馬曉雨，劉煥臻，孫國(guó)語(yǔ)，易嘉欣，李開(kāi)隆

（東北林業(yè)大學(xué) 林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040）

楊樹(shù)是楊柳科Salicaceae 楊屬Populus高大喬木、具有生長(zhǎng)快、分布廣、品種多、易雜交、易改良、易無(wú)性繁殖等優(yōu)良特點(diǎn)，在工業(yè)用材、環(huán)境綠化、生態(tài)防護(hù)和科學(xué)研究等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。在楊樹(shù)細(xì)胞遺傳學(xué)研究中，染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)是最穩(wěn)定的細(xì)胞學(xué)特征之一[2]，染色體的觀察也是細(xì)胞遺傳學(xué)主要的研究?jī)?nèi)容。染色體制片技術(shù)是觀察染色體的基礎(chǔ)技術(shù)，完善的染色體制片方案可以為楊樹(shù)的倍性鑒定、種間關(guān)系和系統(tǒng)分類(lèi)等提供良好的技術(shù)支撐。

早在20世紀(jì)20年代，Blackburn 研究發(fā)現(xiàn)歐洲黑楊P.nigra染色體數(shù)目為2n=38。Kesara 等對(duì)兩個(gè)地區(qū)歐洲山楊P.tremula染色體數(shù)目的研究結(jié)果也為38 條[3]。1978年我國(guó)學(xué)者對(duì)小青楊P.pseudo-simonii根尖染色體的制片技術(shù)進(jìn)行了初步的研究，優(yōu)化了楊樹(shù)染色體根尖壓片技術(shù)[4]。2004年陳成彬等對(duì)三倍體毛白楊P.tomentosa和三倍體黑楊核型進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)不同品種楊樹(shù)核型有顯著差異[5]。2015年尹麗莎等對(duì)滇楊P.yunnanensis的染色體制片技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化[6]。近年來(lái)，已有一些染色體制片技術(shù)進(jìn)行楊樹(shù)染色體行為觀察和倍性鑒定的研究，但由于楊樹(shù)屬于小染色體植物，且染色體數(shù)目較多，為楊樹(shù)染色體制片增加難度，從而導(dǎo)致制片效果欠佳；并且不同楊樹(shù)品種的最佳染色體制片方案也有所差異：毛白楊雜種三倍體莖尖采用V(濃HCL)∶V(乙醇)=1∶1 的混合液解離15 min 染色體制片效果較好[7]；山海關(guān)楊P.deltoides‘Shanhaiguan’×新疆楊P.albavar.pyramida根尖解離采用1 mol/L 的鹽酸60℃下解離10 min 能夠得到用以鑒定其倍性的染色體圖片[8]。目前關(guān)于美洲黑楊×大青楊雜交品種染色體制片優(yōu)化的研究未見(jiàn)報(bào)道，且缺乏從染色體制片到核型分析的系統(tǒng)研究。本研究從根尖長(zhǎng)度、預(yù)處理方法和解離方式3 個(gè)染色體制片主要影響因素分析比較，優(yōu)化美洲黑楊P.deltoides×大青楊P.ussuriensis染色體制片技術(shù)，提高染色體制片效果，并進(jìn)行系統(tǒng)的核型分析，為楊樹(shù)系統(tǒng)發(fā)育和遺傳育種等方面提供一定的細(xì)胞學(xué)水平的理論依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為美洲黑楊×大青楊組培苗的根尖。母本美洲黑楊采自遼寧省金城原種場(chǎng)，父本大青楊采自黑龍江省青山種子園。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 根尖培養(yǎng)和取材

嫩葉經(jīng)0.1%氯化汞消毒，剪成1 cm2大小接種于分化培養(yǎng)基（MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA）中，待幼苗生長(zhǎng)高度達(dá)3 cm 時(shí)接種于生根培養(yǎng)基（1/2MS+0.3 mg/L IBA）中，待根生長(zhǎng)分別達(dá)到0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 cm 時(shí)，于9:00—10:00 剪取粗壯嫩根，取其根尖分別置于飽和對(duì)二氯苯溶液中0℃處理1 h，每個(gè)長(zhǎng)度取20 條根尖。

1.2.2 預(yù)處理

預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)根發(fā)育至1.5 cm 時(shí)，其根尖分生區(qū)細(xì)胞分裂最為活躍，采用0.2%秋水仙素、飽和對(duì)二氯苯和兩者1∶1 混合液3 種試劑分別對(duì)發(fā)育至1.5 cm 新生根的根尖進(jìn)行預(yù)處理，于0℃下，分別處理1、2、3 h，每種預(yù)處理取20 條根尖。

1.2.3 固定

預(yù)處理后的根尖用蒸餾水沖洗3 次，轉(zhuǎn)入現(xiàn)配的卡諾氏固定液（無(wú)水乙醇∶冰乙酸=3∶1）中4℃固定24 h。固定后，蒸餾水洗凈根尖，置于70%乙醇中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 染色體制片

采用1 mol/L 鹽酸酸解法，根據(jù)以往研究顯示，酸解法在60℃或25℃下能夠取得較好解離效果[14,22]。本研究分別在25℃下酸解12、14、16、18 min，60℃下酸解6、8、10、12 min。酸解后蒸餾水沖洗5次，無(wú)菌濾紙吸干根尖表面水分，切取根尖分生區(qū)置于載玻片上，用卡寶品紅染液染色9 min，然后進(jìn)行常規(guī)壓片，并用奧林巴斯（BX43）進(jìn)行鏡檢。

1.2.5 核型分析

40 倍物鏡下，統(tǒng)計(jì)中期分裂細(xì)胞及分散相較好細(xì)胞所占比例；100 倍油鏡下，選取30 個(gè)以上染色體形態(tài)及分散良好分裂相進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。選取5 個(gè)染色體形態(tài)輪廓清晰且無(wú)重疊的細(xì)胞進(jìn)行核型分析。利用Adobe Photoshop 7.0.1 對(duì)染色體進(jìn)行配對(duì)，迅捷CAD 編輯器進(jìn)行染色體長(zhǎng)度測(cè)定，Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總和核型參數(shù)的計(jì)算。按李懋學(xué)等所提核型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析[9]；著絲粒位置命名方式參照Levan 的方法[10]；核型模式圖按喬永剛等提出的方法[11]進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體制片技術(shù)的優(yōu)化

2.1.1 不同根發(fā)育長(zhǎng)度對(duì)制片效果的影響

隨著根長(zhǎng)度的增加，中期細(xì)胞和適合核型分析的中期細(xì)胞所占比例均呈先增加后減少的趨勢(shì)（表1）。在根生長(zhǎng)至1.5 cm 時(shí)，中期細(xì)胞占比和適合核型分析的細(xì)胞占比均達(dá)到最高，分別為1.69%和15.56%；根長(zhǎng)達(dá)0.5 cm 時(shí)，適合核型分析的細(xì)胞占比最低，為6.23%；根長(zhǎng)達(dá)2.5 cm 時(shí)，中期細(xì)胞占比最低，僅為0.68%。結(jié)果表明，在根發(fā)育過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短時(shí)取樣，制片效果均較差，因此，選擇根長(zhǎng)至1.5 cm 時(shí)進(jìn)行取樣，能夠獲得較多中期分裂相，利于核型分析。

表1 不同根長(zhǎng)對(duì)制片效果影響Table 1 Effect of different root length on chromosome preparation

2.1.2 不同預(yù)處理試劑對(duì)制片效果的影響

本研究采用3 種不同試劑0℃下對(duì)根尖進(jìn)行預(yù)處理，對(duì)不同試劑和預(yù)處理時(shí)間下制片效果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表2）。結(jié)果顯示，對(duì)二氯苯飽和水溶液處理效果最好，中期細(xì)胞總占比達(dá)到7.54%，且其中，預(yù)處理2 h 時(shí)染色體制片效果最佳，中期細(xì)胞比例為3.26%，得到的染色體形態(tài)輪廓清晰且分散良好，長(zhǎng)度適宜（圖1E）；其次采用混合液（對(duì)二氯苯飽和水溶液∶0.2%秋水仙素溶液=1∶1）和0.2%秋水仙素溶液進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，得到的中期細(xì)胞總占比相差不多，分別為3.63%和3.43%，且其中，0.2%秋水仙素溶液預(yù)處理1 h 時(shí)，獲得的染色體清晰，分散較好，長(zhǎng)度適宜；相同試劑預(yù)處理下，預(yù)處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)均會(huì)對(duì)染色體形態(tài)產(chǎn)生一定影響，出現(xiàn)輪廓模糊，粘連拖尾等情況（圖1C、F，圖1I）。綜合上述結(jié)果，選擇對(duì)二氯苯飽和水溶液作為預(yù)處理試劑，0℃下預(yù)處理2 h，能夠獲得較多的中期細(xì)胞，且染色體形態(tài)最好，是本研究中的最佳預(yù)處理方案。

圖1 不同預(yù)處理方式對(duì)制片效果的影響Fig.1 Effect of different pretreatment methods on chromosome preparation

表2 不同預(yù)處理方式對(duì)制片效果的影響Table 2 Effect of different pretreatment methods on chromosome preparation

2.1.3 不同解離溫度和時(shí)間對(duì)制片效果的影響

圖2為不同解離溫度和時(shí)間下鏡下染色體制片效果，結(jié)果顯示，不同解離時(shí)間和解離溫度對(duì)染色體制片有顯著影響。60℃下解離6 min 時(shí)，細(xì)胞質(zhì)著色，有細(xì)胞壁殘留，染色體形態(tài)不清晰，且重疊較多不分散（圖2A）；解離8 min 時(shí)，細(xì)胞質(zhì)著色較淺，無(wú)細(xì)胞壁殘留，染色體部分粘連，形態(tài)清晰（圖2B）；解離10 min 時(shí)，幾乎無(wú)雜質(zhì)殘留，對(duì)比度高，染色體形態(tài)清晰，分散良好（圖2C）；解離12 min 時(shí)，染色體分散性好，但由于解離過(guò)度導(dǎo)致細(xì)胞破裂，染色體丟失（圖2D）。綜上，60℃下解離10 min 時(shí)，染色體制片效果最佳。

25℃下解離12 min 時(shí)，細(xì)胞質(zhì)著色，細(xì)胞壁殘留，染色體形態(tài)模糊堆疊（圖2E）；解離14 min 時(shí)，細(xì)胞質(zhì)著色，少量細(xì)胞壁殘留，染色體形態(tài)較清晰，但粘連重疊較多（圖2F）；解離16 min 時(shí)，無(wú)雜質(zhì)，對(duì)比度高，染色體形態(tài)清晰且著色效果好，但分散性一般（圖2G）；解離18 min 時(shí)，對(duì)比度高，染色體形態(tài)清晰著色效果好，分散性良好（圖2H）。綜合不同解離時(shí)間和溫度對(duì)染色體制片影響的結(jié)果，60℃解離10 min 和25℃解離18 min 均能達(dá)到較好染色體制片效果。

圖2 不同解離溫度和時(shí)間對(duì)制片效果的影響Fig.2 Effect of different acidolysis time and temperature on chromosome preparation

2.2 染色體核型分析

通過(guò)對(duì)美洲黑楊×大青楊雜種的染色體核型參數(shù)（表3）和中期分裂相、核型及其模式圖（圖3）分析，結(jié)果表明：核型公式為2n=2x=38=32m+6sm，其中16 對(duì)為中部著絲點(diǎn)染色體，3 對(duì)為近中部著絲點(diǎn)染色體，在第3 對(duì)染色體短臂上附有隨體；染色體相對(duì)長(zhǎng)度在1.35%～4.37% 之間，臂比值在1.05%～1.87% 之間，著絲點(diǎn)指數(shù)在34.88%～48.76% 之間，染色體相對(duì)長(zhǎng)度組成為2n=8L+10M2+10M1+10S；最長(zhǎng)染色體與最短染色體相對(duì)長(zhǎng)度之比為3.24，沒(méi)有臂比值大于2 的染色體，核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)為56.61%，為1B 核型。

圖3 美洲黑楊×大青楊染色體中期分裂相（A）、核型圖（B）及模式圖（C）Fig.3 Metaphase map (A)、karyogra (B) and idiogram (C) of P.deltoides × P.ussuriensis chromosome

表3 美洲黑楊×大青楊雜種染色體核型參數(shù)?Table 3 Parameters of chomosome karyotype of P.deltoides × P.ussuriensis

3 結(jié)論與討論

3.1 討 論

3.1.1 不同根長(zhǎng)度對(duì)制片效果的影響

植物染色體制片是植物細(xì)胞學(xué)的基礎(chǔ)技術(shù)之一，影響染色體制片效果的因素較多，其中取材、預(yù)處理方式和解離條件是較為關(guān)鍵的影響因素[12]。植物根尖分生區(qū)細(xì)胞分裂旺盛、細(xì)胞壁較薄，且根尖易培養(yǎng)、不受外界環(huán)境限制，是最為常用的染色體制片材料，其中根尖長(zhǎng)度對(duì)中期分裂相的數(shù)量有著顯著影響[13]。根尖細(xì)胞分裂活躍性的差異不僅取決于不同的植物根尖特征，也會(huì)因同一植物不同根尖培養(yǎng)方式而有所區(qū)別。構(gòu)樹(shù)Broussonetia papyrifea種子的胚根長(zhǎng)度達(dá)1.0 cm時(shí)，其根尖有絲分裂指數(shù)最高，根過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短得到的分裂相均較少[14]；人參Panax ginseng組培苗誘導(dǎo)根尖長(zhǎng)至2 cm，水培根尖長(zhǎng)至1 cm，種子根尖長(zhǎng)至1.5 cm 時(shí)，中期分裂相較多[15]；小青楊種子胚根伸長(zhǎng)至0.5 cm 時(shí)取其根尖，能夠得到較好制片效果[4]。正常土壤中生長(zhǎng)的根在水培條件下，不易產(chǎn)生根冠，根尖分生區(qū)細(xì)胞得不到保護(hù)，在試驗(yàn)處理過(guò)程中易受損或丟失。本研究對(duì)組培苗新生根進(jìn)行取材，根尖生長(zhǎng)環(huán)境更加穩(wěn)定，得到的根尖結(jié)構(gòu)完整。取材時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨根長(zhǎng)度的增加，根尖逐漸變細(xì)，根長(zhǎng)為0.5 cm 時(shí)，根尖形態(tài)短粗，難以截取分生區(qū)部分；根長(zhǎng)達(dá)2.5 cm 時(shí)，根尖形態(tài)細(xì)長(zhǎng)，根尖分生區(qū)，處理時(shí)易折斷，導(dǎo)致制片效果不佳；根長(zhǎng)度1.5 cm 時(shí)，根尖粗細(xì)均勻，長(zhǎng)度適宜，此時(shí)取樣得到的中期分裂相細(xì)胞最多，染色體制片效果最好，這一結(jié)果與已有滇楊[16]和金盞菊[17]的相關(guān)研究結(jié)果一致。

3.1.2 不同預(yù)處理試劑對(duì)制片效果的影響

預(yù)處理方式是決定染色體制片質(zhì)量的關(guān)鍵因素，該過(guò)程目的是破壞紡錘體的形成，阻止細(xì)胞繼續(xù)分裂而使其停在中期，增加中期分裂相的出現(xiàn)概率[13]。目前常用的預(yù)處理試劑主要有8-羥基喹啉、秋水仙素、飽和對(duì)二氯苯水溶液。預(yù)處理試劑和預(yù)處理時(shí)間因試驗(yàn)材料不同而有所差異。山楊P.davidiana經(jīng)0.002 mol/L 的8-羥基喹啉處理4～5 h 能夠獲得較好制片效果[18]；桉樹(shù)Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis經(jīng)過(guò)0.2%秋水仙素處理2 h 取得的制片效果最好[19]；滇楊在0℃下用對(duì)二氯苯飽和水溶液處理1 h 獲得的染色體圖像清晰，著色最好[6]。染色體大小是固定因素，它決定了預(yù)處理時(shí)間的長(zhǎng)短，由于楊樹(shù)染色體較小，預(yù)處理時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，一般1～2 h為宜，同時(shí)，預(yù)處理時(shí)間也會(huì)因?yàn)椴煌参锲贩N的耐藥性而有所差異[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，采用對(duì)二氯苯飽和水溶液0℃下處理2 h，獲得中期分裂相最多，染色體制片效果最好，這一結(jié)果與前人對(duì)滇楊的最佳預(yù)處理溫度和試劑一致，但最佳處理時(shí)間不同?？赡苡捎诒狙芯克妹乐藓跅睢链笄鄺畹挠H本均為適宜北方生長(zhǎng)環(huán)境的楊樹(shù)品種，而滇楊雖與大青楊同為青楊派，但主要分布于川、黔、滇等南方地區(qū)，可見(jiàn)生長(zhǎng)環(huán)境與品種的差異是決定最佳預(yù)處理方式的關(guān)鍵因素，本研究也為黑楊派和青楊派及北方楊樹(shù)品種染色體制片和觀察提供了具有一定針對(duì)性的技術(shù)參考。

3.1.3 不同解離溫度和時(shí)間對(duì)制片效果的影響

常用解離方法有酶解法和酸解法，其目的是軟化和分解細(xì)胞壁，便于壓片和染色體觀察[21]。解離時(shí)間的掌控是染色體制片中十分重要的一步，時(shí)間過(guò)短，細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)殘留，染色體不易分散，染色效果不佳；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞破裂，染色體受損或丟失。不同材料最適解離方法也所不同，張俊等[22]對(duì)萱草屬Hemerocallis植物根尖染色體制片技術(shù)進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，同一解離液和解離溫度下，不同萱草屬的植物其解離時(shí)間也有一定差異，總結(jié)得出1 mol/L 的HCl 在60℃下解離7～8 min為宜；響葉楊P.adenopoda在鹽酸∶乙醇=1∶1 的解離液中常溫下解離25 min 可以獲得較好的染色體制片效果[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，美洲黑楊×大青楊雜種的根尖采用1 mol/L 的HCl 在60℃下解離10 min 和25℃下解離18 min 均能獲得清晰且分散性好的染色體圖像，該結(jié)果與構(gòu)樹(shù)[14]、橡膠草[24]等研究結(jié)果一致。

3.1.4 染色體核型分析

染色體核型分析是細(xì)胞遺傳學(xué)的基本技術(shù)之一[25]，包括染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)和染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)分析，其在植物起源、分類(lèi)和演化研究中占有重要位置。本研究首次對(duì)美洲黑楊×大青楊進(jìn)行核型分析，得出其染色體數(shù)目38 條，染色體基數(shù)為19，為二倍體，該結(jié)論與已有的關(guān)于楊樹(shù)染色體的研究結(jié)果相吻合[26]。染色體核型為2n=2x=38=32m+6sm，這與已研究的楊樹(shù)其他品種核型有一定差異，例如河北楊P.hopeinsis染色體核型為2n=26m+6sm+6st[27]；小青楊染色體核型為2n=27m+6sm+4st+1t[28]，這種差異可能與楊樹(shù)品種、生境和染色體制片方法的不同有關(guān)。也可能因?yàn)榉N間的雜交使染色體核型發(fā)生變異[29]，但本研究結(jié)果顯示美洲黑楊×大青楊的大多數(shù)染色體均為中部著絲點(diǎn)染色體和近中部著絲點(diǎn)染色體，該結(jié)果與前人研究結(jié)果相符。植物的進(jìn)化趨勢(shì)是由對(duì)稱(chēng)向不對(duì)稱(chēng)發(fā)展，說(shuō)明核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)越大，植物的進(jìn)化程度越高，在已有的楊樹(shù)核型報(bào)道中，歐洲山楊、大葉楊P.lasiocarpa、小葉楊P.simonii、箭桿楊P.nigravar.thevestina、胡楊P.euphratica核不對(duì)稱(chēng)系數(shù)分別為65.79%、62.33%、61.36%、58.14%、63.03%[30]。本研究結(jié)果顯示美洲黑楊×大青楊核不對(duì)稱(chēng)系數(shù)為56.61%，在楊樹(shù)品種中屬于核型較對(duì)稱(chēng)的原始類(lèi)型，說(shuō)明其起源相對(duì)較早。本研究對(duì)美洲黑楊×大青楊染色體制片技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)其染色體形態(tài)結(jié)果進(jìn)行了分析，為楊樹(shù)品種間親緣關(guān)系、倍性鑒定、優(yōu)良品種的選育等方面提供了細(xì)胞學(xué)上的技術(shù)支持。以往研究表明雜交可使染色體核型發(fā)生變異，本研究?jī)H對(duì)美洲黑楊×大青楊核型進(jìn)行了分析，與其親本核型間差異還未做進(jìn)一步研究。今后可以對(duì)親本美洲黑楊和大青楊核型進(jìn)行研究并與已有雜種核型進(jìn)行比較分析，為楊樹(shù)雜交后代變異研究提供細(xì)胞學(xué)上的理論依據(jù)。

3.2 結(jié) 論

優(yōu)化的美洲黑楊×大青楊染色體制片方案為：取1.5 cm 長(zhǎng)根的根尖，用對(duì)二氯苯飽和水溶液在0℃下預(yù)處理2 h，卡諾氏固定液固定24 h 后，在1 mol/L 鹽酸60℃下酸解10 min 或25℃下酸解18 min，最后用卡寶品紅染液染色9 min。核型分析得出：美洲黑楊×大青楊染色體數(shù)目為2n=38，基數(shù)為19，為二倍體，核不對(duì)稱(chēng)系數(shù)為56.61%，核型屬于較原始的對(duì)稱(chēng)類(lèi)型。