趙海燕，張鴻婷，郭丹丹，張秀榮

黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150000

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是臨床常見的自身免疫性疾病，以關節(jié)滑膜慢性炎癥、血管翳形成、軟骨及骨組織的破壞為主要特征［1］。近年隨著CD4+T 細胞中輔助性T 細胞（T helper cells，Th）的發(fā)現(xiàn)及對其在RA 中作用研究的不斷深入，輔助性T 細胞17（T helper cell 17，Th17）的促炎作用和調(diào)節(jié)性T 細胞（regulatory T cell，Treg）的抑炎作用以及Th17/Treg的平衡與RA 的密切關系越來越受到研究者的重視，以Th17/Treg 作為靶點治療RA 進一步推動了對其發(fā)病機制的研究步伐，成為現(xiàn)階段研究的一項熱點［2］?，F(xiàn)已證實RA 患者外周血中Treg 細胞數(shù)量減少、功能下降，Th17/Treg 比值升高，且與疾病活動度相關［3］，因此調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡是治療RA 的有效方法。獨活寄生湯源自《備急千金要方》，目前廣泛用于治療關節(jié)疼痛，本研究以Th17/Treg 平衡為靶點，觀察獨活寄生湯對中、重度RA的臨床療效并探索其作用機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇2018年11月至2019年6月在黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院風濕科門診就診的RA患者50例，按照隨機數(shù)字分組法分為觀察組和對照組，每組25 例，研究過程中每組失訪1例。觀察組中男6例，女18例；平均年齡（53.17±10.11）歲；平均病程（29.76±11.49）個月。對照組中男5 例，女19 例；平均年齡（52.87±10.07）歲；平均病程（30.07±11.10）個月。兩組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 納入標準納入：1）符合2010 年美國風濕病學會（American college rheumatology，ACR）和歐洲抗風濕病聯(lián)盟（European league against rheumatism，EULAR）的RA診斷標準［4］且參照《中藥新藥臨床研究指導原則（試行）》［5］辨證為肝腎不足寒濕痹阻型者；2）年齡18～65 歲者；3）符合活動期RA 診斷標準，且病情評價（DAS28 評分）［6］＞3.2 者；4）本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，符合知情同意原則且簽署知情同意書者。

1.3 排除標準排除：1）合并其他風濕病者，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、嚴重膝骨關節(jié)炎；2）合并嚴重心腦血管疾病，造血系統(tǒng)、內(nèi)分泌等嚴重原發(fā)性疾病，精神病者；3）肝腎功能異常者；4）對試驗藥物（包括基礎用藥、合并用藥）過敏，或過敏體質(zhì)（對2 種及以上藥物過敏）者；5）妊娠和準備妊娠的婦女、哺乳期婦女；6）合并各種急慢性傳染性疾病者；7）4 周內(nèi)使用過糖皮質(zhì)激素或接受生物制劑治療者。

1.4 治療方法1）對照組根據(jù)病情規(guī)范應用西醫(yī)抗風濕藥物，包括非甾體抗炎藥和免疫抑制劑。2）觀察組在西醫(yī)規(guī)范治療基礎上服用獨活寄生湯，藥物組成：獨活15 g，桑寄生25 g，秦艽15 g，防風15 g，細辛5 g，生地黃15 g，當歸15 g，川芎15 g，白芍20 g，懷牛膝20 g，肉桂10 g，茯苓15 g，杜仲25 g，黨參10 g，甘草10 g。水煎服，每日1劑，水煎300 mL，分早晚兩次溫服，每次150 mL。兩組療程均為24周。

1.5 觀察指標

1.5.1 療效指標 記錄治療前后關節(jié)壓痛數(shù)（trajectory chart，TJC）、關節(jié)腫脹數(shù)（swollen joint counts，SJC）、晨僵時間、中醫(yī)證候積分、雙手平均握力、視覺模擬評分（visual analogue score，VAS）。

1.5.2 實驗室指標 治療前后采集患者外周血：1）采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測白細胞介素17（interleukin-17，IL-17）、白細胞介素10（interleukin-10，IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）水平（試劑盒購自中國的萬類生物公司），嚴格按照試劑盒說明書操作，酶標儀450 nm讀取吸光值，按曲線方程計算各樣本濃度值。2）采用流式細胞儀測定Th17、Treg 細胞比例：讀取CD4+、IL-17 細胞在CD4+T 細胞中的百分比及CD4+、CD25+、Foxp3+、Treg 細胞在CD4+T 細胞中的百分比，并計算Th17/Treg 比值（試劑盒購自美國的Thermo 公司及中國的索萊寶公司）。3）采用免疫印跡法測定叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子P3（forkhead transcription facter 3，p-Foxp3）及其磷酸化翼狀頭轉(zhuǎn)錄因子P3（forkhead transcription facter 3，p-Foxp3）表達水平［材料購自wanleibio 公司（產(chǎn)地中國）及Abgent 公司（產(chǎn)地中國）］，散射比濁法測定血C 反應蛋白（Creactive protein，CRP），魏氏法測定ESR水平。

1.5.3 安全性指標 檢測患者治療前后血、尿常規(guī)，肝腎功能，心電圖。

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 療效指標TJC、SJC、晨僵時間、中醫(yī)證候積分、VAS 評分，兩組治療后均明顯低于治療前，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；觀察組上述指標較對照組改善明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組治療前后療效比較（）

表1 兩組治療前后療效比較（）

注：與同組治療前比較，*表示P＜0.01；與對照組治療后比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

2.2 ESR、CRP、IL-17、IL-10 及TGF-β 水平治療后，兩組ESR、IL-17 水平均明顯降低，IL-10、TGFβ水平均明顯升高，組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；觀察組ESR、IL-17 及CRP 降低較對照組明顯（P＜0.01），IL-10、TGF-β較對照組升高顯著（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組治療前后ESR、CRP、IL-10、IL-17、TGF-β水平比較（）

表2 兩組治療前后ESR、CRP、IL-10、IL-17、TGF-β水平比較（）

注：與同組治療前比較，*表示P＜0.01；△表示與對照組治療后比較，P＜0.05

2.3 Th17、Treg 細胞表達水平治療后，兩組Th17 細胞百分比及Th17/Treg 比值均顯著降低，而Treg 細胞百分比顯著升高，組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。觀察組上述指標較對照組改善顯著（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組治療前后Th17/Treg細胞表達水平比較（）

表3 兩組治療前后Th17/Treg細胞表達水平比較（）

注：與同組治療前比較，*表示P＜0.01；與對照組治療后比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

2.4 Th17、Treg 細胞表達的典型病例觀察組1例患者治療前Th17 在CD4+T 細胞中的含量是18.34%，對照組1例患者治療前Th17在CD4+T細胞中的含量是17.30%，與正常對照者（9.08%）比較均明顯升高，觀察組治療后Th17 在CD4+T 細胞中的含量是13.44%，對照組療后是14.09%，觀察組較對照組治療后Th17細胞降低的更明顯，見圖1。觀察組1 例患者治療前Treg 在CD4+T 細胞中的含量是4.26%，對照組1 例患者治療前Treg 在CD4+T細胞中的含量是4.81%，與正常對照者（12.39%）比較均明顯降低，觀察組治療后Treg 在CD4+T 細胞中的含量是8.37%，對照組療后是6.56%，觀察組較對照組Treg 細胞治療后升高的更明顯。見圖2。

圖1 Th17（CD4+、IL-17+，%）在CD4+T細胞中的表達

圖2 Treg（CD4+、CD25+、Foxp3+，%）在CD4+T細胞中的表達情況

2.5 Treg 細胞Foxp3 及其p-Foxp3 表達的典型病例免疫印跡法顯示，兩組治療前Treg 細胞Foxp3、p-Foxp3 的蛋白表達量與正常對照組比較均降低；兩組治療后Treg 細胞Foxp3、p-Foxp3 的蛋白表達量均較治療前所增高，且觀察組增高更明顯。見圖3。

圖3 患者外周血Treg細胞Foxp3、P-Foxp3的蛋白表達

2.6 安全性評價兩組患者治療前后血、尿常規(guī)，肝腎功能及心電圖無明顯異常改變，治療過程中無不良反應發(fā)生。

3 討論

RA 屬于中醫(yī)“痹證”范疇，多因正氣不足，外邪乘虛而入，致使肌肉、筋骨的氣血運行受阻而致痹?，F(xiàn)代醫(yī)學認為，RA 為自身免疫性疾病，其發(fā)病機制與淋巴細胞免疫失調(diào)及其產(chǎn)生的大量相關炎性細胞因子在患者滑膜組織中浸潤有關［7］，已證實RA 在疾病的進程中Th17 與Treg 細胞呈現(xiàn)失衡狀態(tài)［8］。Th17 細胞是一種能夠在核轉(zhuǎn)錄因子RORγt 調(diào)控下特異分泌IL-17 的CD4+T 細 胞［9］。Th17 細胞通過產(chǎn)生IL-17 來激活巨噬細胞、樹突狀細胞、滑膜細胞等，并分泌基質(zhì)金屬蛋白酶破壞骨和軟骨組織［10-11］。有研究顯示［12］，RA 患者血清及關節(jié)液中IL-17 的表達明顯升高，促進滑膜細胞分泌多種炎性細胞因子，抑制軟骨細胞合成基質(zhì)和膠原，增強破骨細胞活性，引起骨侵蝕。而Treg 是一種具有免疫抑制活性的CD4+T 細胞亞群，Treg 細胞通過釋放細胞因子IL-10 和TGF-β發(fā)揮抑制T 細胞及抗原呈遞細胞的功能，降低炎性細胞因子的產(chǎn)生及抗體分泌而發(fā)揮免疫效應。Foxp3 是Treg 重要轉(zhuǎn)錄因子，其持續(xù)表達是維持Treg 抑制活性的關鍵因素。初始CD4+T 細胞在TGF-β的單獨誘導下，可以分化為Treg 細胞，當IL-6 同時存在時，能夠誘導RORγt 的表達，抑制Treg 細胞產(chǎn)生，促進初始CD4+T 細胞分化成Thl7細胞［13］。本研究顯示RA 患者外周血中Th17 細胞的含量及IL-17 的表達水平明顯升高與疾病活動度正相關，與既往研究［14］一致；而RA 炎癥關節(jié)的細胞因子環(huán)境抑制了Treg的活性，Treg相關細胞因子IL-10和TGF-β相應減少，致使抑制自身免疫反應作用降低，導致炎癥及骨破壞加重［15］。本研究發(fā)現(xiàn)獨活寄生湯聯(lián)合西藥治療后患者循環(huán)血中Th17細胞數(shù)量顯著降低，而Treg細胞數(shù)量及其相關因子IL-10、TGF-β的表達明顯增加，優(yōu)于單純西藥組，且Treg 的轉(zhuǎn)錄因子p-Foxp3 表達較療前增強，說明獨活寄生湯聯(lián)合西藥治療能夠抑制Th17細胞分化，增強Treg的活性，調(diào)節(jié)體內(nèi)Th17/Treg 平衡，調(diào)控炎癥因子的表達，從而調(diào)節(jié)體內(nèi)異常免疫反應。

綜上所述，獨活寄生湯聯(lián)合西藥治療可以改善肝腎不足寒濕痹阻型RA 患者臨床癥狀及控制關節(jié)炎癥，其作用機制是通過下調(diào)Th17 細胞含量，上調(diào)Treg 細胞含量，調(diào)節(jié)Th17/Treg 細胞平衡，抑制炎性因子的釋放，促進體內(nèi)免疫細胞的平衡，從而控制RA的病情惡化。