張宗煜

(1. 天津市工業(yè)微生物研究所有限公司 天津 300462；2. 天津?qū)嵃l(fā)中科百奧工業(yè)生物技術(shù)有限公司 天津 300462；3. 天津市工業(yè)微生物工程技術(shù)中心 天津 300462；4. 天津市工業(yè)微生物企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 300462；5. 天津量信檢驗(yàn)認(rèn)證技術(shù)有限公司 天津 300462)

1 反應(yīng)歷程的探究

1.1 異常情況的發(fā)現(xiàn)

在實(shí)驗(yàn)室中，測(cè)定粗多糖含量采用的是NY/T 1676—2008的苯酚-硫酸法。該方法的原理：多糖在濃硫酸作用下，先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛(糠醛)衍生物，與苯酚反應(yīng)生成橙黃色溶液，在490 nm處有特征吸收，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量[1]。在實(shí)際工作中，偶爾出現(xiàn)過一些異常情況，如：同一個(gè)樣品測(cè)定的2個(gè)結(jié)果不平行，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2偏低等。分析了這些問題產(chǎn)生的可能原因，為了驗(yàn)證這些想法是否正確，并探究這個(gè)反應(yīng)的歷程，設(shè)計(jì)了一些試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)藥品與儀器

試驗(yàn)藥品：葡萄糖(分析純)，天津市江天化工技術(shù)有限公司；苯酚(分析純)，東方化工廠；濃硫酸(分析純)，利安隆博華(天津)醫(yī)藥化學(xué)有限公司；蒸餾水，自制。

試驗(yàn)儀器：U-3010紫外可見分光光度計(jì)，日本日立公司。

1.3 試驗(yàn)部分

將葡萄糖用蒸餾水配制成0.1 g/L水溶液、苯酚用蒸餾水配制成5%水溶液，加入的各種物料的體積：1 mL 0.1 g/L葡萄糖水溶液，1 mL 5%苯酚水溶液，5 mL濃硫酸，比色以蒸餾水為空白。表1中試驗(yàn)序號(hào)1～4均是加完前2種物質(zhì)并混勻后，放置24 h再加入第3種物質(zhì)，其余試驗(yàn)則是加完前兩種物質(zhì)并混勻后，立刻加入第3種物質(zhì)。所有物質(zhì)都加完后靜置10 min，使用渦旋震蕩器使反應(yīng)液充分混合，然后“室溫”反應(yīng)20 min，490 nm測(cè)吸光度(表1)。

表1 反應(yīng)歷程探究試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Test results of reaction process

1.4 試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)試驗(yàn)1～8，可以分析出該反應(yīng)可能的歷程(圖1)：葡萄糖在濃硫酸作用下脫水，生成5-羥甲基糠醛，該過程比較緩慢，5-羥甲基糠醛再與苯酚反應(yīng)，其產(chǎn)物在490 nm處有吸收。

圖1 葡萄糖與濃硫酸、苯酚的可能反應(yīng)歷程Fig.1 Possible reaction process of glucose with concentrated sulfuric acid and phenol

可能發(fā)生的副反應(yīng)：苯酚與濃硫酸發(fā)生磺化反應(yīng)，該反應(yīng)很快。其產(chǎn)物或者是不與葡萄糖及5-羥甲基糠醛反應(yīng)，或者是與葡萄糖或5-羥甲基糠醛中的1種或2種物質(zhì)有反應(yīng)，但其產(chǎn)物在490 nm處吸光度較低。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2]，苯酚類化合物與濃硫酸的摩爾比在1∶1.1時(shí)，苯酚類化合物在25℃即可被硫酸磺化，標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1676—2008中，苯酚與濃硫酸的摩爾比大約是1∶173，且濃硫酸加入到苯酚水溶液的一瞬間，溫度遠(yuǎn)高于25℃，因此苯酚水溶液與濃硫酸混合后，溶液中的苯酚會(huì)有一部分甚至全部被磺化，而且由于濃硫酸比例過高，甚至可能苯環(huán)上會(huì)有多個(gè)磺酸基(實(shí)際可能是苯環(huán)上磺酸基數(shù)量不同，取代位置不同的多種化合物的混合物)。當(dāng)苯酚被磺化后，反應(yīng)活性降低[3]，且磺酸基越多，活性越低。因此苯酚磺酸與葡萄糖和5-羥甲基糠醛可能幾乎不發(fā)生反應(yīng)。即使由于溫度較高，使苯酚磺酸與葡萄糖或5-羥甲基糠醛發(fā)生了反應(yīng)，由于磺酸基團(tuán)中的硫氧雙鍵(O＝S＝O)與苯環(huán)共軛，也會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，因而在490 nm處吸收較低或幾乎沒有吸收。

有文獻(xiàn)報(bào)道磺酸基是非典型生色團(tuán)[4-5]?；衔镏杏谢撬峄鶎?duì)最大吸收波長(zhǎng)的影響在文獻(xiàn)中也有報(bào)道[6]：對(duì)苯二酚(1，4-苯二酚，CAS：123-31-9)在289 nm處有最大吸收，羥苯磺酸(2，5-二羥基苯磺酸，CAS：88-46-0)在301 nm處有最大吸收(見圖2)。

圖2 對(duì)苯二酚、羥苯磺酸的最大吸收Fig.2 Maximum absorption of hydroquinone and dobesilic acid

根據(jù)試驗(yàn)10～12可以得到的結(jié)論：在檢測(cè)過程中，標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液、苯酚溶液、濃硫酸如有少量濺到試管壁上，對(duì)比色結(jié)果幾乎無影響。在試驗(yàn)5和9～12中造成吸光度微小差別的原因，一是儀器的誤差，二是在移取濃硫酸時(shí)，由于濃硫酸密度和黏度均較大，導(dǎo)致加入到反應(yīng)體系中的濃硫酸不是5 mL，而是略有偏差，使得反應(yīng)體系的體積不完全一致，產(chǎn)物的濃度因此不完全一致。

2 異常情況原因探析

2.1 模擬試驗(yàn)

為了模擬實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)樣品較多，苯酚、濃硫酸不能及時(shí)加入，以及不能及時(shí)比色等情況，并參考標(biāo)準(zhǔn)QB/T 5176—2017[7]、GB/T 18672—2014[8]的反應(yīng)條件，設(shè)計(jì)了4個(gè)試驗(yàn)，比色均以蒸餾水為空白。

①向試管中加入1 mL 0.1 g/L葡萄糖水溶液、1 mL 5%苯酚、5 mL濃硫酸，靜置10 min，使用渦旋震蕩器使反應(yīng)液充分混合，然后“室溫”反應(yīng)20 min，于490 nm處測(cè)吸光度＝0.758。

②向試管中加入1 mL 0.1 g/L葡萄糖水溶液，1 h后加入1 mL 5%苯酚，1 h后加入5 mL濃硫酸，靜置10 min，使用渦旋震蕩器使反應(yīng)液充分混合，然后“室溫”反應(yīng)1 h，于490 nm處測(cè)吸光度＝0.826。

③向試管中加入1 mL 0.1 g/L葡萄糖水溶液、1 mL 5%苯酚、5 mL濃硫酸，靜置5 min，沸水浴加熱15 min，冷卻至室溫，于490 nm處測(cè)吸光度＝0.678。

④向試管中加入1 mL 0.1 g/L葡萄糖水溶液，1 h后加入1 mL 5%苯酚，1 h后加入5 mL濃硫酸，靜置1 h，沸水浴加熱15 min，冷卻至室溫，1 h后，于490 nm處測(cè)吸光度＝0.739。

2.2 討論分析

通過以上4個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果可以看出，在反應(yīng)溫度相同的情況下，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度在升高。在加入1 mL 0.1 g/L葡萄糖溶液、1 mL 5%苯酚溶液、5 mL濃硫酸后，迅速檢測(cè)反應(yīng)體系的溫度，大約是113℃，因此沸水浴(100℃)相當(dāng)于給反應(yīng)體系降溫，這也就解釋了相同反應(yīng)時(shí)間，“室溫”反應(yīng)的吸光度大于沸水浴反應(yīng)的吸光度這個(gè)現(xiàn)象。

實(shí)驗(yàn)室被檢測(cè)的樣品一般是經(jīng)過復(fù)雜的生物反應(yīng)得到的，其中的多糖在濃硫酸作用下水解后可能會(huì)產(chǎn)生多種戊糖或己糖，根據(jù)文獻(xiàn)，己糖、己糖醛酸及其衍生物和苯酚、濃硫酸反應(yīng)的產(chǎn)物在490 nm有吸收，戊糖及其衍生物和苯酚、濃硫酸反應(yīng)的產(chǎn)物在475 nm有吸收[9](圖3)。因?qū)嶒?yàn)室沒有戊糖及其衍生物的標(biāo)準(zhǔn)品，就未進(jìn)行相關(guān)反應(yīng)及475 nm比色研究。

圖3 戊糖與濃硫酸、苯酚的反應(yīng)Fig. 3 Reaction of pentose with concentrated sulfuric acid and phenol

在檢測(cè)過程中，當(dāng)樣品量較多時(shí)，會(huì)出現(xiàn)苯酚、濃硫酸不能及時(shí)加入，以及不能及時(shí)比色等情況。在用少量待測(cè)液體置換比色皿中原有液體時(shí)，偶爾會(huì)有待測(cè)液體流到比色皿外壁，因其中有硫酸，將比色皿外壁徹底擦干凈也比較耗時(shí)。在這個(gè)過程中，未檢測(cè)的樣品中仍然在發(fā)生反應(yīng)。另外，標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1676—2008中多糖的提取是在沸水條件下，也有文獻(xiàn)說，某些糖在煮沸情況下會(huì)發(fā)生分解[10]。這些都能解釋偶爾出現(xiàn)的同一個(gè)樣品測(cè)定的2個(gè)結(jié)果不平行，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2偏低等現(xiàn)象。

對(duì)于產(chǎn)生上述現(xiàn)象的原因，我們也進(jìn)行了分析。因?yàn)樵摲磻?yīng)有3步：多糖在濃硫酸條件下水解成己糖；己糖在濃硫酸條件下脫水生成5-羥甲基糠醛；5-羥甲基糠醛在濃硫酸條件下和苯酚反應(yīng)。

對(duì)于第一步反應(yīng)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1676—2008[1]、SN/T 4260—2015[11]、QB/T 5176—2017[1]、GB/T 18672—2014[8]中的描述，算出了硫酸在反應(yīng)體系中的濃度為60%或70%。根據(jù)文獻(xiàn)的研究[12]，在60%或70%的濃硫酸中，60℃反應(yīng)條件下糖的收率最高，但反應(yīng)體系的溫度大約為110℃，該文獻(xiàn)指出，在100℃時(shí)會(huì)有副反應(yīng)，導(dǎo)致糖的收率降低。也有文獻(xiàn)研究指出了高溫下糖收率降低的原因[13]，是小分子糖在強(qiáng)酸性體系中會(huì)轉(zhuǎn)化為糠醛及其他副產(chǎn)物，因糠醛是第二步產(chǎn)物，就直接查找了用多糖合成糠醛的文獻(xiàn)。

有文獻(xiàn)對(duì)用農(nóng)作物秸稈或纖維素(其中含有五碳單糖及六碳單糖縮合而成的多糖)或單糖合成糠醛、5-羥甲基糠醛(統(tǒng)稱糠醛衍生物)的反應(yīng)進(jìn)行了相關(guān)研究[14-22]，所報(bào)道的很多反應(yīng)條件都是在高溫(120℃甚至更高)，或高壓，或有催化劑存在的條件下，反應(yīng)若干小時(shí)，還存在著一些副反應(yīng)?？梢婋S著反應(yīng)條件的變化，糠醛衍生物的收率及糖發(fā)生副反應(yīng)的比例也在變化。

對(duì)于第三步反應(yīng)，考慮到在濃硫酸存在條件下，戊糖生成的糠醛和己糖生成的5-羥甲基糠醛都有醛基(—CHO)，查閱了涉及苯酚和醛基反應(yīng)的幾篇文獻(xiàn)，表明苯酚和醛在酸性條件下會(huì)形成不溶于水的聚合物[23-25]，苯酚和醛在堿性條件下會(huì)形成小分子化合物[26-29]，均與標(biāo)準(zhǔn)中的現(xiàn)象不一樣。而在教材和文獻(xiàn)中均未找到苯酚和呋喃反應(yīng)的條件，于是查找了苯酚與羥甲基(—CH2OH)，即醇類反應(yīng)的文獻(xiàn)[30-32]，均需要加入固體酸催化劑反應(yīng)若干小時(shí)，而且有時(shí)在醇過量的情況下，也不能保證所有的苯酚都能發(fā)生反應(yīng)。鑒于標(biāo)準(zhǔn)中是苯酚過量，而且沒有固體酸催化劑，根據(jù)文獻(xiàn)可以推測(cè)，苯酚過量的情況下，同樣不能保證所有的5-羥甲基糠醛都發(fā)生反應(yīng)。

在前面提到的用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖的標(biāo)準(zhǔn)中，反應(yīng)條件是“室溫”(實(shí)際體系溫度＞100℃)放置5 min或10 min，再在30℃常壓反應(yīng)20 min，或在100℃常壓反應(yīng)15 min。由于反應(yīng)時(shí)間比文獻(xiàn)短，反應(yīng)溫度比文獻(xiàn)低，而且沒有加入任何催化劑，在這種反應(yīng)條件下，肯定沒有將所有的多糖都轉(zhuǎn)化為5-羥甲基糠醛，也無法確定有多少多糖發(fā)生副反應(yīng)，同時(shí)無法確定與苯酚發(fā)生反應(yīng)的5-羥甲基糠醛有多少。根據(jù)前文對(duì)反應(yīng)歷程的研究，在苯酚、葡萄糖的混合溶液中加入濃硫酸時(shí)，很難確定被磺化的苯酚與脫水生成5-羥甲基糠醛的葡萄糖的比例。當(dāng)樣品過多時(shí)，由于樣品及標(biāo)準(zhǔn)曲線在高于100℃時(shí)(即“室溫”放置)的反應(yīng)時(shí)間不一樣，在保溫反應(yīng)后比色時(shí)，繼續(xù)反應(yīng)的時(shí)間也不一樣，在這種情況下，同一個(gè)樣品生成的糠醛有可能不平行，不同反應(yīng)體系中苯酚被磺化的比例可能不一樣。這可能是導(dǎo)致最終產(chǎn)品的含量，即檢測(cè)結(jié)果不平行的原因之一。

此外，文獻(xiàn)中也提到[12]，多糖在濃硫酸中水解成單糖的過程中可能會(huì)發(fā)生局部碳化。一般在有機(jī)合成中要保持良好的攪拌，而在檢測(cè)多糖的加料過程的瞬間，物料很難做到混合均勻，這就加大了局部碳化的可能性。也偶爾發(fā)現(xiàn)在加入濃硫酸的瞬間，溶液中局部顏色明顯變深的現(xiàn)象，這可能就是文獻(xiàn)中說的局部碳化。遇到這種情況時(shí)，會(huì)將該樣品重新取樣，加苯酚、硫酸。當(dāng)同一個(gè)樣品的平行樣中只有1個(gè)發(fā)生局部碳化，或者2個(gè)局部碳化的程度不一樣，而且現(xiàn)象不是很明顯時(shí)，檢測(cè)結(jié)果不平行就屬于“正?，F(xiàn)象”了。為了排除平行樣前處理操作過程、取樣不均等帶來的誤差，曾經(jīng)嘗試過將定容后的粗多糖待測(cè)液取2～3份，分別與苯酚硫酸反應(yīng)，出現(xiàn)過吸光度差別較大的情況。我們認(rèn)為這也可以用上述理論解釋。造成表1中試驗(yàn)5和9～12中吸光度微小差別的原因，除了本文第一部分提到的操作誤差外，也可以用文獻(xiàn)中的理論解釋。

在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，NY/T 1676—2008、SN/T 4260—2015是將不同濃度的1 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，1 mL 5%苯酚、5 mL濃硫酸混合后比色；QB/T 5176—2017、GB/T 18672—2014則是將不同濃度的2 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，1 mL 5%苯酚、5 mL濃硫酸混合后比色。因不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的密度不一樣，導(dǎo)致溶液之間的分子間隙、分子間作用力等不同，從而混合后體積可能會(huì)有所不同，這也可能是造成標(biāo)準(zhǔn)曲線R2偏低的原因之一。

3 操作中斷對(duì)樣品檢測(cè)結(jié)果的影響

當(dāng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的樣品較多時(shí)，會(huì)出現(xiàn)操作中斷的情況。為了驗(yàn)證這種情況對(duì)樣品檢測(cè)結(jié)果是否有影響，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)出現(xiàn)的操作中斷的階段，用同一個(gè)樣品做了3個(gè)試驗(yàn)，按照NY/T 1676—2008測(cè)定其粗多糖含量：

①前處理當(dāng)天比色，結(jié)果為6.35%；

②前處理當(dāng)天過濾，第二天定容、反應(yīng)、比色，結(jié)果為5.61%；③前處理第二天過濾、定容、反應(yīng)、比色，結(jié)果為5.38%。

根據(jù)以上檢測(cè)結(jié)果可以看出，操作中斷會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)出的粗多糖含量下降。因此在實(shí)際工作中，檢測(cè)人員應(yīng)該合理安排時(shí)間，以便從樣品前處理到比色在一天內(nèi)完成，這樣才能使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。

4 結(jié)論與展望

多糖是由若干個(gè)相同或不同種類的單糖縮合而成的，在形成多糖的過程中，由于單糖的種類、個(gè)數(shù)、連接方式等的區(qū)別，導(dǎo)致多糖的種類多至無法計(jì)算，如采用液相法或氣相法測(cè)定粗多糖含量，需要有對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，因此不可能采用液相法或氣相法測(cè)定其含量。在介紹糖類化合物性質(zhì)的書中，既沒有找到能讓所有類型多糖在短時(shí)間內(nèi)完全水解成單糖的試劑，也沒有找到能讓所有類型的單糖在短時(shí)間內(nèi)定量轉(zhuǎn)化為某一種化合物的試劑(單糖可以與高碘酸發(fā)生定量反應(yīng)生成醛及酸，但在該反應(yīng)中，每摩爾單糖消耗高碘酸的摩爾數(shù)，及生成醛、酸的摩爾數(shù)與單糖的碳數(shù)、結(jié)構(gòu)有關(guān)[33]，同樣難于通過滴定等方法確定混合單糖的量)。因此，將多糖水解、衍生后用比色法測(cè)定含量時(shí)，一旦樣品量較多，由于衍生試劑加入不及時(shí)、物料混合不均勻、比色不及時(shí)等原因，標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)結(jié)果就可能出現(xiàn)異常，這些原因也有可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。

在本文提到的4個(gè)粗多糖檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中，樣品前處理方式均不相同，見表2。

表2 不同標(biāo)準(zhǔn)中的樣品前處理方式Tab.2 Sample pretreatment methods in different standards

預(yù)嘗試不同的前處理方式對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的影響，通過本文中的試驗(yàn)和查找到的文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)其中涉及到的化學(xué)反應(yīng)較復(fù)雜，且難以解決，就沒有進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。

如何準(zhǔn)確地測(cè)定樣品中的粗多糖含量，仍然是需要標(biāo)準(zhǔn)制定者和相關(guān)領(lǐng)域人員研究的課題?！?/p>