張建業(yè)，張衛(wèi)華

(武漢科技大學(xué)附屬漢陽(yáng)醫(yī)院，武漢市漢陽(yáng)醫(yī)院骨一科，湖北 武漢 430000)

骨肉瘤是一種常見(jiàn)于兒童及青少年的惡性腫瘤，其發(fā)病率居小兒骨惡性腫瘤首位[1]。骨肉瘤細(xì)胞來(lái)源于間質(zhì)細(xì)胞，由于腫瘤可直接或間接由軟骨形成腫瘤骨樣組織及骨組織，故骨肉瘤生長(zhǎng)迅速?lài)?yán)重危害患者生活質(zhì)量與生命安全[2]。微小RNA(microRNA，miR)是一類(lèi)長(zhǎng)度約為21nt的小分子RNA，miR是一種內(nèi)源性非編碼RNA分子，但其可通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而參與多個(gè)細(xì)胞生物活動(dòng)過(guò)程[3]。既往研究顯示，miR-96在胃癌[4]、肝癌[5]、宮頸癌[6]等多種惡性腫瘤中呈異常表達(dá)。裸露角質(zhì)蛋白同源物2(naked cuticle homolog 2，NKD2)是Wnt信號(hào)通路的下游靶基因，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)結(jié)腸癌[7]、胃癌[8]細(xì)胞的增殖與侵襲具有調(diào)控作用。但關(guān)于miR-96與NKD2對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖與生長(zhǎng)的影響，及其兩者的相互作用尚不明確。故本研究旨在探究miR-96通過(guò)NKD2的表達(dá)對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞株的增殖、凋亡的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析我院2013年9月至2018年2月收集的骨肉瘤標(biāo)本57例臨床資料作為研究組，同時(shí)收集距腫瘤邊界5cm的癌旁組織作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理學(xué)檢查確診為骨肉瘤；(2)本次治療前未接受放療、化療及其他系統(tǒng)抗癌治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)合并糖尿病、高血壓等全身性疾病；(3)心、肝、腎等重要臟器存在嚴(yán)重功能障礙。其中男性39例，女性18例；年齡21～49歲，平均年齡(28.16±6.73)歲。世界衛(wèi)生組織(world health organization，WHO)標(biāo)準(zhǔn)分型：小圓細(xì)胞型2例，軟骨母細(xì)胞型6例，血管擴(kuò)張型4例，纖維母細(xì)胞型5例，骨母細(xì)胞型40例。本研究符合本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要儀器與試劑 人正常成骨細(xì)胞系hF0B1.19和人骨肉瘤MG63細(xì)胞株：購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程有限公司。恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：DHP-9012)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)儀(上海宏石醫(yī)療科技有限公司，型號(hào)：SLAN-96P)；流式細(xì)胞儀(德國(guó)貝克曼庫(kù)爾特，型號(hào)：FC500)；組織裂解液、細(xì)胞裂解液(上海信裕生物科技有限公司)；Trizol試劑盒(上海名勁生物科技有限公司)；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)高糖細(xì)胞(上海冠導(dǎo)生物工程有限公司)；miR-96抑制劑(武漢博歐特生物科技有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(焦作路非凡生物科技有限公司)；兔抗人NKD2單克隆抗體、羊抗兔IgG(北京紐樸生物技術(shù)有限公司)；四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyltetrazolium assay，MTT)(上海恪敏生物科技有限公司)；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司)；超敏電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)試劑盒(上海羽朵生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)及miR-96表達(dá)檢測(cè) 正常成骨細(xì)胞系hF0B1.19培養(yǎng)在10%胎牛血清DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為：34 ℃、5% CO2；骨肉瘤細(xì)胞MG-63培養(yǎng)在10%胎牛血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37 ℃，5% CO2；轉(zhuǎn)染前一天進(jìn)行細(xì)胞在培養(yǎng)板中接種，保證次日轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。次日取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨肉瘤細(xì)胞MG-63與正常成骨細(xì)胞系hF0B1.19，根據(jù)說(shuō)明書(shū)采用TRIzol試劑提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳法評(píng)估RNA的完整性，把總RNA根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，參照RT-qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用RT-qPCR儀進(jìn)行定量檢測(cè)。引物序列：miR-96正向5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，反向5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。NKD2正向5'-GACTTTGGACCATGAAGACCAG-3'，反向5'-GCCCAGACGGAAGTTTCTTATT-3'。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，60 ℃退火34 s，共40個(gè)循環(huán)，采用U6作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-96的相關(guān)表達(dá)量。

1.3.2 細(xì)胞分組 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期骨肉瘤細(xì)胞MG-63，分為miR-96抑制組及空白對(duì)照組，應(yīng)用LipofectaminTM2000說(shuō)明書(shū)操作分別進(jìn)行miR-96抑制組及空白對(duì)照組轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后分別采用RT-qPCR法與Western blot法檢測(cè)各組人骨肉瘤MG63細(xì)胞中miR-96與NKD2蛋白表達(dá)水平；采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況與細(xì)胞周期分布情況。

1.3.3 Western blot法檢測(cè)蛋白miR-96與NKD2表達(dá) 將組織與細(xì)胞充分裂解，離心后取上清液，提取其中總蛋白?？偟鞍字屑尤肷蠘泳彌_液后進(jìn)行沸水浴10 min使蛋白充分變性，此后依次經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜、封閉、兔抗人NKD2單克隆抗體(貨號(hào)：AR1017)孵育、二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(貨號(hào)：BA1054)孵育，采用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行蛋白檢測(cè)，用凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.4 觀察指標(biāo) 骨肉瘤組織中miR-96與NKD2蛋白的表達(dá)情況；各組骨肉瘤細(xì)胞中miR-96與NKD2的表達(dá)情況；各組骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡與細(xì)胞周期變化情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0數(shù)據(jù)軟件對(duì)本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。其中計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 骨肉瘤組織與癌旁組織中miR-96與NKD2蛋白的表達(dá)情況比較 RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，骨肉瘤組織中miR-96表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Western blot結(jié)果顯示，骨肉瘤組織中NKD2蛋白表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖1)。

注：與癌旁組織比較*P<0.05

注：與空白對(duì)照組比較*P<0.05

圖3 兩組骨肉瘤細(xì)胞中NKD2的表達(dá)情況

2.2 骨肉瘤細(xì)胞中miR-96與NKD2的表達(dá)情況比較 miR-96抑制組骨肉瘤細(xì)胞中miR-96表達(dá)水平明顯低于空白對(duì)照組，比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；miR-96抑制組骨肉瘤細(xì)胞中NKD2表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖2～3)。

2.3 骨肉瘤細(xì)胞增殖情況比較 MTT比色檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-96抑制組骨肉瘤MG63細(xì)胞株經(jīng)miR-96抑制劑轉(zhuǎn)染48 h后，細(xì)胞相對(duì)吸光度(109.13±21.06)nm，未經(jīng)miR-96抑制劑轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組細(xì)胞相對(duì)吸光度(172.50±18.33)nm，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖4)。

注：與空白對(duì)照組比較*P<0.05

2.4 骨肉瘤細(xì)胞的凋亡情況比較 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-96抑制組細(xì)胞凋亡率為(23.54±3.09)%，空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(1.79±0.62)%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖5)。

注：與空白對(duì)照組比較*P<0.05

2.5 骨肉瘤細(xì)胞周期變化情況比較 miR-96抑制組MG63細(xì)胞株處于G0/G1、S、G2/M期的細(xì)胞分別占比62.41%、33.47%、3.64%，空白對(duì)照組MG63細(xì)胞株處于G0/G1、S、G2/M期的細(xì)胞分別占比47.39%、25.18%、27.62%，兩組骨肉瘤MG63細(xì)胞株細(xì)胞周期情況比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

骨肉瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性骨惡性腫瘤之一[1]。由于腫瘤組織的浸蝕與骨皮質(zhì)溶解，腫瘤部位疼痛成為骨肉瘤患者最常見(jiàn)的癥狀。此外，患者還伴有腫瘤部位腫脹、疼痛性跛行及發(fā)熱、體重下降、貧血等全身癥狀。骨肉瘤惡性程度高，預(yù)后極差，故而探究骨肉瘤的發(fā)病進(jìn)程，找尋有效地治療方法是臨床亟需解決的問(wèn)題。

近年來(lái)，miRNA在腫瘤中的表達(dá)及作用逐漸受到重視。研究報(bào)道，腫瘤組織與四周正常癌旁組織中對(duì)比有較多miRNA異常表達(dá)，而異常表達(dá)的miRNA可介導(dǎo)不同抑制癌及癌癥基因的表達(dá)，使細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)通路或相關(guān)蛋白表達(dá)改變，從而發(fā)生抑癌或誘發(fā)癌癥進(jìn)展，但具體作用仍在進(jìn)一步研究中[9]。miR作為一類(lèi)基因調(diào)控因子，可靶向一個(gè)或多個(gè)mRNA，通過(guò)抑制或斷裂靶標(biāo)mRNAs而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡與血管形成[10]。趙洪煥等[11]研究證明，miR可作為原癌基因或抑癌基因，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移、侵襲過(guò)程中發(fā)揮重要作用，為腫瘤的靶向治療提供了新方向。趙新陽(yáng)等[12]研究表明，miR-96在肝癌細(xì)胞表面呈高表達(dá)，且可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移與侵襲。Rapti等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR-96在大腸癌中呈高表達(dá)，且高水平的miR-96提示患者預(yù)后不良。本研究結(jié)果顯示，骨肉瘤組織中miR-96表達(dá)水平明顯高于正常骨組織，提示miR-96在骨肉瘤組織中呈高表達(dá)。這與趙新陽(yáng)[12]、Rapti等[13]的研究結(jié)果一致。Wnt信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、器官形成、組織再生過(guò)程中具有重要作用，同時(shí)與多種惡性腫瘤的形成、發(fā)展有密切聯(lián)系[14]。NKD2是Wnt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子[15]。Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，NIKD2在肝癌中呈低表達(dá)，NKD2表達(dá)缺失導(dǎo)致肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)加速。本研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織中NKD2表達(dá)水平明顯低于正常骨組織，提示NKD2在骨肉瘤中呈低表達(dá)。

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-96抑制組骨肉瘤細(xì)胞中miR-96表達(dá)水平明顯低于空白對(duì)照組，且miR-96抑制組骨肉瘤細(xì)胞中NKD2表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組，提示miR-96對(duì)NKD2的表達(dá)具有調(diào)控作用。細(xì)胞吸光度是指光線通過(guò)細(xì)胞前的入射強(qiáng)度與通過(guò)細(xì)胞后的透射光強(qiáng)比值，吸光度法是常用的細(xì)胞數(shù)量測(cè)量方法[17]。miR-96抑制組骨肉瘤MG63細(xì)胞株經(jīng)miR-96抑制劑轉(zhuǎn)染48h后，細(xì)胞相對(duì)吸光度明顯低于空白對(duì)照組，miR-96抑制組骨肉瘤MG63細(xì)胞株細(xì)胞凋亡率明顯大于空白對(duì)照組，提示miR-96可促進(jìn)人骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制其凋亡。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-96抑制組G0/G1期細(xì)胞率較空白對(duì)照組骨肉瘤MG63細(xì)胞株增加，但G2/M期細(xì)胞率較空白對(duì)照組減小。G0/G1期細(xì)胞停止細(xì)胞分裂，G2/M期細(xì)胞有絲分裂旺盛[18]。這進(jìn)一步提示miR-96可增加骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖活性。

綜上所述，miR-96在骨肉瘤組織中呈高表達(dá)，NKD2呈低表達(dá)；miR-96通過(guò)促進(jìn)NKD2表達(dá)而促進(jìn)骨肉瘤MG63細(xì)胞株早期凋亡；抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞株生長(zhǎng)；但關(guān)于NKD2是否成為骨肉瘤基因指標(biāo)的潛在靶點(diǎn)還應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步研究確認(rèn)。