何旭鑫，次仁卓瑪，史二麗，陳洲斯，楊 洋，吉 拉，巴桑拉姆

（1 承德市疾病預(yù)防控制中心 河北 承德 067000）

（2 阿里疾病預(yù)防控制中心 西藏 阿里 859000）

大腸埃希氏菌又叫大腸桿菌（Escherichia coli），是Escherich 在1885 年人類和動物的腸道里發(fā)現(xiàn)的，其生存條件廣泛。生活在腸道里的大腸埃希氏菌屬于正常寄居性菌群，而且還能合成V i t B 和K 產(chǎn)生大腸菌素，是不可缺少單細胞生物體。當(dāng)機體抵抗力下降或侵入腸外組織或器官時，可作為條件致病菌而引起腸道外的感染[1]。主要表現(xiàn)為人體和多種動物的胃腸道感染、尿路炎癥、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎等多種局部器官組織發(fā)生病變，常見疑似引起發(fā)生食源性食物中毒的食品包括熟肉制品、蛋制品、涼菜、牛乳、蔬菜、水果等，因此加強對大腸埃希氏菌的致病性及檢測方法的研究，加強食品中致瀉性大腸埃希氏的監(jiān)測對食品安全風(fēng)險監(jiān)測及防控具有重要意義。

脈沖場凝膠電泳（PFGE）是一種基于分子水平的分型方法，是一種分離大分子DNA 或者染色體的方法。在普通的凝膠電泳中，大的DNA 分子（＞10kb）移動速度接近，很難分離形成足以區(qū)分的條帶。在脈沖場凝膠電泳中，電場不斷在兩種方向（有一定夾角，而不是相反的兩個方向）變動。DNA 分子帶有負電荷，會朝正極移動。相對較小的分子在電場轉(zhuǎn)換后可以較快轉(zhuǎn)變移動方向，而較大的分子在凝膠中轉(zhuǎn)向較為困難。因此小分子向前移動的速度比大分子快。脈沖場凝膠電泳可以用來分離大小從10 kb 到10 Mb 的DNA 分子。近年來被廣泛應(yīng)用于疾病預(yù)防控制現(xiàn)場流行病學(xué)分析調(diào)查研究[2-3]。PFGE 具有效果性好，敏感力強，被譽為細菌分子生物學(xué)分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，已廣泛應(yīng)用于分子流行病學(xué)研究，用于分析菌株之間的相關(guān)性，協(xié)助追蹤傳染源，在疫情控制方面發(fā)揮著重要的作用。本文主要對近年在食品中分離的致瀉性大腸埃希氏菌進行基因分型和流行病分析。通過對致瀉性大腸埃希氏菌的毒力基因和PFGE 的基因分析，以達到對食品中致瀉性大腸埃希氏菌的流行狀況及傳染源的追蹤進行判斷，對防治和減弱致瀉性大腸埃希菌的爆發(fā)提供有效數(shù)據(jù)。

1.材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1監(jiān)測依據(jù) 根據(jù)《中華人民共和國食品安全法》（以下簡稱《食品安全法》）和《河北省衛(wèi)生部門食品安全風(fēng)險監(jiān)測方案》的要求，掌握我市市售食品中主要污染物及有害因素的污染指標(biāo)和方向，明確導(dǎo)致危害因素的分布和疑似來源，收集和分析主要食源性疾病的發(fā)病及流行趨勢，為開展食品安全風(fēng)險評估和標(biāo)準(zhǔn)制定、修訂及跟蹤評價等工作提供有效保障。發(fā)現(xiàn)食源性疾病安全隱患，及時通報食品安全相關(guān)監(jiān)管部門，采取適當(dāng)?shù)娘L(fēng)險預(yù)警和監(jiān)管嚴(yán)查[4]。

1.1.2 采樣要求 常規(guī)監(jiān)測。以獲得連續(xù)性、代表性數(shù)據(jù)為目的，了解大宗食品中食源性疾病有害因素的污染情況、污染趨勢和地域分布，并為食品安全風(fēng)險評估、標(biāo)準(zhǔn)制定、修訂及跟蹤評價提供數(shù)據(jù)。風(fēng)險監(jiān)測包含食品中重金屬元素、生物毒素、農(nóng)藥殘留等，監(jiān)測產(chǎn)品包含水產(chǎn)及其加工品、蔬菜及其制品、肉與肉制品等。專項監(jiān)測。以發(fā)現(xiàn)食品安全隱患及線索、對發(fā)現(xiàn)的食品安全問題進行溯源為目的，包括兩種類型，一是針對特定食品的探索性、針對性監(jiān)測，對可疑存在的食品安全風(fēng)險問題并給食品安全監(jiān)督管理提供可靠證據(jù)；二是針對生產(chǎn)加工過程的監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)可能存在的污染源，為標(biāo)準(zhǔn)（生產(chǎn)加工規(guī)范）的制定、修訂及跟蹤評價提供數(shù)據(jù)。本市及各縣區(qū)采集本地產(chǎn)樣品的數(shù)量應(yīng)不低于方案任務(wù)量90%，盡可能全包含市售所有定性包裝和散裝食品，優(yōu)先考慮本地生產(chǎn)的品類。要綜合判斷承德市食品生產(chǎn)加工和居民消費等實際原因，規(guī)范合理的研究采樣程序方案，避免集中采樣，樣品采集應(yīng)覆蓋我市八縣三區(qū)超市、市場及鄉(xiāng)村零售店、點，采樣點和采樣時間要保持相對固定。要嚴(yán)格按照監(jiān)測方案開展監(jiān)測，不得擅自變更監(jiān)測食品類別、監(jiān)測時間、采樣地點等，做好質(zhì)量控制，保證監(jiān)測數(shù)據(jù)真實、準(zhǔn)確，按時上報監(jiān)測數(shù)據(jù)。

1.1.3 菌株來源 2018 年3 月—2019 年12 月食品污染物監(jiān)測中分離并保存的19 株致瀉性大腸埃希氏菌株。致瀉性大腸埃希氏菌株由河北省疾控中心細菌病防治與消毒所提供。

1.2 檢驗項目

致瀉性大腸埃希氏菌、五種（EPEC、ETEC、EIEC、EAEC、EHEC）致瀉性大腸埃希氏菌毒力基因檢測、PFGE。

1.2.1 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱、核酸提取儀、ABI7500 熒光定量PCR 儀、電泳儀、凝膠成像儀。

1.2.2 主要試劑 江蘇碩世五種致瀉大腸埃希氏菌反應(yīng)體系試劑盒、血平板、PFGE 專用瓊脂糖（Seakem Gold Agarose）為美國 Lonza 公司產(chǎn)品；細胞懸浮液（CSB）和細胞裂解液（CLB）均為新鮮配制。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)好的細菌包埋于瓊脂塊中，用適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶在原位對整個細菌染色體進行酶切，酶切片段在特定的電泳系統(tǒng)中通過電場方向不斷交替變換及合適的脈沖時間等條件下而得到良好的分離。PFGE 中內(nèi)切酶的選用是非常關(guān)鍵的一步，所采用的內(nèi)切酶常為寡切點酶（low frequency cleavagerestric-tionendoucleases），酶切后的片段少而大，適合于作PFGE 電泳。所試驗的19 個細菌的染色體中，被1 個或多個可識別CTAG 位點的內(nèi)切酶酶切，每100000bps 中不到一次，所產(chǎn)生酶的識別序列分別為：Xba Ⅰ（TCTAGA），Sep Ⅰ（ACTAGT），Avr Ⅱ（CCTAGG）和Nhe Ⅰ（GCTAGC）。同樣地，在許多含G+C<45% 的基因組，CCG 和CGG 更 少。這樣用Sma Ⅰ（CCCGGGG）、R sr Ⅱ（CGGWCGG）、Nae Ⅰ（GCCGGC）和Sac Ⅱ（CCGCGG）進行酶切，產(chǎn)生平均超過100000bps 片段.

1.3.2 毒力基因檢測 依據(jù)江蘇碩世的試劑盒對五種致瀉進行檢測。

1.3.3 PFGE 分型 PFGE 的操作方法按照中國疾病預(yù)防控制中心提供的標(biāo)準(zhǔn)方法進行[8]，PFGE 電泳圖譜用Bio Numerics 進行軟件分析。

2.結(jié)果

2.1 毒力基因結(jié)果

19 株致瀉性大腸埃希氏菌結(jié)果為4 株ETEC、7 株EPEC、8 株EAEC。

2.2 PFGE 結(jié)果

從圖1 中可以看出 CD109、CD113，CD145、CD197，CD042、CD136 等相似數(shù)均＞90%。結(jié)合樣品的采集地點和采集種類分析、以上樣品均為一個品種、來源于一個采集地點。

圖1 PFGE 結(jié)果圖

3.討論與分析

傳統(tǒng)的細菌表型分型易受環(huán)境因素和菌株變異的影響，且實驗室重復(fù)性和靈敏度等指標(biāo)也不能滿足現(xiàn)代疾病預(yù)防控制的要求[5]。隨著分子分型生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PFGE 在菌株鑒定分型、同源性追蹤、傳染病病原溯源及流行病調(diào)查等方面發(fā)揮著越來越重的作用[6]。

本次實驗中19 株致瀉性大腸埃希氏菌，經(jīng)五種致瀉大腸埃希氏菌熒光PCR 檢測，檢驗結(jié)果為4 株ETEC、7株EPEC、8 株EAEC。PFGE 溯源檢測分析CD109、CD113，CD145、CD197，CD042、CD136 等相似數(shù)均＞90%，屬同一克隆體系。結(jié)合食品樣品的采集地點、與采集種類分析。以上樣品均來自同一采集地點和同一品種。說明致瀉性大腸埃希氏菌的優(yōu)勢株已存在于本地區(qū)、在食品加工、銷售、運輸環(huán)節(jié)存在紕漏、使某一地點和相鄰地點的同一品種增加了致瀉性大腸埃希氏菌的感染機會[7]。因此，衛(wèi)生監(jiān)督管理機構(gòu)應(yīng)該注重平時執(zhí)法監(jiān)督、加強對從業(yè)人員的健康宣傳教育、從源頭上減少或杜絕食品安全問題的發(fā)生。通過此項目的開展可以證實PFGE 可實現(xiàn)菌株有效鑒別和溯源、對已檢測出的疫情暴發(fā)原因進行傳染源跟蹤調(diào)查、預(yù)防同源性食源性疾病的再次發(fā)生等工作中具有重要的意義[8]。