡藥理學出發(fā)，探討三七治療OA的潛在治療機制。本研究共檢索出三七8種有效治療成分，映射治療OA靶標88個。在“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡中發(fā)現(xiàn)有3種有效成分最為顯著，即β-谷甾醇、人參皂苷Rh2以及槲皮素。GO富集結果顯示三七-OA共同靶點主要富集在藥物反應、衰老、缺氧反應以及炎癥反應等生物學過程上，提示三七可以有效抑制OA炎癥，這與之前的文獻結果也是相符的[10，23]。KEGG通路富集結果顯示三七治療OA的信號通路主要富集在TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、凋亡以及HIF-1信號通路等。TNF信號通路、Toll樣受體信號通路與炎癥、免疫調節(jié)等生物學功能密切相關，進一步提示三七對于OA炎癥的抑制作用。此外，PPI網(wǎng)絡顯示三七治療OA的前3個關鍵基因為IL-6、TNF以及AKT1，且子模塊KEGG通路富集分析結果也顯示主要富集在TNF信號通路上，提示三七治療OA可能與TNF炎癥信號通路相關。

綜上所述，本研究以經(jīng)典中藥三七為研究對象，利用網(wǎng)絡藥理學和生物信息學相關技術，探討三七治療OA的有效活性成分、潛在靶點以及相關信號通路，構建藥物成分靶點網(wǎng)絡并進行KEGG和GO富集分析，闡述三七治療OA的潛在作用機制。結果顯示三七治療OA最主要的三個活性成分為β-谷甾醇、人參皂苷Rh2以及槲皮素；三七治療OA主要涉及炎癥反應、衰老、缺氧等生物學過程；三七治療OA主要通過腫瘤壞死因子信號通路、衰老以及Toll樣受體相關通路等；三七治療OA前3位關鍵基因為IL-6、TNF、AKT1。