石鑫，李莎，王志敏，付開赟，付文君，姜衛(wèi)華

新疆馬鈴薯甲蟲對噻蟲嗪的抗性監(jiān)測及其細胞色素P450基因表達分析

石鑫1，李莎1，王志敏1，付開赟2，付文君3，姜衛(wèi)華1

1南京農業(yè)大學植物保護學院，南京 210095；2新疆農業(yè)科學院植物保護研究所/農業(yè)農村部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091；3新疆伊犁州農業(yè)技術推廣總站，新疆伊寧 835000

【】以世界性害蟲馬鈴薯甲蟲（）為研究對象，篩選其參與噻蟲嗪解毒的細胞色素P450主效基因。于2018、2019年利用點滴法監(jiān)測新疆察布查爾縣、伊寧縣、塔城市、烏魯木齊市和吉木薩爾縣11個馬鈴薯甲蟲田間種群對噻蟲嗪的抗性水平，并測定分析噻蟲嗪LD50處理72h后成蟲中3種主要解毒酶細胞色素P450酶（P450）、谷胱甘肽-轉移酶（GST）和酯酶（EST）的活性變化。利用Illumina HiSeqTM2500高通量測序技術進行轉錄組測序，獲得抗性和敏感種群之間的差異表達基因（DEG），運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術驗證3個P450基因并分析6個P450基因（、、和）在不同種群及噻蟲嗪處理后的表達情況。抗性監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，2018年的YN1、URMQ1、TC和QPQL1以及2019年的YN2和JMS種群成蟲對噻蟲嗪抗性倍數(shù)（RR）分別達到5.99、8.81、10.86和20.33倍和11.82、14.05倍，為低至中水平抗性。解毒酶活性測定結果表明，2個敏感種群URMQ2、URMQ3以及2個抗性種群YN2、JMS成蟲分別經(jīng)噻蟲嗪LD50處理72 h后其P450活性均顯著增加，分別為對照的1.76、2.75、1.91和1.66倍。另外，URMQ3種群的GST（CDNB和DCNB為底物）及URMQ2、YN2種群的EST活性顯著升高，分別為對照的1.19、2.10倍和1.35、1.91倍。轉錄組分析表明，通過合并組裝分別獲得噻蟲嗪敏感和抗性種群樣品56 872 051和62 249 136個原始序列數(shù)據(jù)以及55 903 706和61 082 076個過濾后的序列數(shù)據(jù)，過濾后的序列長度分別為8.39和9.16 G，堿基錯誤率均為0.03%。抗性種群中差異表達的P450基因13個，其中2個基因顯著上調。3個上調的P450基因和的qRT-PCR檢測結果與轉錄組測序結果基本一致，qRT-PCR分析還發(fā)現(xiàn)和在抗性種群成蟲中表達量顯著增加，噻蟲嗪LD50處理均可引起URMQ2種群4齡幼蟲和成蟲表達量顯著上調。相關性分析發(fā)現(xiàn)成蟲對噻蟲嗪的抗性水平與表達量呈顯著正相關?？赡茉隈R鈴薯甲蟲中對噻蟲嗪具有重要的解毒作用，其他基因的作用也不能排除。

馬鈴薯甲蟲；噻蟲嗪；抗藥性；細胞色素P450；基因表達

0 引言

【研究意義】馬鈴薯甲蟲（）屬鞘翅目葉甲科，是世界公認的馬鈴薯毀滅性檢疫害蟲。除直接取食危害寄主植物葉片外，成蟲還能傳播褐斑病、環(huán)腐病等病害，造成農作物產量和品質的巨大損失[1-2]。馬鈴薯甲蟲自20世紀90年代初經(jīng)哈薩克斯坦口岸傳入我國新疆，現(xiàn)已擴散至天山以北地帶，對當?shù)伛R鈴薯安全生產構成持續(xù)的威脅[3]。作為第4大類殺蟲劑[4]，新煙堿類殺蟲劑以其作用機制獨特、高效、低毒、對環(huán)境安全成為防治馬鈴薯甲蟲的主要殺蟲劑之一，其中1995年問世的吡蟲啉和1998年市場化的噻蟲嗪分別為第1代和第2代新煙堿類藥劑的代表品種[5]。隨著使用的頻繁，國內外抗性調查發(fā)現(xiàn)馬鈴薯甲蟲已對吡蟲啉等產生了不同水平的抗性。因此，闡明相關抗藥性分子機制對于防止抗性加劇及延長該類藥劑的使用壽命具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】Zhao等[6]2000年報道紐約州長島馬鈴薯甲蟲成蟲對吡蟲啉產生了100—150倍的極高水平抗性；Mota-Sanchez等[7]于2006年報道該地區(qū)種群對吡蟲啉的抗性已發(fā)展到309倍，另外美國特拉華、愛達荷、伊利諾斯等地區(qū)以及加拿大的安大略、愛德華王子島、魁北克田間種群也對吡蟲啉和噻蟲嗪產生不同程度的抗性。在我國，王志田等[8]調查發(fā)現(xiàn)新疆奇臺和烏魯木齊馬鈴薯甲蟲成蟲對吡蟲啉的抗性個體達到30%左右；劉萍等[9]監(jiān)測發(fā)現(xiàn)2009年新疆6個馬鈴薯甲蟲成蟲種群中有3個對啶蟲脒和噻蟲嗪產生低水平抗性，2010年監(jiān)測的6個種群均對噻蟲嗪產生了抗性，其中低抗和中抗種群各3個。由此可見，新疆馬鈴薯甲蟲對新煙堿類藥劑尤其是噻蟲嗪的抗性逐年發(fā)展。解毒代謝作用的增強是昆蟲抗藥性產生的重要機制之一。昆蟲體內的解毒酶系主要包括細胞色素P450單加氧酶系（cytochrome P450 monooxygenases，P450）、谷胱甘肽-轉移酶（glutathione-transferase，GST）和酯酶（esterase，EST），其中由P450介導的昆蟲抗藥性是主要的抗性機制。研究表明害蟲對新煙堿類殺蟲劑抗性的產生主要與P450基因過表達有關。Kaplanoglu等[10]對吡蟲啉抗性馬鈴薯甲蟲種群中顯著上調的進行RNA干擾（RNA interference，RNAi），驗證了該基因在抗性產生中的作用；Clements等[11-12]發(fā)現(xiàn)美國威斯康星州吡蟲啉抗性馬鈴薯甲蟲成蟲過表達，通過RNAi可使馬鈴薯甲蟲對吡蟲啉的抗性水平降低，作者隨后在該抗性種群中又發(fā)現(xiàn)另一個過表達的P450基因[13]?！颈狙芯壳腥朦c】近年來抗性監(jiān)測已發(fā)現(xiàn)新疆馬鈴薯甲蟲對噻蟲嗪的敏感性逐年下降，抗性分布不斷擴展且水平較高，但有關抗性分子機制尚不明確?！緮M解決的關鍵問題】監(jiān)測新疆不同地區(qū)馬鈴薯甲蟲對噻蟲嗪的抗性水平，測定噻蟲嗪處理對主要解毒酶活性的影響，利用轉錄組分析抗性和敏感種群的差異表達基因（differentially expressed gene，DEG），定量分析不同田間種群以及噻蟲嗪處理后的6個P450基因的表達水平，篩查與噻蟲嗪抗性相關的P450基因，為闡明馬鈴薯甲蟲對噻蟲嗪的代謝抗性分子機制打下基礎，同時為馬鈴薯甲蟲的抗性治理提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2018—2019年在新疆農業(yè)科學院植物保護研究所安寧渠試驗基地和南京農業(yè)大學植物保護學院昆蟲生理生化與分子生物學實驗室完成。

1.1 供試昆蟲

馬鈴薯甲蟲分別于2018年和2019年6—7月采自新疆察布查爾縣（Qapqal，QPQL）、伊寧縣（Yining，YN）、塔城市（Tacheng，TC）、烏魯木齊市（Urumqi，URMQ）和吉木薩爾縣（Jimusar，JMS）的田間馬鈴薯苗上，種群具體采集信息見表1。室內用馬鈴薯苗飼養(yǎng)，養(yǎng)蟲室條件為（26±1）℃，相對濕度50%—60%，光周期為光/暗=16 h/8 h。選取大小一致、生長狀態(tài)良好的4齡幼蟲和成蟲作為試蟲。2018年抗性測定參照的敏感種群QPQL-S于2015年6月采自察布查爾縣扎庫齊牛錄鄉(xiāng)，不接觸藥劑下飼養(yǎng)3年。

表1 馬鈴薯甲蟲種群采集信息

1.2 供試藥劑

97%吡蟲啉原藥（江蘇紅太陽有限公司）；95%噻蟲嗪原藥（鹽城雙寧農化有限公司）。

1.3 毒力測定

采用微量點滴法。使用丙酮溶解原藥并稀釋制備1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.007813 mg·mL-1系列梯度濃度的藥液。采用Hamilton微量進樣器進行藥劑點滴，藥劑點滴部位：成蟲腹部腹面第二節(jié)，4齡幼蟲腹部背面的第3、4節(jié)；點滴量：4齡幼蟲0.22 μL/頭，成蟲1.1 μL/頭。點滴同體積的丙酮作為對照。每個處理試蟲10頭，共3個重復。處理后置于塑料培養(yǎng)皿（直徑9 cm），在室內用新鮮馬鈴薯葉飼養(yǎng)，72 h后檢查死亡蟲數(shù)。馬鈴薯甲蟲死亡標準參考劉萍等[9]和盧偉平等[14]。

1.4 解毒酶活性測定

1.4.1 酶液制備 收集URMQ2、URMQ3、YN2和JMS種群成蟲分別經(jīng)噻蟲嗪LD50點滴法處理72 h后的存活個體，對照為丙酮處理，將試蟲單頭放于勻漿器內，加入1.2 mL 0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.6，其中含1 mmol·L-1EDTA，1 mmol·L-1DTT，1 mmol·L-1PTU，1 mmol·L-1PMSF）勻漿用于細胞色素P450單加氧酶活性測定；加入1.2 mL 0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.6）勻漿用于谷胱甘肽-轉移酶活性測定；加入1.2 mL 0.02 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.0）勻漿用于酯酶活性測定。勻漿液于4℃，13 000×下離心15 min后，將上清液轉移到新的1.5 mL離心管，重復離心一次后，取上清液作為酶源。每個處理6個生物學重復，3個技術性重復。

1.4.2 P450活性測定 在96孔酶標板中加入100 μL 2 mmol·L-1對硝基苯甲酚（PNA）和90 μL酶液，混合液在30℃溫育3 min，然后加入10 μL 9.6 mmol·L-1NADPH啟動反應。利用SPECTRA max?340-PC型酶標儀（美國Molecular Devices公司）在波長405 nm下記錄15 min內的吸光值變化，酶促反應溫度為30℃。

1.4.3 GST活性測定 在96孔酶標板中分別加入10 μL稀釋10倍的酶液（CDNB為底物）或25 μL酶液（DCNB為底物）、1.2 mmol·L-1CDNB或DCNB 100 μL，以及6 mmol·L-1谷胱甘肽（GSH）100 μL。在波長340 nm下記錄10 min內的吸光值變化，酶促反應溫度為27℃。

1.4.4 EST活性測定 在96孔酶標板中分別加入20 μL稀釋10倍的酶液，0.2 mol·L-1PBS（pH 6.0）與固藍RR鹽和-乙酸萘酯（-NA）的乙醇溶液（100 mmol·L-1）以1﹕2﹕0.01比例的混合液205 μL，在波長450 nm下記錄10 min內的吸光值變化，酶促反應溫度為27℃。

1.4.5 蛋白含量測定 采用Bradford考馬斯亮藍法測定粗酶液的蛋白質含量，以BSA做標準曲線[15]。

1.5 轉錄組測序

URMQ3和JMS種群成蟲用于轉錄組測序分析，每個種群設置3個重復，每個重復3頭試蟲。

轉錄組測序數(shù)據(jù)組裝及分析：RNA的提取、cDNA文庫的建立及測序工作由北京諾禾致源科技股份有限公司完成，采用Illumina HiSeqTM2500系統(tǒng)進行測序。使用HISAT2v2.0.5構建參考基因組的索引，并使用HISAT2 v2.0.5將配對末端clean reads與參照基因組比對，采用StringTie軟件新轉錄本進行組裝[16]。

轉錄組差異表達基因的篩選：首先對原始的readcount進行標準化（normalization），主要是對測序深度的校正。然后通過統(tǒng)計學模型進行假設檢驗概率（-value）的計算，最后進行多重假設檢驗校正（BH），得到FDR值（錯誤發(fā)現(xiàn)率）。以＜0.05、|log2fold change(Fc)|≥1作為篩選標準[17]，|log2Fc|越大，則基因表達差異越明顯。篩選出解毒代謝酶、表皮蛋白、ABC轉運蛋白、煙堿型乙酰膽堿受體等與抗性相關的差異表達基因。

1.6 馬鈴薯甲蟲種群P450基因表達量分析

1.6.1 總RNA提取及反轉錄 將馬鈴薯甲蟲4齡幼蟲和成蟲單頭分別按照Trizol試劑說明進行總RNA提取，于-80℃冰箱貯存?zhèn)溆茫總€處理6個重復。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（日本TaKaRa公司）反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。

1.6.2 實時熒光定量PCR 根據(jù)GenBank上馬鈴薯甲蟲的序列（NCBI登錄號分別為XP_023027514、XP_023018115、XP_023018114、XP_023021616、XP_ 023023178、XP_023015477），利用Beacon Designer 7.0軟件設計熒光定量PCR引物，委托南京金斯瑞公司合成，以和作為內參基因[18]，引物序列見表2。采用ABI 7500實時PCR系統(tǒng)（美國Applied Biosystems公司），以SYBR Green為染料，用稀釋5倍的cDNA作為模板，測定P450基因的相對表達水平。反應體系：SYBR Premix Ex TaqTM（2×）10 μL，cDNA模板1.0 μL，上、下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye2（50×）0.4 μL，用無核酶水補足至20 μL。PCR程序采用兩步法：95℃30 s；95℃5 s；60℃34 s，共40個循環(huán)，然后95℃15 s；60℃60 s；95℃15 s用于記錄熔解曲線。每組試驗重復3次。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

死亡率和校正死亡率的計算使用Abbott公式，采用機率值分析法計算毒力回歸曲線、LD50、相關系數(shù)及95%置信限，抗性倍數(shù)（RR）=田間測試種群的LD50/（相對）敏感種群的LD50?？顾幮运絽⒄找韵聵藴剩好舾校≧R＜3.0）、敏感性降低（RR 3.1—5.0）、低水平抗性（RR 5.1—10.0）、中水平抗性（RR 10.1—40.0）、高水平抗性（RR 40.1—160.0）和極高水平抗性（RR＞160.0）[19]。利用2-ΔΔCt方法[20]計算相對表達量，數(shù)據(jù)用Excel 2003進行分析。利用SPSS 18.0軟件（One-way ANOVA）進行數(shù)據(jù)的差異顯著性分析（Tukey檢驗，＜0.05），以及對抗性水平和基因表達量進行相關性分析。

表2 馬鈴薯甲蟲實時熒光定量PCR引物

2 結果

2.1 新疆不同馬鈴薯甲蟲種群對噻蟲嗪的抗性

對于4齡幼蟲，2018年測試種群中，與敏感種群QPQL-S相比，YN1、TC和URMQ1種群對噻蟲嗪均表現(xiàn)敏感（RR分別為1.88、2.14和2.42倍），而QPQL1種群為敏感性降低（RR為4.23倍）；2019年測試種群中，URMQ2種群對噻蟲嗪的LD50最低（5.52 ng/頭），以此作為相對敏感種群，URMQ3、URMQ4、JMS、QPQL2、YN3種群對噻蟲嗪均保持敏感（RR＜3倍），僅YN2種群敏感性降低（RR為3.71倍）（表3）。

表3 新疆不同馬鈴薯甲蟲種群4齡幼蟲和成蟲對噻蟲嗪的敏感性

在成蟲中，與QPQL-S相比，2018年測試種群均對噻蟲嗪產生抗性，其中YN1和URMQ1種群為低水平抗性，而TC和QPQL1種群已達中等水平抗性，RR分別為5.99、8.81、10.86和20.33倍；2019年所有種群中，URMQ2種群對噻蟲嗪的LD50最低，為24.69 ng/頭，與之相比，URMQ3和URMQ4種群對噻蟲嗪保持敏感（RR＜3倍），QPQL2、YN3種群為敏感性降低，RR分別為3.45和4.50倍，YN2和JMS種群則達到中水平抗性，RR分別為11.82和14.05倍（表3）。

從兩年的抗性監(jiān)測結果可以看出新疆馬鈴薯甲蟲成蟲對噻蟲嗪的敏感性普遍較低，抗性達低至中等水平，而4齡幼蟲對噻蟲嗪普遍敏感。

2.2 噻蟲嗪脅迫下馬鈴薯甲蟲的解毒酶活性

噻蟲嗪可引起3種解毒酶的活性發(fā)生改變。其中P450活性在4個測試種群URMQ2、URMQ3、YN2、JMS處理組的活性均顯著提高，分別為對照的1.76、2.75、1.91和1.66倍；URMQ3種群處理組的GST活性（CDNB和DCNB為底物）活性顯著升高，分別為對照的1.19和2.10倍，而其他種群的GST活性無顯著變化；URMQ2和YN2種群處理組的EST活性顯著增加，分別為對照的1.35和1.91倍，其他種群的EST活性與對照相比差異不顯著（圖1）。

圖中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標準誤，柱上不同字母表示差異顯著（P＜0. 05）。下同

2.3 馬鈴薯甲蟲敏感和抗性種群的轉錄組分析及驗證

2.3.1 轉錄組數(shù)據(jù)組裝 對噻蟲嗪敏感種群UMRQ3和抗性種群JMS成蟲進行轉錄組分析，分別獲得56 872 051和62 249 136個原始序列數(shù)據(jù)以及55 903 706和61 082 076個過濾后的序列數(shù)據(jù)；過濾后的序列長度分別為8.39和9.16 G；堿基錯誤率均為0.03%；Phred數(shù)值＞20的堿基占總堿基的百分比（Q20）分別為97.77%和97.75%；Phred數(shù)值＞30的堿基占總堿基的百分比（Q30）分別為93.28%和93.25%；鳥嘌呤+胞嘧啶（guanine cytosine，GC）含量分別為38.95%和38.68%，表明轉錄組測序質量較高（表4）。

2.3.2 抗藥性相關的差異表達基因 按照解毒機

制進行分類，鑒定到差異表達的P450基因13個，谷胱甘肽-轉移酶基因1個，酯酶基因7個，尿苷二磷酸-葡萄糖基轉移酶基因9個，表皮蛋白基因6個，ABC轉運蛋白基因12個，煙堿型乙酰膽堿受體基因11個（表5）。

表4 敏感和抗性馬鈴薯甲蟲種群成蟲的轉錄組測序結果

表5 抗性種群和相對敏感種群的差異表達基因

log2FC＞1為判斷基因上調的標準，＜0.05即為顯著。下同

Up-regulated transcripts were classified using a log2FC＞1 and significant difference at＜0.05 level. The same as below

抗性種群JMS中表達量上調的基因見表6，其中，顯著上調的P450基因有2個（111509985、111511395）、ABC轉運蛋白基因3個（有2個基因為新預測的基因，NCBI未見相關序列，由轉錄組測序公司編號）、尿苷二磷酸-葡萄糖基轉移酶基因1個，顯著上調的基因用加粗字體表示。

2.3.3 抗性和敏感種群P450差異表達基因的驗證 DEG測序文庫結果顯示，抗性種群JMS的和基因表達量顯著上調（＜0.05），分別為相對敏感種群的13.45和4.44倍，在抗性種群中的表達量為相對敏感種群的3.60倍，但差異不顯著。qRT-PCR檢測結果顯示這3個P450基因和在JMS種群中的表達量顯著上調（＜0.05），分別為相對敏感種群URMQ3的5.03、5.32和8.01倍（圖2）。qRT-PCR檢測結果與DEG測序文庫顯示的結果基本一致。

2.4 新疆不同馬鈴薯甲蟲種群P450基因的表達水平

2018年4齡幼蟲中，與QPQL-S相比，和在QPQL1和YN1種群、在TC種群的表達量均顯著增加，表達量分別為QPQL-S的1.90、1.58、1.53、1.44和1.61倍（圖3-A）；2019年4齡幼蟲中，與相對敏感種群URMQ2相比，YN3種群中的表達量最高，顯著增加為URMQ2的6.74和4.15倍；JMS種群以及QPQL2的的表達量在所有種群中最高，顯著上調，表達量分別是URMQ2的5.35、21.95、3.51和3.11倍。此外，其他種群的其他基因表達量無顯著變化（圖3-B）。

表6 抗性種群中表達量上調的基因

圖2 qRT-PCR技術驗證3個P450基因的表達

2018年成蟲中，、和分別在QPQL1、URMQ1種群中顯著上調，表達量分別為QPQL-S的1.53、1.50和2.22倍，而和在TC種群中的表達量均顯著降低，表達量是QPQL-S的49.45%和52.55%（圖4-A）；2019年成蟲中，與相對敏感種群URMQ2相比，YN2種群、的表達最高且顯著增加，表達量分別為URMQ2的5.56、4.03倍，的表達量在JMS中最高，顯著高于URMQ2（6.6倍），其次是QPQL2，其他4個種群的表達量較低；在YN3的表達量最高，顯著上調，表達量是URMQ2的7.49倍，其次是URMQ4和YN2種群，JMS、QPQL2和URMQ3種群的表達量較低；的表達量在各種群中無顯著變化（圖4-B）。

2.5 噻蟲嗪脅迫下馬鈴薯甲蟲P450基因的表達分析

將2019年馬鈴薯甲蟲相對敏感種群URMQ2的4齡幼蟲和成蟲經(jīng)噻蟲嗪LD50處理72 h，利用qRT-PCR測定其P450基因的表達變化，結果如圖5所示。4齡幼蟲中，以未處理同日齡的試蟲為對照，處理組的表達量顯著上升，分別為對照的5.08、4.25、2.38和2.79倍；而成蟲處理組顯著上調表達量分別為對照的1.80和1.68倍，顯著下調?？梢钥闯?，經(jīng)噻蟲嗪LD50處理均可誘導4齡幼蟲和成蟲表達量顯著增加，在4齡幼蟲和成蟲的表達變化則相反，而的表達量均無顯著變化。

圖3 馬鈴薯甲蟲田間種群4齡幼蟲P450基因的相對表達量（A：2018；B：2019）

圖4 馬鈴薯甲蟲田間種群成蟲P450基因的相對表達量（A：2018；B：2019）

L4：4齡幼蟲4th instar larva；A：成蟲 Adult；TMX：噻蟲嗪thiamethoxam

2.6 新疆馬鈴薯甲蟲對噻蟲嗪的抗性水平與P450基因表達量的相關性分析

利用SPSS分析2018年和2019年新疆馬鈴薯甲蟲不同種群對噻蟲嗪的抗性水平與上述P450基因表達量之間的相關性，結果如表7所示，馬鈴薯甲蟲成蟲對噻蟲嗪的抗性水平與表達量之間的相關系數(shù)（）為0.810（=0.027），二者之間為高度顯著正相關。

表7 新疆馬鈴薯甲蟲對噻蟲嗪的抗性水平與P450基因表達量的相關性分析

3 討論

馬鈴薯甲蟲對殺蟲劑容易產生抗性，對于一種新的殺蟲劑，往往在使用2—4年就產生明顯的抗藥性[2]。噻蟲嗪是新疆地區(qū)防治馬鈴薯甲蟲的主推藥劑之一，隨著使用周期的累積，其抗性發(fā)展不可避免。2009、2010年的調查發(fā)現(xiàn)新疆馬鈴薯甲蟲4齡幼蟲對噻蟲嗪普遍敏感，僅2010年特克斯（TKS）種群產生8.03倍的低水平抗性[14]；同時馬鈴薯甲蟲成蟲的抗性監(jiān)測顯示2009年昌吉（CJ）種群對噻蟲嗪具有5.22倍的低水平抗性，2010年CJ、QPQL、TC和URMQ1種群對噻蟲嗪發(fā)展了低到中等水平抗性（7.48、5.98、10.15和10.39倍）[9]。本研究抗性監(jiān)測表明2018年YN1、URMQ1、TC和QPQL1以及2019年YN2、JMS田間種群成蟲對噻蟲嗪產生了5.99—20.33倍的低至中水平抗性。其中2019年YN2種群對噻蟲嗪的抗性水平比2018年YN1種群增加了1倍。對上述采集地用藥情況的調查發(fā)現(xiàn)，察布查爾、伊寧地區(qū)近3年均施用噻蟲嗪、吡蟲啉等藥劑，吉木薩爾縣近10年持續(xù)使用阿立卡（12.6%噻蟲嗪·9.4%高效氯氟氰菊酯）防治馬鈴薯甲蟲?？梢婇L期、頻繁的用藥導致當?shù)胤N群對新煙堿類殺蟲劑的敏感性明顯下降。另外，還可以發(fā)現(xiàn)本文的監(jiān)測結果與劉萍等[9]、盧偉平等[14]的調查結果具有相似的趨勢，即成蟲對噻蟲嗪的敏感性較低，而幼蟲的敏感性較高，且隨著時間發(fā)展田間最高抗性水平有所上升。雖然新疆馬鈴薯甲蟲對噻蟲嗪的抗性還處于低至中等水平，但其發(fā)展不容忽視，注意合理輪換使用不同作用機制的藥劑，盡量避免在高齡期或成蟲期用藥，同時開展持續(xù)的抗性監(jiān)測及抗性機制研究是馬鈴薯甲蟲抗性治理的重要前提。

細胞色素P450單加氧酶是馬鈴薯甲蟲代謝吡蟲啉的主要酶系。Zhao等[6]研究發(fā)現(xiàn)，胡椒基丁醚在紐約州長島馬鈴薯甲蟲成蟲和幼蟲中對吡蟲啉都有明顯增效作用；Mota-Sanchez等[7,21]在其他種群的增效研究也獲得同樣的結果。在本研究中，噻蟲嗪LD50處理72 h都可引起敏感和抗性馬鈴薯甲蟲4個種群的P450活性顯著升高，另外URMQ2和YN2種群的EST及URMQ3種群的GST活性也顯著增加，這表明P450可能在馬鈴薯甲蟲對噻蟲嗪的解毒代謝中起主要作用。類似的研究發(fā)現(xiàn)褐飛虱（）噻蟲嗪抗性種群的細胞色素P450活性也顯著高于室內敏感品系（2.13倍）[22]。

近年來隨著分子生物學及生物信息學的快速發(fā)展，有關昆蟲對新煙堿類殺蟲劑抗性的解毒代謝分子機制也取得了一系列進展[10-13]。為了篩查新疆馬鈴薯甲蟲對噻蟲嗪抗性相關的解毒酶基因，本研究就馬鈴薯甲蟲噻蟲嗪抗性和敏感成蟲進行轉錄組分析，結果發(fā)現(xiàn)與抗性相關的顯著差異表達的上調解毒酶基因有P450基因2個、尿苷二磷酸-葡萄糖基轉移酶基因1個、ABC轉運蛋白基因3個，但未見有顯著差異表達的酯酶和谷胱甘肽-轉移酶基因。Clements等[23]將吡蟲啉處理后的馬鈴薯甲蟲與對照進行轉錄組測序，按照解毒機制進行分類，發(fā)現(xiàn)吡蟲啉可誘導4個P450基因、1個尿苷二磷酸-葡萄糖基轉移酶基因以及1個羧酸酯酶基因上調?？梢姴煌尘暗姆N群其解毒酶基因的表達量變化不同。本文利用qRT-PCR驗證轉錄組數(shù)據(jù)中3個上調的P450基因和在抗性種群的表達量，結果與DEG數(shù)據(jù)基本一致，另外結合Zhu等[18]在美國長島馬鈴薯甲蟲吡蟲啉抗性種群中發(fā)現(xiàn)的過表達基因和，本研究進一步對上述6個P450基因在新疆馬鈴薯甲蟲不同田間種群的表達進行了比較分析，結果表明，4齡幼蟲中，對噻蟲嗪敏感性降低的QPQL1種群中、的表達量顯著增加；成蟲中，對噻蟲嗪低水平抗性的URMQ1種群中高表達，和和以及分別在QPQL1、YN2以及JMS種群中顯著上調，這些種群對噻蟲嗪達到中水平抗性。綜上，可以看出和在敏感性降低的幼蟲和抗性成蟲種群中表達量均顯著提高，除以外其他5個基因在抗性成蟲中都顯著上調，表明這些基因可能參與了新疆馬鈴薯甲蟲對噻蟲嗪抗性的產生。

吡蟲啉對昆蟲P450基因表達具有誘導作用。Zhu等[18]研究顯示對吡蟲啉約30倍抗性的美國長島馬鈴薯甲蟲種群中有21個P450基因可被吡蟲啉誘導上調表達；吡蟲啉處理蜜蜂可引起6個P450基因的表達量增加[24]；大草蛉（）幼蟲經(jīng)吡蟲啉誘導4 h其體內P450基因表達量略微上調，16 h后轉錄水平達最高值，隨后逐漸下降[25]。本文qRT-PCR結果表明，經(jīng)噻蟲嗪LD50處理72 h，URMQ2種群4齡幼蟲和成蟲的和均顯著上調表達。ZHANG等研究發(fā)現(xiàn)褐飛虱中13個可被吡蟲啉誘導的P450基因在抗性種群中卻無差異表達，而和不能被吡蟲啉誘導，但在抗性種群中表達上調[26]，這表明可被藥劑誘導的基因與抗性相關的過表達基因并非完全一致。因此，綜合本研究中誘導試驗及不同田間種群P450基因的表達分析結果，在噻蟲嗪抗性種群中顯著上調同時又能被噻蟲嗪誘導的基因即為和。另外相關性分析顯示成蟲對噻蟲嗪的抗性與表達量呈顯著正相關。而真正參與馬鈴薯甲蟲對噻蟲嗪抗性形成的基因有待進一步的功能驗證。

4 結論

通過抗性監(jiān)測發(fā)現(xiàn)2018年YN1、URMQ1、TC和QPQL1以及2019年YN2和JMS種群成蟲對噻蟲嗪產生了低至中水平抗性。噻蟲嗪處理可引起測試種群P450活性的升高，表明其在馬鈴薯甲蟲對噻蟲嗪抗性產生中可能起到重要作用?？剐院兔舾蟹N群的轉錄組分析以及qRT-PCR結果顯示包括和的5個P450基因在抗性種群中顯著上調，同時噻蟲嗪又可誘導這兩個基因在4齡幼蟲和成蟲中的表達。結合相關性分析推測與馬鈴薯甲蟲對噻蟲嗪的抗性形成密切相關，但不排除其他P450基因以及其他解毒酶基因的作用。

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Resistance monitoring to thiamethoxam and expression analysis of cytochrome P450 genes infrom Xinjiang

Shixin1, Li sha1, Wang Zhimin1, Fu Kaiyun2, Fu Wenjun3, Jiang Weihua1

1College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095;2Research Institute of Plant Protection, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Intergraded Management of Harmful Crop Vermin of China North-western Oasis, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Urumqi 830091;3Agricultural Technology Extension Master Station of Yili Prefecture, Yining 835000, Xinjiang

【】Colorado potato beetle (CPB),, is a significant agricultural pest in potato worldwide. The objective of the study is to identify the main cytochrome P450genes involved in metabolic regulation of neonicotinoid insecticide thiamethoxam in.【】In this study, the resistance level to thiamethoxam was assayed using topical applications in 11 field populations offrom Qapqal (QPQL), Yining (YN), Tacheng (TC), Urumqi (URMQ), Jimusar (JMS) of Xinjiang in 2018 and 2019. The activities of three detoxifying enzymes including cytochrome P450 monooxygenase (P450), glutathione-transferase (GST) and esterase (EST), exposed to LD50of thiamethoxam for 72 h were analyzed byenzyme activity assay. Thedifferentially expressed genes (DEGs) ofadults susceptible and resistant to thiamethoxam were detected by Illumina HiSeqTM2500 sequencing platform. The expression verification of three P450 genes and the expression change of six P450 genes in different populations and the beetles exposed to LD50of thiamethoxam for 72 h were performed by real-time quantitative PCR (qRT-PCR).【】Resistance monitoring results showed that the adults of YN1, URMQ1, TC and QPQL1 populations in 2018 and YN2 and JMS in 2019 developed low to moderate level resistance to thiamethoxam with resistance ratio (RR) ranging from 5.99 to 20.33 times. The P450 activities of adults from two sensitive populations URMQ2 and URMQ3 and two resistant populations YN2 and JMS after treatment with thiamethoxam LD50for 72 h were significantly increased to 1.76, 2.75, 1.91 and 1.66 times as high as the control, respectively. In addition, the GST (CDNB and DCNB as substrates) of URMQ3 population and the EST activities of URMQ2 and YN2 populations were obviously increased to 1.19, 2.10 and 1.35, 1.91 times of the control, respectively. Based on Illumina RNA sequencing, the raw reads (56 872 051 and 62 249 136), clean reads (55 903 706 and 61 082 076), clean bases (8.39 and 9.16 G) and error of basic group (0.03%) were obtained for the thiamethoxam-susceptible and -resistant samples of adult populations, respectively. Thirteen differentially expressed P450 genes were identified in the thiamethoxam-resistant sample, of which two genes were significantly up-regulated. The expression levels of three P450 genes, namely,andby RNA sequencing were validated by qRT-PCR analysis. Furthermore,,,,andwere up-regulated in the thiamethoxam-resistant adults, and the expression of,increased significantly in the 4th instar larvae and adults under thiamethoxam treatment. It was found by correlation analysis that there was a significant positive correlation between resistance level to thiamethoxam andexpression of adults. 【】may be involved in the production of thiamethoxam resistance in, and the role of other genes cannot be ruled out.

; thiamethoxam; resistance; cytochrome P450; gene expression

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.007

2020-10-30；

2020-11-21

國家重點研發(fā)計劃（2018YFD0200802）

石鑫，E-mail：907094441@qq.com。通信作者姜衛(wèi)華，E-mail：jwh@njau.edu.cn

（責任編輯 岳梅）