周玲玲 韓之瑾 章如新 王晉超 黃昱 孫娜 胡嘉樺 鮑婧 董維陽 鄧從蕊 莊國順

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院耳鼻咽喉科 上海 200040；2.復(fù)旦大學(xué)環(huán)境科學(xué)及工程系 上海 200433)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是鼻科領(lǐng)域的常見病，嚴(yán)重影響人類健康[1]。AR不僅受遺傳因素的影響，還與環(huán)境因素尤其是大氣污染密切相關(guān)[2-3]。有研究[4]發(fā)現(xiàn)，空氣中的細顆粒物(particulate matter 2.5，PM2.5)，空氣動力學(xué)直徑≤2.5 μm的大氣污染物，可引起鼻黏膜上皮細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)、鼻黏膜上皮屏障損害等。迷迭香酸(rosmarinic acid，RA)是一種天然存在的酚酸類化合物，可作為抗氧化劑減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)[5]，還具有免疫調(diào)節(jié)功能[6]，并對鼠類哮喘模型的氣道炎癥和高反應(yīng)性有抑制作用[7]。但目前尚無AR針對PM2.5暴露AR抗氧化應(yīng)激作用的研究。本研究將通過觀察RA對AR大鼠模型PM2.5暴露后鼻黏膜上皮細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，為PM2.5誘發(fā)加重AR的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 PM2.5的采集 研究使用的PM2.5是從上海市區(qū)內(nèi)PM2.5檢測站安置專用采集器收集的。采集器采用Whatman 41濾膜(Whatman,英國)和TSP / PM10 / PM2.5-2采樣器(Dickel,中國)，收集后置于恒溫恒濕箱中，在溫度(20.0±0.1)℃、相對濕度(40±2)%實驗條件下，電子天平(Sartorius 25S BT，精密度為10 μg，德國)對經(jīng)過平衡48 h以上的樣品進行稱量。將PM2.5樣品超聲振蕩洗脫45 min，收集洗脫液，過濾。在-20 ℃冰箱保存PM2.5樣品備用。

1.2 實驗分組和AR大鼠模型制備 選取5周齡清潔級雌性Sprague-Dawley大鼠32只，體重180~200 g。所有實驗步驟符合復(fù)旦大學(xué)動物倫理委員會的要求(編號：SYXK-2014-0029-DF358)。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，稱重并編號，隨機分為4組：正常對照組(NC組)，AR模型組(AR 組)，PM2.5吸入暴露AR模型組(ARE組), RA干預(yù)PM2.5吸入暴露AR模型組(RA組)。按Guo等[8]報道的卵清蛋白(ovalbumin, OVA)致敏法制備AR動物模型。將抗原OVA(Sigma-Aldrich公司,美國)30 mg、佐劑氫氧化鋁(Sigma-Aldrich公司,美國)3 000 mg和生理鹽水100 mL配成混懸液，每次致敏使用1 mL。隔天腹腔內(nèi)注射1次，共7次(第1、3、5、7、9、11、13天)。同期在NC組腹腔注射相同體積的無菌鹽水。間隔10 d，從第24~30天，每天1次在鼻腔內(nèi)以1%OVA100 μL滴鼻，連續(xù)7 d，進行鼻腔局部激發(fā)。在相同條件下，對NC組大鼠使用無菌鹽水滴注。按照以上步驟對AR組、ARE組和RA組進行AR造模。RA組從第24~30天，以20 mg/kg計算，每天腹腔注射RA 4 mg(Meilunbio公司，大連)進行干預(yù)，共7 d。

1.3 PM2.5吸入暴露方法 本研究采用濃度可調(diào)控PM2.5吸入暴露裝置。裝置由PM2.5密封透明暴露觀察艙、PM2.5氣溶膠生成系統(tǒng)、PM2.5監(jiān)測系統(tǒng)、空氣輸入輸出系統(tǒng)及PM2.5過濾系統(tǒng)等組成。將PM2.5和加壓后的空氣一起放入PM2.5氣溶膠生成系統(tǒng)，通過調(diào)節(jié)輸出PM2.5氣溶膠速度，PM2.5監(jiān)測系統(tǒng)實時測定暴露艙內(nèi)PM2.5濃度，使PM2.5濃度穩(wěn)定維持在1 000 μg/m3。 ARE組和RA組從基礎(chǔ)致敏開始連續(xù)30 d吸入濃度1 000 μg/m3PM2.5，每天3 h。而NC組和AR組以無菌生理鹽水吸入暴露。

1.4 大鼠鼻部生物學(xué)行為觀察 記錄不同組別大鼠第30天最后1次鼻腔局部激發(fā)后15 min內(nèi)生物學(xué)行為：噴嚏及撓鼻次數(shù)，評估大鼠鼻部癥狀。

1.5 大鼠標(biāo)本采集 大鼠鼻部生物學(xué)癥狀評估后，按3%戊巴比妥鈉進行腹腔注射(30 mg/kg)，待完全麻醉后，解剖腹腔暴露腹主動脈取血，收集血液，3 000×g離心10 min提取血清，-80 ℃保存待檢。解剖鼻腔并取鼻中隔其中一側(cè)鼻黏膜置于4%甲醛溶液固定，收集鼻腔黏膜新鮮組織標(biāo)本送檢測。

1.6 大鼠樣本檢測 生化法測定大鼠鼻黏膜超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量；酶聯(lián)免疫吸附測 定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清OVA特異性IgE(ovalbumin-specif ic IgE，OVA-sIgE)；免疫熒光法檢測鼻黏膜上皮細胞中核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor-2，Nrf2)表達量；蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色觀察大鼠鼻黏膜的病理學(xué)改變。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 本研究使用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以(?)表示，組間差異采用單因素方差分析。使用Image Pro Plus 6.0圖像進行半定量分析。以P<0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠生物學(xué)行為評估 對各組大鼠進行生物學(xué)行為觀察，AR組、ARE組大鼠的噴嚏及撓鼻次數(shù)顯著高于NC組(P<0.01)，而RA組大鼠噴嚏及撓鼻次數(shù)低于ARE組(P<0.01)，見圖1A和圖1B。ELISA測定各組大鼠血清OVA-sIgE含量：NC組、AR組、ARE組、RA組OVA-sIgE分 別 為(5.32±0.97)、(115.17±11.83)、(145.04±9.54)、(113.73± 13.71)ng/mL，AR組大鼠OVA-sIgE顯著高于NC組(P<0.01)，ARE組較AR組增加(P<0.01)，RA組較ARE組下降(P<0.01)，見圖1C。

圖1 RA對PM2.5暴露AR大鼠鼻部癥狀及血清OVA-sIgE的影響 A.大鼠噴嚏次數(shù)；B.大鼠撓鼻次數(shù)；C.大鼠血清OVAsIgE。*示P<0.05，**示P<0.01，***示P<0.001。

2.2 RA對PM2.5暴露AR大鼠鼻黏膜上皮細胞氧化應(yīng)激的影響 采用生化法測定鼻黏膜勻漿中SOD活性和MDA含量，見圖2。NC組、AR組、ARE組、RA組的SOD活性分別為(135.67±4.33)、(81.01±9.32)、(25.50±12.84)、(127.92±15.34)U/mg。SOD水平自NC組、AR組到ARE組，呈逐漸降低趨勢，RA組SOD活性較ARE組增加(P值均<0.01)，見圖2A。NC組、AR組、ARE組、RA組的MDA含量分別為(29.69±4.21)、(51.34±5.23)、(73.13±3.14)、(50.19±2.99)nmoL/mg。MDA水平自NC組、AR組到ARE組，呈逐漸增加趨勢，而經(jīng)過RA處理后MDA較ARE組下降，以上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.01)，見圖2B。

圖2 RA對PM2.5暴露AR大鼠鼻黏膜SOD和MDA的影響 A.大鼠鼻黏膜SOD活性；B.大鼠鼻黏膜MDA含量。*示P< 0.05，**示P < 0.01，***示P<0.001。

各組大鼠鼻黏膜細胞Nrf2蛋白免疫熒光染色和半定量分析顯示見圖3。圖中綠色表示鼻黏膜上皮細胞核中Nrf2蛋白含量。NC組、AR組、ARE組和RA組分別為0.11±0.02、0.15±0.03、0.21±0.02、0.15±0.03。相對于NC組，AR組Nrf2蛋白表達升高(P<0.01)，ARE組較AR組表達升高(P<0.01)，RA組較ARE組表達下調(diào)(P<0.01)。

圖3 RA對PM2.5暴露AR大鼠鼻黏膜Nrf2表達的影響 A.NC組(×200)；B.AR組(×200)；C. ARE組(×200)；D. RA組(×200)；E. Nrf2半定量結(jié)果。*示P<0.05，**示P<0.01，***示P<0.001。圖中綠色熒光代表細胞核中Nrf2蛋白表達。

2.3 RA對PM2.5暴露AR大鼠鼻黏膜組織病理學(xué)的影響 HE染色結(jié)果顯示，NC組大鼠鼻黏膜組織結(jié)構(gòu)整齊(圖4A)，而AR組大鼠鼻黏膜上皮細胞排列略顯紊亂，腺體擴張，間質(zhì)細胞增多，血管擴張(圖4B)。ARE組大鼠鼻黏膜上皮細胞脫落，黏膜固有層炎性細胞浸潤明顯增多及腺體增生，血管擴張(圖4C)。RA干預(yù)后大鼠鼻黏膜病理損傷減輕(圖4D)。

圖4 RA對PM2.5暴露AR大鼠鼻黏膜組織病理學(xué)的影響(×400) A.NC組；B.AR組；C.ARE組；D.RA組。

3 討論

AR是鼻部Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病，由于發(fā)病機制復(fù)雜，其病因尚未完全被揭示[9]。AR的防治仍然是目前面臨的一個重要課題。近年來大氣污染誘發(fā)AR日益引起關(guān)注。PM2.5對AR的發(fā)病影響已被流行病學(xué)資料所證實。

鼻腔作為呼吸防御系統(tǒng)的第一道門戶，首當(dāng)其沖會受到PM2.5有害物質(zhì)的刺激，從而誘發(fā)AR，增加了相關(guān)醫(yī)療費用支出[10]。Tacer等[11]在PM2.5高暴露區(qū)研究發(fā)現(xiàn)PM2.5濃度每增加10 μg/m3，兒童AR患病率增加1.15倍。國內(nèi)研究通過對229 685名北京市民AR日門診量和當(dāng)日PM2.5濃度相關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)PM2.5含量每增加10 μg/m3，當(dāng)天AR門診人次增加0.47%[12]。所以PM2.5暴露下AR的防治尤 為重要。

AR為IgE介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)性疾病，當(dāng)機體受到過敏原刺激后，漿細胞產(chǎn)生的IgE抗體，與肥大細胞表面Fc-εRI受體及變應(yīng)原發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，促使肥大細胞脫顆粒釋放白三烯、肝素等炎性介質(zhì)，促發(fā)AR相應(yīng)臨床癥狀。在本研究中，血清OVA-sIgE水平自NC組、AR組到ARE組呈逐漸增高趨勢，與大鼠的鼻部癥狀噴嚏、撓鼻一致。表明AR動物模型制備成功，PM2.5吸入暴露后可進一步加重鼻黏膜的免疫應(yīng)答。經(jīng)過RA干預(yù)后，PM2.5暴露AR大鼠的鼻部癥狀改善，血清OVA-sIgE減少。RA可以通過減少OVA-sIgE改善PM2.5暴露AR大鼠的鼻部癥狀，減輕變態(tài)反應(yīng)。

當(dāng)抗氧化系統(tǒng)無法消除多余活性氧(reactive oxygen species，ROS)時，抗氧化系統(tǒng)和氧化系統(tǒng)的平衡被破壞，可引發(fā)氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激反應(yīng)參與AR發(fā)病過程。SOD是重要的抗氧化酶，催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫[13]。MDA是機體內(nèi)自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的最終氧化產(chǎn)物，具有細胞毒性作用，間接地反映出細胞損傷的程度[14]。Nrf2是細胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，主要表達在細胞質(zhì)中。當(dāng)細胞處于氧化應(yīng)激，Nrf2活化從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運入核[15]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過OVA致敏后AR大鼠鼻黏膜中的SOD活性降低，而MDA含量增加，鼻黏膜中的Nrf2表達增加。PM2.5是空氣污染的重要污染物，其毒性效應(yīng)來自PM2.5含碳核心及其包含的有機成分如多環(huán)芳烴類化合物和無機成分如金屬離子。有文獻[16]報道PM2.5暴露加重AR患者的氧化應(yīng)激反應(yīng)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)PM2.5可以通過氧化應(yīng)激反應(yīng)、線粒體離子穩(wěn)態(tài)失衡和線粒體損傷機制導(dǎo)致鼻黏膜損傷[17]。本研究發(fā)現(xiàn)AR大鼠持續(xù)吸入暴露PM2.5后，鼻黏膜上皮細胞脫落壞死，腺體增加，間質(zhì)細胞增多。大鼠鼻黏膜中SOD活性降低而MDA含量增加。鼻黏膜細胞核中Nrf2熒光表達增加。PM2.5 通過氧化應(yīng)激反應(yīng)引起鼻黏膜炎性反應(yīng)從而改變鼻黏膜上皮細胞形態(tài)，降低細胞活性，引起鼻黏膜上皮細胞損害及屏障功能障礙，誘發(fā)及加重AR。

RA廣泛存在植物中，常見于迷迭香和紫蘇等，其分子式為C18H16O8，相對分子質(zhì)量為360.33，具有很強的抗氧化性[18]。有文獻[19]報道RA可以通過清除紫外線誘導(dǎo)的細胞內(nèi)ROS，對中波紫外線誘導(dǎo)的HaCaT細胞形成氧化應(yīng)激保護作用。Rong等[20]發(fā)現(xiàn)RA可以通過激活Nrf2誘導(dǎo)的細胞抗氧化防御系統(tǒng)來減輕淀粉樣β蛋白誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。RA在小鼠哮喘模型中可以顯著升高SOD的低水平表達，明顯抑制ROS的高水平表達，上調(diào)抗氧化因子Cu/Zn SOD蛋白，下調(diào)NOX-2和NOX-4 mRNA蛋白表達，來減輕肺損傷[21]。RA作為天然存在的抗氧化劑，副作用小，受到廣泛關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過RA干預(yù)的PM2.5暴露AR模型，鼻黏膜上皮細胞纖毛脫落減少，黏膜下間質(zhì)細胞減少，組織腫脹減輕；大鼠鼻黏膜內(nèi)SOD活性升高，MDA含量降低；鼻黏膜細胞內(nèi)Nrf2蛋白表達減少；鼻黏膜損傷減輕。RA可能通過降低Nrf2轉(zhuǎn)錄因子表達，增加SOD活性和降低MDA含量，改善PM2.5暴露引起的氧化還原反應(yīng)，減輕鼻黏膜的損傷。

RA可以通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)緩解PM2.5暴露AR大鼠的鼻部癥狀及鼻黏膜損傷，作為抗氧化劑在PM2.5誘發(fā)AR的防治中具有潛在的應(yīng)用前景。