李智勇，陳玉興，趙自明，張建軍，陳雪婷，盧 泳，3

1 廣東省第二中醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東 廣州 510095；2 廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3 廣州中醫(yī)藥大學(xué)

消腫止痛巴布劑（Xiaozhong ZhitongCataplasm，XZC）方由《證治準(zhǔn)繩》所載“乳香散”加減化裁而來，主要由大黃、黃柏、姜黃、澤蘭等藥物組成，具有活血化瘀、清熱涼血、止痛消腫的功效［1-2］。主要用于治療跌打損傷，瘀血腫痛等急性軟組織損傷。本研究根據(jù)處方中藥物所含功效成分的化學(xué)性質(zhì)和藥理作用，以初步藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為指標(biāo)，優(yōu)選適宜的提取工藝，并對XZC 的制備工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化研究，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物SPF 級SD 大鼠80 只，雌雄各半，體質(zhì)量范圍180～220 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2013-0002，質(zhì)量合格證號：44007200028037。動物實(shí)驗(yàn)環(huán)境：廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院SPF 級動物實(shí)驗(yàn)室［許可證號SYXK（粵）2015-0059］。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物中藥飲片（廣州康圣中藥飲片有限公司，批號：20150801），檢驗(yàn)結(jié)果顯示均符合《中華人民共和國藥典》2015年版一部各項(xiàng)下的規(guī)定。鹽酸小檗堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110713-201212）；雙氯芬酸二乙胺乳膏劑（商品名：扶他林，瑞士諾華有限責(zé)任公司，國藥準(zhǔn)字H19990291，批號：VP0098）；治傷軟膏（浙江普洛康天然藥物有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20027559，批號：150506）；乙腈（默克）為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器DC-NSG-30 型多功能提取濃縮機(jī)組（上海達(dá)程實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；METTLER XS-205DU 型電子分析天平（瑞士）；DHG-9070A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；BT-S-1 型小型試驗(yàn)巴布劑涂布機(jī)（溫州市皓豐機(jī)械有限公司）；BBV-T 型初黏力測試儀；持黏力測試儀（濟(jì)南格瑞特測試儀器有限公司）；-80℃超低溫冰箱；5424 型小型高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；數(shù)顯游標(biāo)卡尺。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品制備 1）XZC樣品1：取全方飲片粉碎成細(xì)粉，加入基質(zhì)，混勻，制成每克含有0.19 g生藥。2）XZC樣品2：取全方飲片加8倍量水，提取3次，每次1 h，濾過，合并濾液，濃縮至相對密度1.20（60℃），加入基質(zhì)，混勻，制成每克含有1.05 g生藥。3）XZC樣品3：取大黃、姜黃粉碎成細(xì)粉，備用；其余飲片加8倍量水，提取3次，每次1 h，濾過，合并濾液，濃縮至相對密度1.20（60℃），加入細(xì)粉和基質(zhì)，混勻，使每克含有0.46 g生藥。4）XZC樣品4：取四分之一的飲片粉碎成細(xì)粉，備用；其余飲片加8倍量水，提取3次，每次1 h，濾過，合并濾液，濃縮至相對密度1.20（60℃），加入細(xì)粉，加入基質(zhì)，混勻，使每克含有0.64 g生藥。

1.4.2 動物處理 所有SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)3天后，隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、扶他林組、治傷軟膏組、XZC 樣品1 組、XZC 樣品2 組、XZC 樣品3組、XZC 樣品4 組，每組10 只。所有大鼠雙側(cè)后肢小腿部剃毛，定位測量各組大鼠右腳腳跖寬度，作為基礎(chǔ)值。除正常對照組外，其余各組均進(jìn)行腳跖局部軟組織挫傷造模，造模時(shí)用輾壓器在腳跖中部連續(xù)輾壓3 次，造成局部軟組織挫傷。除正常對照組、模型對照組外，其余各組大鼠輾壓后立即給予對應(yīng)藥物涂抹，涂抹范圍以瘀斑面積相同，正常對照組、模型對照組大鼠涂抹等量膏體基質(zhì)，連續(xù)涂抹3天。末次給藥2 h后觀察病情評分。

1.4.3 觀察指標(biāo) 軟組織損傷病情程度評分標(biāo)準(zhǔn)［1-2］。1）觸痛：受損組織局部觸痛很明顯計(jì)3分，觸痛明顯計(jì)2 分，觸痛不明顯計(jì)1 分，無觸痛計(jì)0分。2）腫脹：受損組織局部紅腫面積≥0.5 cm2計(jì)3分，紅腫面積≥0.3 cm2，＜0.5 cm2計(jì)2分，紅腫面積≥0.1 cm2，＜0.3 cm2計(jì)1 分，無紅腫計(jì)0 分。3）功能障礙：受損傷肢明顯跛行，行走困難計(jì)3 分，受損傷肢有跛行計(jì)2 分，受損傷肢跛行不明顯計(jì)1分，無跛行計(jì)0分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)兩兩比較，方差齊時(shí)采用SNK 法，方差不齊時(shí)采用Dunnett’s T3法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

與正常對照組比較，模型對照組大鼠右足軟組織損傷病情程度評分在輾壓后1、2、3天顯著增高。與模型對照組比較，給藥1天后扶他林組，治傷軟膏組，XZC樣品1、2、3、4組大鼠右足軟組織受損病情程度評分降低（P＜0.05）；連續(xù)給藥2、3天后，扶他林組，治傷軟膏組，XZC樣品1、3、4組大鼠右足軟組織受損病情程度評分明顯降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠軟組織損傷病情程度評分比較（）

表1 各組大鼠軟組織損傷病情程度評分比較（）

注：與正常對照組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01；與模型對照組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

3 巴布劑配置工藝參數(shù)考察

由“2.1”項(xiàng)下結(jié)果可知，XZC 樣品1 和4 的消腫止痛效果相對較好，結(jié)合臨床用法和載藥量需求，確定樣品4 的制備工藝為基本工藝：處方四分之一的飲片粉碎成細(xì)粉，過100 目篩，備用；其余飲片加水提取的工藝，進(jìn)一步對其巴布劑的配置工藝參數(shù)進(jìn)行研究。

3.1 粉碎工藝條件的確立分別稱取上述藥材飲片各3 份，每份300 g，置粉碎機(jī)中粉碎成細(xì)粉，取能通過六號篩的粉末，稱取質(zhì)量，計(jì)算細(xì)粉得率。結(jié)果表明，各藥材粉碎后得粉率都在93%以上，符合要求，說明藥材的粉碎工藝可行。

3.2 水提取工藝研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以干膏得率和黃柏的有效成分之一小檗堿濃度為評價(jià)指標(biāo)，對加水量、提取時(shí)間和提取次數(shù)等因素進(jìn)行優(yōu)選，優(yōu)化提取工藝并進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。

3.2.1 樣品制備 對照處方比例稱取大黃等飲片共9 份，每份310 g，按照表2 的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)安排進(jìn)行試驗(yàn)，濾過，合并濾液，濃縮并轉(zhuǎn)移至500 mL，定容，搖勻，分別測定干膏得率和小檗堿含量。

3.2.2 干膏得率的測定 精密吸取各試驗(yàn)的樣品溶液20 mL，置已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，按《中華人民共和國藥典》2015 年版四部通則2201浸出物測定法［3］202測定，計(jì)算干膏得率。

3.2.3 小檗堿的含量測定［4］

3.2.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.50 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（40∶60）（每100 mL 加十二烷基硫酸鈉0.4 g）；波長：345 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃。

3.2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇使溶解，制成每1 mL含鹽酸小檗堿對照品248 μg的對照品儲備溶液。

3.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取上述鹽酸小檗堿對照品儲備溶液0.5，1，2，3，4 mL 置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別制成每毫升含有鹽酸小檗堿12.4，24.8，49.6，74.4，99.2 μg 的對照品溶液。分別吸取10 μL 注入液相色譜儀，測定，記錄色譜峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=41.114X-66.161，相關(guān)系數(shù)r=0.999 85。表明鹽酸小檗堿在濃度范圍12.4～99.2 μg/mL線性關(guān)系良好。

3.2.3.4 供試品溶液的制備 精密吸取各試驗(yàn)樣品溶液1 mL，置50 mL 量瓶中，加甲醇45 mL，搖勻，超聲處理30 min（功率250 W，頻率40 kHz），取出，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液2 mL，置10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.2.3.5 專屬性考察 按處方比例稱取除黃柏藥材外的飲片共260 g，加10倍量水，煎煮2次，每次1 h，常壓濃縮至500 mL，按供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。吸取上述供試品溶液、對照品溶液和陰性對照溶液各10 μL 注入液相色譜儀，照上述色譜條件測試，結(jié)果供試品色譜在與對照品色譜相應(yīng)的位置上有相同色譜峰，陰性對照溶液色譜在相應(yīng)位置無吸收，說明陰性無干擾，該法專屬性良好。

3.2.3.6 測定法 吸取上述對照品溶液、供試品溶液各10 μL，照上述色譜條件測定，計(jì)算小檗堿濃度，結(jié)果見表2。

3.2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)選 采取L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取加水倍數(shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)作為考察因素，各取3 個水平進(jìn)行試驗(yàn)。其中小檗堿是為君藥黃柏有效成分之一，含量測定方法成熟，擬定小檗堿權(quán)重系數(shù)0.6，干膏得率權(quán)重系數(shù)0.4，以二者的綜合評分［5-6］作為評價(jià)指標(biāo)，并利用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)，篩選提取工藝參數(shù)。由直觀分析可知，影響提取效果的因素順序?yàn)椋禾崛〈螖?shù)（A）＞加水倍量（B）＞提取時(shí)間（C），由此得出的最佳工藝組合為A3B3C3。由綜合評分結(jié)果可知，得分最高工藝組合為A3B3C2。方差分析結(jié)果顯示提取次數(shù)（A）對水提工藝具有顯著性影響，而加水倍量（B）和提取時(shí)間（C）無顯著影響。綜合考慮到降低生產(chǎn)成本，縮短生產(chǎn)周期等綜合因素，選擇A3B1C1為優(yōu)選工藝，即提取3 次，每次加水量為6 倍，提取時(shí)間為1 h。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 水提正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

3.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按處方比例稱取藥材3 份，每份620 g，照優(yōu)化工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，濾過，合并濾液，濃縮，定容至1000 mL。分別測定干膏得率和小檗堿濃度，計(jì)算綜合評分。由表4 可知，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)優(yōu)選結(jié)果基本吻合，說明擬定提取工藝條件基本合理、穩(wěn)定。見表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3.3 濃縮工藝的考察以鹽酸小檗堿保留率為考核指標(biāo)，對比常壓濃縮和減壓濃縮工藝。稱取提取液（鹽酸小檗堿含量為0.3744 mg/g）2 份，每份36.40 kg，分別采用常壓濃縮和減壓濃縮（濃縮條件：80℃，真空度-0.06 MPa）進(jìn)行濃縮，濃縮至約750 g，稱定質(zhì)量，分別測定相對密度（60℃）和鹽酸小檗堿的含量，計(jì)算鹽酸小檗堿保留率。結(jié)果顯示，減壓濃縮工藝的鹽酸小檗堿保留率略高于常壓濃縮工藝，因此選擇減壓濃縮（80℃，-0.06 MPa）。見表5。

表5 濃縮工藝考察結(jié)果

3.4 XZC的制備工藝研究

3.4.1 XZC 的制備 將處方量四分之一的大黃、黃柏、澤蘭等飲片粉碎成最細(xì)粉；其余飲片煎煮3次，每次1 h，濾過，合并，濾液濃縮至相對密度為1.20～1.30（60℃），加入藥材細(xì)粉，混勻。再與由甘油、聚丙烯酸鈉、甘羥鋁、高嶺土、酒石酸、純化水等組成的基質(zhì)混勻，涂布，切片，晾干，即得。

3.4.2 質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)及檢測方法

3.4.2.1 初黏力 按照《中華人民共和國藥典》2015 年版四部通則0952 黏附力測定法第一法測定［3］130，每個樣品平行測定5 次，以測得最大值為100 分，并按照（測得值/最大值）×100 計(jì)算初黏力得分。

3.4.2.2 持黏力試驗(yàn) 按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0952黏附力測定法第二法測定［3］131，以50 g 的砝碼試驗(yàn)，記錄試驗(yàn)開始至滑脫的時(shí)間，每個樣品平行測定5 次，以測得最大值為100 分，并按照（測得值/最大值）×100 計(jì)算持黏力得分。

3.4.2.3 外觀評價(jià)評分標(biāo)準(zhǔn) 按照文獻(xiàn)［7］方法分別對基質(zhì)均勻性、表面光澤度、氣泡狀態(tài)等進(jìn)行評價(jià)，并對各項(xiàng)的綜合得分按權(quán)重求和，以最大值為100 分，并按照（測得值/最大值）×100 計(jì)算外觀評價(jià)得分。

3.4.3 基質(zhì)載藥量的優(yōu)選

3.4.3.1 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì) 因素水平選擇根據(jù)文獻(xiàn)以及巴布劑基質(zhì)制備方法［8-13］，固定藥粉為25 g，藥物濃縮液30 g（每克相當(dāng)于2.5 g 飲片），以外觀、初黏力、持黏力等為評價(jià)指標(biāo)，對甘油（37～100 g）、高嶺土（0.17～5 g）、酒石酸（0～0.42 g）、甘羥鋁（0.18～0.60 g）、吐溫80（0.16～1.00 g）、聚丙烯酸鈉（1.7～8.00 g）6種基質(zhì)配方進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)，優(yōu)選最佳配比。

3.4.3.2 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)與結(jié)果 根據(jù)擬定的因素水平方案，按照U22（226）均勻設(shè)計(jì)表［14］安排，制成巴布劑，晾干，照擬定評價(jià)指標(biāo)與檢測方法試驗(yàn)。見表6。

表6 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)與結(jié)果

3.4.3.3 均勻試驗(yàn)結(jié)果與數(shù)理統(tǒng)計(jì)［15］以綜合評分為因變量，各因素為變量，利用DPS 15.10 數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析，得回歸方程：Y=196.6605-124.2771X3-84.6405X4-16.3695X6+0.39082X12+0.0064X22+350.8948X32-35.7531X52+1.9180X62-3.0728X1×X5-0.12767X2×X6+80.6682X4×X5+18.8113X4×X6+1.4985X5×X6。通過對方程的F檢驗(yàn)結(jié)果顯示，各系數(shù)P值均小于0.05，表明該方程的各個系數(shù)均具有顯著性意義。根據(jù)該方程計(jì)算確定的最優(yōu)配方為高嶺土∶甘油∶酒石酸∶甘羥鋁∶吐溫80∶聚丙烯酸鈉質(zhì)量比1.20∶50∶0.10∶0.6∶0.15∶8.4。

3.4.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照優(yōu)選的基質(zhì)配方制備3 批消腫止痛巴布劑，測定其初黏力、持黏力及綜合感官指標(biāo)，計(jì)算綜合評分值。結(jié)果表明，按均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)選結(jié)果制備的XZC 色澤均一，延展性良好，外觀平整光滑，且能滿足黏性要求，綜合評分值與均勻試驗(yàn)結(jié)果基本相符。見表7。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

3.5 中試放大研究根據(jù)擬定工藝進(jìn)行三批中試放大研究，每批投料飲片19.84 kg，結(jié)果成品得率分別為94.3%、93.1%、94.6%，中試產(chǎn)品檢驗(yàn)結(jié)果顯示各工藝參數(shù)穩(wěn)定，說明優(yōu)選的工藝基本合理，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。

4 結(jié)論

在中藥巴布劑（凝膠貼膏）的制備過程中，飲片的粉碎、提取對其制備工藝、藥效具有一定的影響，本研究結(jié)合當(dāng)前臨床的使用情況，設(shè)計(jì)采用不同提取工藝樣品對大鼠急性軟組織損傷作用的影響，優(yōu)選了XZC 的提取工藝路線，并進(jìn)一步采用單因素和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法相結(jié)合的方法對中間品的生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化，明確了XZC 的粉碎、提取、濃縮工藝的參數(shù)。提取工藝路線篩選過程中，在選用消痛止痛巴布劑對急性軟組織損傷大鼠病情程度評估評分的同時(shí)，還選用了對急性軟組織損傷大鼠腳腫脹的影響以及對急性軟組織損傷大鼠腳跖軟組織白細(xì)胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）的影響作為評價(jià)指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果與其基本相同，因此只列了對急性軟組織損傷大鼠病情程度評估評分作為評價(jià)指標(biāo)。

巴布劑的基質(zhì)配方是影響巴布劑制劑成型和保障臨床療效的關(guān)鍵因素，根據(jù)藥物的性質(zhì)和加入形態(tài)，以及基質(zhì)配方組分的理化性質(zhì)，選擇合適的基質(zhì)組分和比例是巴布劑制備的技術(shù)難點(diǎn)和關(guān)鍵［16］。因此在XZC 的制劑成型過程中，采用巴布劑質(zhì)量控制的初黏力、持黏力以及外觀性狀等關(guān)鍵指標(biāo)作為評價(jià)依據(jù)，采用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法進(jìn)行多組分多水平的基質(zhì)配方優(yōu)選，通過對各次試驗(yàn)結(jié)果及基質(zhì)配方組成進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析，采用方程擬合法預(yù)測最優(yōu)的消痛止痛巴布劑基質(zhì)組成配方，進(jìn)一步通過驗(yàn)證試驗(yàn)確立成型工藝的參數(shù)。中試放大研究結(jié)果顯示，本研究確定的XZC 制備工藝基本合理，穩(wěn)定，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，可以適應(yīng)該制劑的生產(chǎn)，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和制劑穩(wěn)定性的考察奠定了基礎(chǔ)。